CC BY
9
УДК 544.341.2.001.24
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСТАНТЫ ДИССОЦИАЦИИ КОМПЛЕКСА ARS-1620 С БЕЛКОМ KRASG12C МЕТОДАМИ МОЛЕКУЛЯРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ
А.М. Кулакова1'2*, Т.М. Захарова1, Ф.Д. Мулашкин1, Е.О. Терехова2'3, М.Г. Хренова1,4
(1Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; 2Ин-ститут биохимической физики имени Н.М. Эмануэля РАН; 3Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева; 4ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН;*е-таИ: [email protected])
Представлены результаты определения константы диссоциации комплекса фермента KRAS, имеющего онкогенную мутацию G12C, с потенциальным ингибитором передачи клеточного сигнала ARS-1620. Значение константы диссоциации, оцененное методом молекулярного докинга, составило 280 нМ. Применение более точного метода молекулярной динамики с использованием техники перекрещивающихся распределений позволило получить оценку 0,3±0,1 нМ.
Ключевые слова: RAS, ARS-1620, молекулярный докинг, молекулярная динамика, H-REUS.
Белки семейства RAS относятся к классу малых ГТФаз, катализирующих гидролиз гуано-зинтрифосфата (ГТФ) до гуанозиндифосфата (ГДФ). Интерес исследователей к этому классу белков вызван их участием в передаче клеточных сигналов, отвечающих за рост и деление клеток. Белки RAS представляют собой молекулярные переключатели и могут находиться в двух состояниях: активном и неактивном. В активном состоянии белки RAS передают клеточный сигнал и чаще всего находятся в состоянии, связанном с ГТФ. Комплекс RAS с ГДФ находится в неактивном состоянии. Переключение между состояниями в направлении активации сигнала происходит с помощью факторов нуклеотидного обмена (GEF), обеспечивающих замену ГДФ на ГТФ в белке RAS. Переключение между состояниями в направлении прекращения передачи сигнала происходит непосредственно за счет ферментативного гидролиза ГТФ до ГДФ, который нередко ускоряется белками, активирующими ГТФа-зы (GAP) [1].
Мутации в белках семейства RAS характерны для 30% случаев раковых заболеваний у человека, поскольку способствуют постоянному пребыванию белка в активном состоянии [2]. При нормальном функционировании белки RAS регулируют пролиферацию клеток, устойчивость к апоптозу и метастазирование опухолей. Ряд точечных мутаций приводит к нарушению отрицательной сигнализации, и клетки начинают непрерывно размножаться, образуя раковую
опухоль. В связи с этим актуальным становится поиск соединений, способных стабилизировать неактивное состояние белков RAS.
Белки семейства RAS имеют достаточно гладкую поверхность и не содержат энергетически выгодных центров связывания, поэтому на сегодняшний день не существует терапевтических препаратов, способных переводить их в неактивное состояние [2]. Для стабилизации неактивного состояния белка RAS пытались использовать как малые молекулы, связывающиеся в его активном центре [3], так и полипептиды, и антитела, имеющие большую площадь контакта с белком [4, 5]. Дизайн малых молекул, способных связываться в активном центре белка, не дает желаемых результатов, поскольку сложно подобрать молекулу, имеющую сродство к белку значительно большее, чем нуклео-тиды ГТФ и ГДФ.
Более перспективное направление в поиске стабилизатора неактивного состояния RAS - поиск аллостерических ингибиторов. Среди таких веществ наиболее важными оказались соединения, связывающиеся в S-IIP-кармане белка RAS [6-8]. Данный карман был обнаружен несколько лет назад в ходе поиска ковалентных ингибиторов белка KRAS c заменой аминокислотного остатка глицина в 12-м положении на цистеин (KRASG12C), что подтверждено молекулярно-ди-намическими расчетами [6]. В кристаллических структурах нативных белков и белков без лиган-дов, связывающихся в данной области, S-IIP-
кармана не наблюдается, поскольку его размер и форма определяются наличием лиганда в этой полости и его стабилизирующими свойствами. S-IIP-карман располагается близко к карману связывания нуклеотидов по другую сторону от аминокислотного остатка Cys12, он образован аминокислотными остатками центрального бета-листа Р1 и альфа-спиралей а2 и а3 [6].
В недавних исследованиях [7] показано, что соединение ARS-853 селективно связывается с белком KRAS, имеющим онкогенную мутацию G12C, и стабилизирует его неактивную форму. Однако такое соединение оказалось неустойчивым in vivo и было модифицировано до более совершенного соединения ARS-1620, которое показывает лучшую химическую и метаболическую стабильность с сохранением селективности по отношению к KRASG12C и может применяться при исследовании живых организмов [8].
В данной работе с помощью методов молекулярного моделирования изучен процесс неко-валентного связывания соединения ARS-1620 с ферментом KRASG12C. Для оценки константы дис-
социации комплекса КЯЛ8°12СТДФ ЛЯ8-1620 выбраны два разных подхода:
1) метод молекулярного докинга;
2) метод молекулярной динамики с использованием техники перекрещивающихся распределений (И-ЯБШ) [9].
Результаты и их обсуждение
В качестве начальной структуры для расчетов использовали кристалл комплекса КЯЛ8°12СТДФ ЛЯ8-1620 (РББ ГО 5У9И) [8], достроенный до полноатомной модели. Молекулярный докинг проводили с помощью генетического алгоритма Ламарка, реализованного в программном пакете Аи1;о^ск [10]. Использование приближения жесткий белок - гибкий лиганд позволяет изменять конформацию лиганда только посредством изменения торсионных углов, поэтому для улучшения результатов докинга была проведена предварительная оптимизация геометрии АЯ8-1620 (рис. 1) методом теории функционала электронной плотности в варианте Кона-Шэма Б3ЬУР/6-3Ш** в программ-
Рис. 1. Слева положение соединения АЯ8-1620 в кармане связывания 8-11Р белка КЯА8 (РББ ГО 5У9И). Шаростержневой моделью представлено соединение АЯ8-1620, стержневой моделью - ГДФ и СуБ12. Ван-дер-Ваальсовыми сферами представлены катион магния и атомы, определяющие направление выхода лиганда в раствор. Направление выхода лиганда в раствор обозначено стрелкой. Справа строение соединения АЯ8-1620 и его положение в 8-ПР-кармане
белка КЯА8°12С
ном пакете GAMESS [11]. Оценочная функция программы Autodock основана на силовом поле AMBER, хорошо оценивающем энергетические параметры и геометрические характеристики белковых систем.
Конформационный поиск положения лиганда проводили по всей поверхности белка. Наилучшее значение оценочной функции соответствует положению лиганда в кармане связывания S-IIP, аналогичному положению лиганда в кристалле комплекса KRASG12CTДФ ARS-1620 (RMSD = 3,6 Â). 2-Гидрокси-6-фторбензольный фрагмент находится в гидрофобной части кармана, образованной аминокислотными остатками Met72, Ile 100, Val 103, а также алкильными фрагментами аминокислотных остатков Arg68 и Gln99. Хинозалиновый структурный мотив образует п-стэкинговое взаимодействие с Tyr96. Акриламидный «хвост» ARS-1620 находится на расстоянии 3 Â от атома серы Cys12 и образует водородную связь атомом Ox c аминокислотным остатком Lys 16. Оценка стандартной энергии Гиббса связывания ARS-1620 в S-IIP-кармане, полученная методом молекулярного докинга, составила -9 ккал/моль. Данное значение может быть преобразовано в константу диссоциации комплекса KRAS -ГДФ ARS-1620 с помощью уравнения
AG dis =-RTlnK^.
Значение константы диссоциации, оцененное методом молекулярного докинга, составило 280 нМ.
Для оценки константы диссоциации ком -плекса ARS-1620 с KRASG12C методом молекулярной динамики с применением техники перекрещивающихся распределений было проведено моделирование процесса выхода лиган-да в раствор. Для расчета указанным методом полноатомная модель кристалла комплекса KRASG12CTДФ ARS-1620 была сольватирована молекулами воды таким образом, чтобы расстояние от любого атома комплекса до границ ячейки в виде прямоугольного параллелепипеда составляло не менее 15 Â, и чтобы обеспечивалась возможность полного выхода лиганда в раствор. Далее в систему были добавлены катионы натрия для нейтрализации общего заряда. Общий размер системы, содержащей 37871 атом, составил 70x76x74 Â3. Белок KRASG12C описывался набором параметров силового поля CHARMM36 [12], соединения ARS-1620 и ГДФ - параметрами CGenFF [13], а молекулы воды - параметрами TIP3P [14].
Метод молекулярной динамики с применением техники перекрещивающихся распределений (Hamiltonian replica-exchange umbrella sampling method) заключается в параллельном моделировании нескольких копий системы с ограничивающими гармоническими потенциалами вдоль выбранной координаты реакции, которые при определенных условиях могут периодически обмениваться своими координатами [9]. Моделирование проведено в программном пакете NAMD [15], в качестве координаты реакции выбран вектор, соединяющий Са-атом Ser39 и С8-атом соединения ARS-1620 (рис. 1). Всего моделировали 14 параллельных копий системы с центрами ограничивающих гармонических потенциалов, соответствующих расстояниям Ca (Ser39) - С8 (ARS-1620) от 15,0 до 33,2 Ä с интервалом в 1,4 Ä. Начальные геометрии для каждой копии системы были получены из предварительного моделирования методом направленной молекулярной динамики [16]. Копии системы обменивались координатами каждые 100 фс. В ходе моделирования было рассчитано 0,21 мкс моле-кулярно-динамической траектории, по 15 нс для каждой копии системы. На рис. 2 представлен профиль стандартной энергии Гиббса для исследуемого процесса и показана сходимость результатов при увеличении длины молекулярно-дина-мических траекторий.
Для получения значения константы диссоциации комплекса KRASG12CTДФ ARS-1620 исходя из профиля свободной энергии процесса выхода ARS-1620 в раствор был проанализирован набор молекулярно-динамических траекторий, содержащих последние 13 нс траектории для каждой системы, с помощью метода анализа взвешенных гистограмм (WHAM) [17], реализованного в программном пакете Grossfield Lab WHAM [18]. Статистические ошибки оценены методом анализа ошибок Монте-Карло (Monte Carlo Bootstrap Error Analysis), основанного на многократной генерации выборок методом Монте-Карло на базе имеющейся выборки, и реализованного в программном пакете Grossfield Lab WHAM [18].
На рис. 2 представлен профиль поверхности стандартной энергии Гиббса выхода соединения ARS-1620 в раствор. В области малых значений координаты реакции локализован ярко выраженный минимум, соответствующий связанному состоянию системы KRASG12CTДФ ARS-1620. В области больших значений координаты реакции есть минимум при значении координаты реакции 24 Ä, который от-
Рис. 2. Профиль поверхности стандартной энергии Гиббса выхода соединения ЛЯ8-1620 в раствор из 8-ПР-кармана белка КЯЛ8°12С, оцененный методом анализа взвешенных гистограмм на основе моделирования методом молекулярной динамики с применением техники перекрещивающихся распределений. Доверительный интервал оценивали с помощью метода анализа ошибок Монте-Карло. На врезке справа профиль поверхности стандартной энергии Гиббса в области свободного лиганда (время симуляции, нс: 1 - 1,0; 2 - 5,0; 3 - 8,0; 4 - 10,0; 5 - 12,0; 6 - 12,5; 7 - 13,0). На врезке слева зависимость стандартной энергии Гиббса от времени моделирования для систем с разными значениями координаты реакции, А: 1 - 30;
2 - 31; 3 - 32; 4 - 33
вечает частично-связанному состоянию. Область, отвечающая свободному лиганду в растворе, имеет значение координаты реакции более 30 А. Поэтому оценку стандартной энергии Гиббса процесса рассчитывали как разность среднего значения стандартной энергии Гиббса в интервале координаты реакции 30-33 А и значения стандартной энергии Гиббса в минимуме, соответствующем связанному состоянию лиганда. Стандартная энергия Гиббса процесса выхода ЛЯ8-1620 в раствор, оцененная методом молекулярной динамики с применением техники перекрещивающихся распределений, составила 13,1±0,2 ккал/моль. Соответствующее ей значение константы диссоциации комплекса ЛЯ8-1620 с белком КЯЛ8°12С при Т = 298 К составило 0,3±0,1 нМ.
Заключение
Сравнение полученных результатов показывает, что использование значительно менее ре-сурсозатратного метода молекулярного докин-
га приводит к завышению значения константы диссоциации комплекса ЛЯ8-1620 с белком КЯЛ8°12С за счет недооценки свободной энергии связывания лиганда с белком, которая обусловлена тем, что расстояние от атома N хи-назолинового фрагмента ЛЯ8-1620 до атома N Ш895 КЯЛ8°12С в методе молекулярного докинга больше, чем в методе молекулярной динамики с применением техники перекрещивающихся распределений.
Работа частично поддержана Российским научным фондом (проект № 19-73-20032, Е.О. Терехова) и выполнена с использованием оборудования Центра коллективного пользования сверхвысокопроизводительными вычислительными ресурсами МГУ имени М.В. Ломоносова [19]. Конфликта интересов нет. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием животных в качестве объектов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Bourne H.R., SandersD.A., McCormickF. // Nature. 1991. Vol. 349. P. 117 (DOI: 10.1038/349117a0).
2. Cox A.D., Fesik S.W., Kimmelman A.C., Luo J., Der C.J. // Nature Rev. Drug Discovery. 2014. Vol. 13. P. 828 (DOI: 10.1038/nrd4389).
3. Hunter J.C.; Gurbani D., Ficarro S.B. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. 2014. Vol. 111. P. 8895 (DOI: 10.1073/ pnas.1404639111).
4. Sogabe S., Kamada Y., Miwa M. et al. // ACS Med. Chem. Lett. 2017. Vol. 8. P. 732 (DOI: 10.1021/ acsmedchemlett.7b00128).
5. Spencer-Smith R., Koide A., Zhou Y. et al. // Nat. Chem. Biol. 2017. Vol. 13. P 62 (DOI: 10.1038/ nchembio.2231).
6. Ostrem J.M., Peters U., Sos M.L., Wells J.A., Shokat K.M. // Nature. 2013. Vol. 503. P. 548 (DOI: 10.1038/ nature12796).
7. PatricelliM.P., JanesM.R., Li L.-S. et al. // Cancer Discov. 2016. Vol. 6. P. 316 (DOI: 10.1158/2159-8290.CD-15-1105).
8. Janes M.R., Zhang J., Li L.-S. et al. // Cell. 2018. Vol. 172. P. 578 (DOI: 10.1016/j.cell.2018.01.006).
9. Earl D.J., Deem M.W. // Phys. Chem. Chem. Phys. 2005. Vol. 7. P. 3910 (DOI: 10.1039/B509983H)
10. Morris G.M., Huey R., Lindstrom W. et al. // J. Comput. Chem. 2009. Vol. 30. P. 2785 (DOI: 10.1002/jcc.21256).
11. Schmidt M.W., Baldridge K.K., Boatz J.A. et al. // J. Comput. Chem. 1993. Vol. 14. P. 1347 (DOI: 10.1002/ jcc.540141112).
12. Yu W., He X., Vanommeslaeghe K., MacKerell A.D. // J. Comput. Chem. 2012. Vol. 33. P. 2451 (DOI: 10.1002/ jcc.23067).
13. Vanommeslaeghe K., Hatcher E., Acharya C. et al. // J. Comput. Chem. 2010. Vol. 31. P. 671 (DOI: 10.1002/ jcc.21367).
14. Jorgensen W.L., Chandrasekhar J., Madura J.D. et al. // J. Chem. Phys. 1983. Vol. 79. P. 926 (DOI: 10.1063/1.445869).
15. Phillips J.C., Braun R., Wang W. et al. // J. Comput. Chem. 2005. Vol. 26. P. 1781 (DOI: 10.1002/ jcc.20289).
16. Isralewitz B., Baudry J., Gullingsrud J., Kosztin D., Schulten K. // J. Mol. Graph. Model. 2001. Vol. 19. P. 13 (DOI: 10.1016/S1093-3263(00)00133-9).
17. Kumar S., Rosenberg J.M., Bouzida D., Swendsen R.H., Kollman P.A. // J. Comput. Chem. 1992. Vol. 13. P. 1011.
18. Grossfield A. WHAM: the weighted histogram analysis method http://membrane.urmc.rochester.edu/content/ wham.
19. Voevodin V., Antonov A., Nikitenko D. et al. // Su-percomput. Front. Innov. 2019. Vol. 6. P. 4 (DOI: 10.14529/jsfi190201).
Поступила в редакцию 10.09.2019 Получена после доработки 12.10.2019 Принята к публикации 14.11.2019
ESTIMATION OF DISSOCIATION CONSTANT OF ARS-1620 COMPLEX WITH KRASG12C PROTEIN BY MOLECULAR MODELING
A.M. Kulakova12*, T.M. Zakharova1, F.D. Mulashkin1, E.O. Terekhova2,3, M.G. Khrenova1,4
(1 Lomonosov Moscow State University; 2Emanuel Institute of Biochemical Physics of the Russian Academy of Sciences; D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia; Federal Research Centre "Fundamentals of Biotechnology" of the Russian Academy of Sciences; *e-mail: [email protected])
The paper presents the results of the estimation of KRASG12C.GDP.ARS-1620 complex dissociation constant. The ARS-1620 is a potential inhibitor of cellular signal transduction of KRAS enzyme with the oncogenic mutation G12C. Dissociation constant value estimated by molecular docking is 280 nM and 0.3±0.1 nM within the molecular dynamics combined with the Hamilton replica exchange umbrella sampling approach.
Key words: RAS, ARS-1620, molecular docking, molecular dynamics, H-REUS. Сведения об авторах: Кулакова Анна Михайловна - мл. науч. сотр. лаборатории химической кибернетики кафедры физической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова ([email protected]); Захарова Татьяна Максимовна - студентка лаборатории химической кибернетики кафедры физической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова ([email protected]); Мулашкин Фёдор Дмитриевич - студент лаборатории химической кибернетики кафедры физической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова ([email protected]); Терехова Екатерина Олеговна - мл. науч. сотр. лаборатории компьютерного моделирования биомолекулярных систем и наноматериалов ИБХФ РАН, аспирант кафедры квантовой химии Института химии и проблем устойчивого развития РХТУ им. Д.И. Менделеева (katerin. [email protected]); Хренова Мария Григорьевна - вед. науч. сотр. лаборатории химической кибернетики кафедры физической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова; вед. науч. сотр., руководитель группы молекулярного моделирования ФИЦ Биотехнологии РАН ; докт. физ.-матем. наук ([email protected]).
