ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА Текст научной статьи по специальности «Прочие технологии»

Х

И

М

И

Ч

Е

С

К

И

Е

НАУКИ

УДК 57

М.А. Матюшина ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА

Определение содержания белка - важная часть любого исследования, которая связана с очисткой, выделением, характеристикой и анализом белка. Рассматриваемые мною методы в данной статье немного устарели и имеют многолетнюю историю, но несмотря на это широко используются в лабораторной практике и характеризуются рядом принципиальных моментов, которые необходимо учитывать при выборе того или иного метода, который позволит с высокой точностью определять содержание белка.

Ключевые слова: белок, определение содержания белка, метод Low-ry, метод Bradford.

У всех живых организмов белки - главнейшие работники, отвечающие за протекающие в клетке. Еще на ранних стадиях формирования биохимии и, тем более, по мере того, как исследователи научились выделять индивидуальные белки, определять их состав и структуру, выяснять, когда и как они синтезируются в клетках, определять, какие белки функционируют при разных условиях, сравнивать одинаковые белки из различных организмов, а также белки из клеток организмов дикого типа и мутантов и т.д., значение количественного определения содержания белка в исследуемом образце все возрастает.

Каждый метод, применяемый с целью определения белка в бесклеточных экстрактах, демонстрирует лишь общее содержание белка в образце. Чтобы получить представление о составе белков и их индивидуальных свойствах и функциях, необходимо фракционирование сложных протеиновых смесей посредством их хроматографического, либо электрофоретического разделения с целью дальнейшего анализа индивидуальных белков. Безусловно, при всех перечисленных ситуациях необходимо определять содержание белка. В настоящее время не существует какого-то одного конкретного метода определения белка, который удовлетворял бы одновременно все требования для количественного определения. У каждого метода есть свои плюсы и минусы.

Очевидно, что знание точной концентрации белка абсолютно необходимо для расчета, например, ферментативной активности. Погрешности в измерении концентрации белка приводят к накоплению общих ошибок в расчетах.

Рассмотрим наиболее часто и широко используемые методы определения белка: метод Lowry и метод Bradford. Помимо того, включена информация о некоторых приемах, использование которых по-

© Матюшина М.А., 2018.

Вестник магистратуры. 2018. № 5-4(80)

ISSN 2223-4047

могает преодолеть ограничения, инициированные либо несовместимостью буферов с выбранным методом определения белка, либо невысоким содержанием белка в исследуемом образце.

Выбор метода определения белка

Одним из наиболее важным фактором при определении концентрации белка является выбор совместимого с анализируемым образцом метода. Так как все описанные ниже методы базируются на специфических свойствах белков, то и структура белкового образца, и состав буфера являются основными определяющими пригодности метода.

Состав белкового образца является решающим при выборе метода. Если в пробе доминирут белки, обогащенные аминокислотными остатками аргинина, то в данном случаепри определении по Bradford результаты будут завышены, в то время как при использовании методов Lowry получаются наболее точные результаты. Пробы c цистеинбогатыми белками будут давать результаты близкие к истинным как при использовании метода Lowry, так и при использовании метода Bradford. В целом, если следует определить содержание белка в сложных белковых смесях, то предпочтительней использовать метод Lowry.

Состав буфера также очень важен. Метод Lowry высокочувствителен к такому часто используемому компоненту буферной смеси, как ЭДТА, которая мешает образованию хромофора. Метод Bradford не подходит для высоких концентраций детергентов, но вполне употребим для использования в присутствии восстановителей, таких как ДТТ или 2-меркаптоэтанол.

Калибровочный график

Как правило, для построения калибровочного графика используется один стандартный белок, и очень принципиально подобрать его верно. Если стандартный белок выбран неудачно, то это может привести к существенным погрешностям (как в сторону завышения, так и занижения) в расчетах абсолютного содержания белка. Однако это никак не помешает проводить сравнительные исследования содержания белков в разных образцах. Наиболее популярными стандартами являются бычий сывороточный альбумин (БСА) и овальбумин, хотя у них есть некоторые ограничения, которые необходимо принимать во внимание при проведении исследований. Если для определения используется кит, в составе которого имеется раствор стандартного белка (чаще всего, БСА) с известной концентрацией, собственно его и необходимо использовать для построения калибровочного графика.

Градуировочный график не обязательно должен быть линейным. Интервал концентраций белка для калибровки зависит от выбранного метода. Например, метод Bradford довольно чувствительный, но градуировочный график имеет линейный участок в достаточно узком интервале концентраций белка. В идеале градуировочный график необходимо строить в каждом опыте, что дает возможность добиться более точных результатов. Особенно это касается метода Lowry, развитие окраски в котором не терминируется. При использовании метода Bradford могут наблюдаться существенные сдвиги калибровочных кривых, поэтому рекомендуется хотя бы периодически строить градуировочные графики.

МЕТОД LOWRY

Этот метод основан на двух различных реакциях. Первая реакция образованиие комплекса катионов меди с амидными связями, с последующим восстановлением меди в щелочных условиях. Получаемый продукт - биуретовый хромофором. Вторая реакция - восстановление реагента Folin-Ciocateu комплексом восстановленной меди с амидными связями, а также аминокислотными остатками тирозина и триптофана. Реагент Folin-Ciocalteu в восстановленном виде имеет синий цвет, поэтому детектируется спектрофотометрически в диапазоне длин волн 500-750 нм. Сама по себе биуретова реакция не очень чувствительна. Использование реагента Folin-Ciocalteu повышает чувствительность метода почти в 100 раз.

Метод относительно чувствительный, но требует больше времени, чем другие, и чувствителен ко многим соединениям. Корректному определению мешают: детергенты, углеводы, глицерин, трицин, ЭДТА, Трис, соли калия, сульфгидрильные соединения, дисульфиды, фенолы, гуанин, ксантин, магний и кальций. Многие из этих веществ используются в буферах для гомогенизации или подготовки белковых проб. Это является одним из основных ограничений этого метода.

Также метод Lowry чувствителен к изменениям в содержании аминокислотных остатков тирозина и триптофана. Линейность калибровочного графика при использовании БСА в качестве стандарта наблюдается до концентрации белка в пределах 1500-2000 мкг/мл. Хотя спектр поглощения окрашенного продукта реакции приходится на 500-750 нм, обычно используют длину волны 660 нм. Другие длины волн также могут использоваться, и это позволяет уменьшить эффект от "загрязнения" пробы посторонними веществами.

МЕТОД BRADFORD

Это простой, быстрый, недорогой и чувствительный метод определения содержания белка, вследствие чего он является одним из наиболее популярных. Его основное достоинство - чувствительность; метод позволяет надежно определять от 10 до 100 мкг/мл белка. Метод основан на прямом связывании

Кумасси G-250 с аминокислотными остатками аргинина, триптофана, тирозина, гистидина и фенилала-нина в белке, причем с аргинином связывается в восемь раз чаще, чем с другими аминокислотными остатками. Поэтому, если известно, что белок обогащен остатками аргинина (например, гистоны), то в качестве стандарта необходимо также использовать аргинин - богатый белок. Комплекс Кумасси-аргинин имеет максимум поглощения при 595 нм, тогда как сам краситель в растворе - при 470 нм. Спектры поглощения комплекса и чистого красителя перекрываются, поэтому очень важно следить за соотношением объемов красителя и белка, так как их неконтролируемое изменение будет приводить к ошибкам измерения. Если по какой-то причине метод Bradford используется для определения белка в широком диапазоне концентраций (до 1500 мкг/мл), то очевидно, что калибровочный график не будет линейным. Однако им можно пользоваться, если "разбить" его на линейные отрезки с целью получения линейного уравнения для каждого линейного участка. Далее полученные уравнения можно будет применять при расчетах. Другой, вероятно, наиболее важный аспект, возникающий при использовании метода - это возможное взаимодействие компонентов буфера образца с красителем. Необходимо проверять реакцию буферной смеси, в которой находится белок, на взаимодействие с красителем.

Следует отметить, что для измерения лучше использовать стеклянные кюветы, так как на стенках кварцевых и, тем более, пластиковых кювет адсорбируется значительное количество красителя.

Приложение

Метод Lowry

Реактив Folin-Ciocalteu. 100 г вольфрамата натрия, 25 мг молибдата натрия, 700 мл воды, 50 мл 85% фосфорной кислоты и 100 мл соляной кислоты кипятить 10 ч с обратным холодильником. Добавить 150 г сульфата лития, 50 мл воды и 3-4 капли бромной воды, кипятить в течение 15 мин. После охлаждения разбавить водой до 1 л, профильтровать. Как видно, готовить реактив самим очень трудоемко. Дешевле и надежней купить готовый реактиву фирмы "Sigma" .

Реактив Lowry. 2% Na2CO3 (раствор 1), 2% K-Na тартрат (или 2% Na цитрат) (раствор 2), 1% CuSO4 (раствор 3). Все эти растворы можно хранить при комнатной температуре. Непосредственно перед определением приготовить рабочий раствор, для чего смешать 98 мл раствора 1, 1 мл раствора 2 и 1 мл раствора 3.

Протокол (время проведения 1.5-2.0 ч). К 100 мкл раствора белка в 0.5 M NaOH добавить 500 мкл свежеприготовленного реактива Lowry, инкубировать 10 мин, затем добавить 100 мкл разбавленного реактива Folin-Ciocalteu (разбавить исходный реактив дистиллированной водой в соотношении 1 : 1), инкубировать 1 ч в темноте. Измерить оптическую плотность полученного раствора при 750 нм.

Поскольку при этом реакция никак не останавливается, то следует помнить, что каждые 10 мин оптическая плотность будет увеличиваться. Поэтому необходимо контролировать время, прошедшее до спектрофотометрии.

Метод Bradford

Реагент: 0.5 мг/мл Кумасси (Coomassie Blue Brilliant) G-250, 25% метанол (этанол) и 42.5% H3PO4. Реагент стабилен в темноте при 4°C. Для приготовления рабочего раствора реагент разбавить в пять раз. Разбавленный рабочий раствор стабилен в течение недели в темноте при 4°C.

Хотя приготовить рабочий раствор не составляет большого труда, но его можно купить у фирмы "Sigma" .

Описание анализа. К 50 мкл раствора белка добавить 450 мкл рабочего раствора, перемешать, инкубировать при комнатной температуре 5 мин, измерить оптическую плотность полученного раствора при 595 нм.

МАТЮШИНА МАРИЯ АЛЕКСЕЕВНА - магистрант, РГУ им. С.А. Есенина, Россия.