CC BY
6
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XVII, № 2, 2021
реляция между степенью тяжести и летальности пациентов COVID-19 и биохимическими маркерами (уровнем СРБ, ИЛ-6 и др.). Проведен анализ не только мутаций, которые могут влиять на вирулентность и тяжесть заболевания путем изменения структуры белка короновируса, но и на общее количество несинонимичных SNP в ключевых генах короновируса (S-белка, РНК-полимеразы, геликазы). Обнаружено, что среднее (11-12) количество SNP в геноме COVlD-19 положительно коррелирует с одышкой (p=0,016), сахарным диабетом (p=0,016), показателем тяжести заболевания по шкале компьютерной томографии (КТ 1-4, p=0,01) и уровнем Д-димера (p=0,o01). Среднее количество мутаций в S-белке коррелирует с уровнем ферритина (p=0,01). В результате проведенных полногеномного поиска ассоциаций (GWAS) и анализа ассоциаций редких вариантов (RVAS) с использованием библиотеки Hail для Python и скриптов собственной разработки были обнаружены сигналы ассоциации с уровнями Д-димера и ферритина и уровнем ИЛ-6. В случае
ИЛ-6 ассоциированные локусы могут иметь связь с компонентами внеклеточного матрикса и метаболическим путем через рецептор ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ2). При анализе суммарной частоты встречаемости редких вариантов на уровне целых генов была обнаружена ассоциация миссенс-вариантов в гене бифункциональной 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфатсинтетазы-2 (PAPSS2) с низким уровнем лимфоцитов. Также был обнаружен сигнал ассоциации гена интегрина аМ (ITGAM) с тяжестью течения, количеством СРБ и «цитокиновым штормом».
Выводы. Полученные результаты позволяют предположить наличие генетических факторов риска в геноме человека, определяющих тяжесть течения и исход заболевания. Эти данные, наряду с информацией о структуре генома вируса и лабораторными исследованиями будут способствовать дифференциальной диагностике пациентов по степени тяжести, прогнозу и персонализации терапии, что позволит проводить более эффективное лечение пациентов с COVID-19.
Т.Ю. Грачева, М.В. Латыпова, А.А. Хабибуллина, И.А. Петрова, Д.С. Ильясова, Е.С. Рябикова, Т.Л. Гиндина
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СЛОЖНЫХ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ У БОЛЬНЫХ ОМЛ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА FISH
«Научно-исследовательский институт детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой»
Федерального Государственного Бюджетного Образовательного Учреждения высшего профессионального образования «Первый Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Санкт-Петербург
Введение. Диагностика хромосомных аномалий с использованием стандартного кариотипирования, в частности, GTG-окрашивания, часто не позволяет идентифицировать скрытые транслокации, несбалансированные обмены, маркерные хромосомы, а также хромосомный состав при сложных хромосомных аберрациях (СХА) с тремя и более перестройками. В настоящее время в арсенале цитогенетиков имеется многоцветная флуоресцентная in situ гибридизация (M-FISH), молекулярно-цитогенетическая техника, позволяющая обойти ограничения стандартного кариотипирования благодаря индивидуальному окрашиванию флуорохромами каждой пары хромосом.
Цель. Используя стандартное кариотипирование и M-FISH, изучить структуру хромосомных аберраций в сложных кариотипах (СК) у больных острым миелоидным лейкозом (ОМЛ).
Материалы и методы. В исследование включены 22 пациента с ОМЛ, находящимися под наблюдением в клинике НИИ ДОГиТ им Р.М. Горбачевой с 2010 по 2019 год, у которых с помощью кариотипирования костного мозга выявлены СХА. Среди пациентов было 14 (64 %) мужчин и 8 (36 %) женщин с медианой возраста 43 года (диапазон 3 месяца - 71 год), 17 (73 %) пациентов - с первичным ОМЛ, 5 (23 %) - со вторичным оМл (из МДС). У 6 (27 %) пациентов СК наблюдался в дебюте заболевания, у 16 (73 %) - в рецидивах ОМЛ. Всем пациентам проведена M-FISH, при необходимости до-
полненная интерфазной FISH с локус-специфичными ДНК-зондами к генам ТР53, KMT2A, c-MYC и локусам делеций 5q.
Результаты. Комбинация стандартного кариотипирова-ния и M-FISH позволила точно идентифицировать все комплексные хромосомные обмены, при этом во всех наблюдениях результаты кариотипирования были исправлены и дополнены данными FISH анализа. В СХА участвовали все пары хромосом, а наиболее часто участниками были хромосомы 8 (n=15, 68 %), 5 (n=13, 59 %), 7 (n=12, 54 %), 3 (n=11, 50 %), 11 (n=11, 50 %), 17 (n=10, 45 %). Несбалансированные транслокации были наиболее частой находкой и наблюдались у 20 (91%) пациентов. Реципрокные транслокации встречались реже и были зарегистрированы у 7 (32%) пациентов. В 9 (41 %) наблюдениях были выявлены маркерные хромосомы, определенные с помощью М-FISH как производные, состоящие от 3 до 5 сегментов разных хромосом. В таких производных чаще определялись хромосомы 5, 7, 13, 17, 21, маскирующиеся под «псевдомоносомии». Амплификации генов KMT2A и c-MYC были выявлены каждая у одного пациента.
Выводы. Исследование обнаружило цитогенетическую гетерогенность СХА у пациентов с ОМЛ, где несбалансированные обмены хромосом играют центральную роль. Комбинация стандартного кариотипирования и FISH позволяет точно определить хромосомные аберрации для определения прогноза и молекулярные мишени для последующего определения минимальной остаточной болезни при ОМЛ.
М.А. Гурьянова, О.А. Шухов, Н.М. Капранов, Ю.О. Давыдова, К.А. Никифорова, А.О. Абдуллаев, А.Б. Судариков, Е.Ю. Челышева, А.В. Быкова, А.Н. Петрова, И.С. Немченко, И.В. Гальцева, А.Г. Туркина
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ CD26+ ЛЕЙКОЗНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОИДНЫМ ЛЕЙКОЗОМ
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава Российской Федерации, г.Москва
Введение. Лейкозные стволовые клетки (ЛСК) при хроническом миелолейкозе (ХМЛ) находятся в CD34+CD38-фракции лейкозного клона. Н.Неггтапп и соавт. (2014 г.)
было обнаружено что у 100% пациентов с ХМЛ на ЛСК в периферической крови (ПК) и в костном мозге (КМ) отмечалась экспрессия CD26, которая не выявлялась на нормаль-
МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ
ных ГСК и на ЛСК при других миелопролиферативных заболеваниях (МПЗ). M.Bocchia и соавт. (2020 г.) было выявлено, что у 70% пациентов с ХМЛ CD26+ ЛСК обнаруживаются и на фоне терапии ИТК, как в ПК, так и в КМ, вне зависимости от продолжительности лечения и глубины молекулярного ответа (МО).
Цель. Оценить концентрацию CD26+ ЛСК в ПК и в КМ у пациентов в дебюте ХМЛ, на ранних этапах терапии ИТК и у пациентов с глубоким МО.
Материалы и методы. Выявление CD26+ ЛСК в ПК и в КМ осуществлялось при помощи наборов моноклональных антител анти^26-РЕ, CD45-APC-Cy7, CD34-APC и CD38-FITC. Анализ проводился на проточном цитометре CytoFlex (Beckman Coulter). С августа 2020 по март 2021 года было обследовано 130 пациентов. У пациентов с ХМЛ с длительностью терапии ИТК менее 12 месяцев (мес.) забор образцов (ПК/КМ) проводился в момент диагностики (n=20/8), через 3 мес. (n=11/6), 6 мес. (n=8/0), 9 мес. (n=4/0) и 12 мес. (n=7/0) терапии. У пациентов с длительностью терапии ИТК более 12 мес. и уровнем BCR/ABL1>0,01% (n=16) забор ПК выполнялся однократно. Пациенты с ХМЛ с глубоким МО были разделены на 2 группы: пациенты, получающие терапию иТк и пациенты в ремиссии без лечения (РБЛ). В первой группе у пациентов выполнялся забор ПК (n=47) и КМ (n=10), во второй группе — только ПК (n=24). В контрольную группу были включены пациенты с другими МПЗ: ПМФ (n=1), ОМЛ (n=2), ХММЛ (n=1), Ph+ОМЛ (n=1); с вторичным тромбоцитозом и с гиперэозинофильным синдромом (n=2), с Ph+ОЛЛ (n=1) и пациенты с хМл с атипичными типами транскрипта BCR/ ABL (n=2).
Результаты. У пациентов с ХМЛ в дебюте заболевания
медиана (Ме) BCR/ABL составила 81,2% (13,8%-187%), через 3 мес. терапии ИТК — 3% (0%-41,1%), через 6 мес. — 0,7% (0%-17,5%), через 9 мес. — 0,00058% (0%-0,06%) и через 12 мес. — 0,16% (0%-1,6%). CD26+ ЛСК в ПК и в КМ были обнаружены у всех пациентов в дебюте ХМЛ. Ме CD26+ ЛСК в ПК составила 32,1/мкл (0-345,7), в КМ — 82,3/мкл (12,5-236,4). Через 3 мес. терапии CD26+ ЛСК были выявлены в КМ только у 1 пациента (5,7/мкл). На сроках терапии ИТК 6, 9 и 12 мес. ни у одного пациента СD26+ ЛСК выявлены не были ни в ПК, ни в КМ. В группе пациентов без глубокого МО с длительностью терапии ИТК >12 мес., CD26+ ЛСК в ПК выявлялись только у пациентов с ХМЛ, резистентных к нескольким линиям терапии ИТК и с BCR/ABL1>1%. Ме CD26+ЛСК составила 0,1/мкл (0,1-2,9). Ни у кого из пациентов с ХМЛ с глубоким МО, как получающих терапию ИТК, так и в РБЛ, ни в ПК, ни в КМ не были обнаружены CD26+ ЛСК. В контрольной группе CD26+ ЛСК в ПК были выявлены у 1 пациента с Ph+ ОЛЛ (BCR/ABL р190) и у 1 пациента с ХМЛ (BCR/ABL р190).
Выводы. Выявлено, что у 100% пациентов с ХМЛ в дебюте заболевания в ПК и в КМ, выявляются CD26+ ЛСК. Однако установлено, что уже на ранних сроках терапии, при определяемом уровне BCR/ABLl, CD26+ ЛСК не обнаруживаются. Интересным фактом является также и то, что у пациентов с глубоким МО ни в ПК, ни в КМ CD26+ ЛСК не выявляются, что противоречит результатам зарубежных исследований (E.Abruzzese и соавт., 2018; М.ВоссЫа и соавт., 2020; 0.1Шап и соавт., 2020). Планируется продолжение исследования динамики CD26+ ЛСК на фоне терапии ИТК и изучение роли CD26+ ЛСК в развитии молекулярного рецидива после отмены терапии ИТК.
С.Я. Думпис1, Б.В. Бидерман2, Е.Б. Ликольд2, А.Б. Судариков2
ПРИМЕНЕНИЕ СЕКВЕНИРОВАНИЯ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ ДЛЯ АНАЛИЗА ГЕНОВ IGHV У БОЛЬНЫХ ХЛЛ С ОЛИГОКЛОНАЛЬНЫМИ ПЕРЕСТРОЙКАМИ
1Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Московский Физико-
Технический Институт (Государственный Университет)», г. Москва 2Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Москва
Введение. Мутационный статус генов ЮНУ и стереотипность В-клеточного рецептора являются ключевыми прогностическими факторами при хроническом лимфоци-тарном лейкозе (ХЛЛ). Пациенты с мутированными генами ЮНУ (М-^Щ характеризуются индолентным течением заболевания с существенно более высокой средней продолжительностью жизни, по сравнению с пациентами с генами ЮНУ без мутаций (и-^Щ. Тем не менее, существующая рутинная лабораторная методика определения мутационного статуса ЮНУ, основанная на методе секвенирования по Сэн-геру, не дает результатов для некоторых пациентов. В случаях с более, чем одной клональной перестройкой в опухолевых клетках прочитать последовательность можно только для перестроек, образованных с генами ЮНУ из разных семейств. Однако, около 4% пациентов имеют две клональные перестройки, образованные при участии генов ЮНУ одного семейства. Кроме того, чувствительность секвенирования по Сэнгеру бывает недостаточной для проведения анализа на ранних стадиях заболевания или в начале рецидива.
Цель. Оценить возможность и целесообразность определения мутационного статуса генов ЮНУ с помощью рутинной лабораторной технологии секвенирования следующего поколения (NGS) в сложных случаях.
Материалы и методы. В исследование был включен материал 26 пациентов с ХЛЛ для которых секвенирование по Сэнгеру оказалось нерезультативным. Амплификацию локу-са ЮНУ проводили с использованием двух мультиплексных
систем на основе праймеров, рекомендованных Европейской Инициативой Изучения ХЛЛ (ERIC). Подготовку библиотек для секвенирования осуществляли набором Nextera XT (Illumina, USA) согласно рекомендациям производителя. Секвенирование проводили на генетическом анализаторе MiSeq (Illumina, USA). Результаты анализировали с помощью свободного программного обеспечения MiXCR software (MiLaboratory, Россия). Определение мутационного статуса генов IGHV и стереотипности рецептора проводили c использованием баз данных IMGT/V-QUEST и ARRest согласно рекомендациям ERIC.
Результаты. У 20 пациентов были обнаружены по две клональные перестройки, в 18 случаях эти пары были с использованием одного семейства IGHV (у 14 - VH3, у 4 - VH1). У одного пациента были перестройки генов IGHV1-69 и IGHV7-4 (в обычных условиях они амплифицируются с одного прай-мера) и у одного - IGHV1-69 и IGHV3-73. В 19 случаях только одна перестройка была продуктивной, у одного пациента -обе. Мутационный статус во всех данных перестройках не отличался. Таким образом, мы определили вариант U-CLL для 16 пациентов и M-CLL для 4. Кроме того, среди пациентов с U-CLL мы обнаружили двух со стереотипными рецепторами CLL#2 и одного с CLL#1, отличающимися наиболее агрессивным течением заболевания.
У трех пациентов было выявлено по одной продуктивной клональной перестройке. Вероятно, неудача секвенирова-ния по Сэнгеру в этих случаях была связана с небольшим ко-
