CC BY
20
Для корреспонденции
Постников Павел Викторович - кандидат химических наук, начальник отдела допингового контроля Национальной антидопинговой лаборатории (Института) Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова Адрес: 105005, Российская Федерация, г. Москва, Елизаветинский переулок, д. 10, стр. 1 E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-3424-0582
Постников П.В.1, Орджоникидзе З.Г.2, Бадтиева В.А.2, Тюрин И.А.3, Павлов В.И.2
Определение кобальта в образцах плазмы крови методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой после перорального приема содержащих кобальт биологически активных добавок к пище
Национальная антидопинговая лаборатория (Институт) Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 105005, г. Москва, Российская Федерация Государственное автономное учреждение здравоохранения «Московский научно-практический центр медицинской реабилитации, восстановительной и спортивной медицины Департамента здравоохранения города Москвы», 105120, г Москва, Российская Федерация
Общество с ограниченной ответственностью «Евроаналитика», 129110, г. Москва, Российская Федерация
National Anti-Doping Laboratory (Institute), M.V. Lomonosov Moscow State University, 105005, Moscow, Russian Federation
Moscow Centre for Research and Practice in Medical Rehabilitation, Restorative and Sports Medicine of Moscow Healthcare Department, 105120, Moscow, Russian Federation Eurotest Laboratory", 129110, Moscow, Russian Federation
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Постников П.В.; сбор и обработка материала - Постников П.В., Тюрин И.А.; статистическая обработка, систематизация и обработка полученных результатов - Постников П.В., Орджоникидзе З.Г., Бадтиева В.А.; написание текста - Постников П.В.; редактирование, утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи - все авторы.
Благодарности. Авторы благодарят всех добровольцев, принявших участие в данном исследовании, и сотрудников ООО «Евроаналитика» -коммерческого директора Краснощека Артема Геннадьевича и руководителя отдела элементного анализа Середу Андрея Евгеньевича - за содействие в проведении исследования.
Для цитирования: Постников П.В., Орджоникидзе З.Г., Бадтиева В.А., Тюрин И.А., Павлов В.И. Определение кобальта в образцах плазмы крови методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой после перорального приема содержащих кобальт биологически активных добавок к пище // Вопросы питания. 2022. Т. 91, № 6. С. 92-101. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-6-92-101 Статья поступила в редакцию 03.09.2022. Принята в печать 10.10.2022.
Funding. The research did not have sponsorship.
Conflict of interest. The authors declare no conflicts of interest.
Contribution. Concept and design of the study Postnikov P.V.; collecting and processing the material - Postnikov P.V., Turin I.A.; statistical processing, systematization and processing of the obtained results -Postnikov P.V., Ordzhonikidze Z.G., Badtieva V.A.; text writing editing -Postnikov, P.V. approval of the final version of the article, responsibility for the integrity of all parts of the article - all authors.
Acknowledgments. The authors would like to thank all the volunteers who took part in this study and the employees of Euroanalytika Ltd, Commercial Director Artem G. Krasnoshchek and Andrey E. Sereda, Head of the Elemental Analysis Department, for their assistance in carrying out the research. For citation: Postnikov P.V., Ordzhonikidze Z.G., Badtieva V.A., Turin I.A., Pavlov V.I. Determination of cobalt in plasma blood samples by the ICP-MS method after oral intake of dietary supplements containing low doses of cobalt. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2022; 91 (6): 92-101. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-6-92-101 (in Russian) Received 03.09.2022. Accepted 10.10.2022.
Determination of cobalt in plasma blood samples by the ICP-MS method after oral intake of dietary supplements containing low doses of cobalt
Postnikov P.V.1, Ordzhonikidze Z.G.2, Badtieva V.A.2, Turin I.A.3, Pavlov V.I.2
2
3
2
3
Соли неорганического кобальта (Со) предотвращают деградацию альфа-субъединицы индуцируемого гипоксией фактора, имитируя состояние гипоксии в организме и увеличивая продукцию эндогенного гормона эритропоэтина, и используются в качестве допинговых веществ, увеличивающих кислородную емкость крови и выносливость, что дает конкурентные преимущества в спорте. В настоящее время в свободной продаже предлагается большое количество биологически активных добавок к пище (БАД), в том числе содержащих кобальт. Их бесконтрольный прием может нанести удар не только по профессиональной карьере спортсменов, но и по их здоровью ввиду того, что этот микроэлемент и его соли являются сильнейшими неорганическими ядами и канцерогенами. Несмотря на это их доступность на фармацевтическом рынке, ощутимый эффект стимуляции эритропоэза и удобная пероральная форма приема приводят к необходимости их детекции в современном допинг-контроле.
Цель исследования - разработка подхода по дифференциации кобальта витамина В12, присутствующего в организме в естественном состоянии в виде хелатного комплекса, от приема солей кобальта путем количественного определения и сопоставления уровней витамина В12 и общего кобальта в крови.
Методы. В исследовании приняли участие 9 здоровых добровольцев (женщин и мужчин) в возрасте от 25 до 45 лет, ведущих активный образ жизни. Из них 3 человека в течение 20 дней принимали 2500 мкг/сут кобаламина (группа сравнения), еще 3 - БАД, содержащий аспарагинат кобальта (100 мкг/сут чистого элемента), и оставшиеся - БАД с гептагидратом сульфата кобальта (100 мкг Со/сут) (группы введения) в одно и то же время после приема пищи. Отбор образцов крови осуществляли в начале исследования и на 5, 9, 14 и 20-й день. Концентрацию общего кобальта в плазме крови добровольцев измеряли методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой, уровень кобаламина определяли на иммунохимическом анализаторе при помощи наборов для иммуноферментного анализа "Elecsys Vitamin B12IIAssay".
Результаты. В ходе исследований установлено, что при пероральном приеме кобаламина в терапевтической дозе, существенно превышающей суточную норму (3 мкг), происходило закономерное незначительное увеличение концентрации общего кобальта в крови (в 1,1 раза), а при приеме БАД, имеющих в составе кобальт в виде сульфата или аспа-рагината (около 100 мкг/сут чистого элемента) при неизменной концентрации витамина В12 наблюдалось увеличение концентрации общего кобальта в 4-6,7раза. Обнаружение подобных изменений может достоверно свидетельствовать о применении солей металла и, несомненно, будет востребовано для антидопингового контроля.
Заключение. Мониторинг уровней витамина В12 и общего кобальта в долгосрочной перспективе, подобно программе гематологического модуля биологического паспорта спортсмена, однозначно позволит детектировать возможные злоупотребления соединениями кобальта и выступит в качестве дополнительного скринингового подхода по выявлению этих допинговых веществ к иным методам анализа, например комбинации жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой.
Ключевые слова: кобальт; витамин В12; биологически активные добавки; иммуноферментный анализ; масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой; допинг-контроль; стимуляторы эритропоэза
Salts of inorganic cobalt (Со) prevent the degradation of the alpha subunit of the hypoxia-inducible factor (HIF), imitating the state of hypoxia in the body and increasing the production of the endogenous hormone erythropoietin (EPO), and are used as doping substances that increase blood oxygen capacity and endurance, which give competitive advantages in sports. Currently, a large number of dietary supplements, including Co-containing ones, are offered on free sale. Their uncontrolled intake can affect not only the professional career of athletes, but also their health, due to the fact that this trace element and its salts are the strongest inorganic poisons and carcinogens. Despite this, their availability on the pharmaceutical market, a noticeable effect of erythropoiesis stimulation and a convenient oral form of administration lead to the need for their detection in modern doping control.
The purpose of this research was to develop an approach to differentiate cobalt from vitamin B12, present in the body in its natural state, from the intake of cobalt salts by quantifying and comparing blood levels of vitamin B12 and total cobalt. Methods. The study involved 9 healthy volunteers (women and men) aged 25 to 45 years, leading an active lifestyle. Three of them took 2500 цg/day of cobalamin for 20 days (comparison group), three - dietary supplement containing cobalt asparaginate (100 цg/day in terms of pure cobalt), and the rest - dietary supplements with cobalt sulfate heptahydrate (100Mg/day in terms of pure cobalt) (administration groups) at the same time after meals. Blood samples were taken at baseline and on days 5, 9, 14 and 20. The concentrations of total cobalt in blood plasma samples of volunteers were measured by inductively coupled plasma mass-spectrometry (ICP-MS), the levels of cobalamin were determined on a Cobas 6000 immunochemical analyzer using the Elecsys Vitamin B12II Assay ELISA kits. Results. It was found that oral intake of of cobalamin at a therapeutic dose significantly exceeding the recommended daily intake (3 Mg), there was a regular slight increase in the blood concentration of total cobalt (1.1 times). At the same time intake of dietary supplements containing cobalt in the form of sulfate or asparaginate (about 100 ц-g per day in terms of pure cobalt) was accompanied by 4-6.7 fold increase in the concentration of total cobalt while unchanged vitamin B12 plasma concentration was observed. The detection of such changes can reliably indicate the use of prohibited salts and, of course, will be in demand for anti-doping control. Conclusion. Long-term monitoring of vitamin B12 and total cobalt levels, similar to hematological module of the Athlete Biological Passport program, will unambiguously detect possible abuse of cobalt salts and can be an additional evidence of the presence of these doping substances to other analytical methods, such as a combination of liquid chromatography and ICP-MS (LC-ICP-MS). Keywords: cobalt, vitamin B12, dietary supplements, ELISA, ICP-MS, doping control, erythropoiesis stimulants
Еще начиная с 1940-х гг. соли неорганического кобальта, в основном его хлорид, эффективно использовались в медицинских целях для лечения различных форм анемий [1-3]. Ионы кобальта активируют транскрип-
ционные факторы, индуцируемые гипоксией (Н!Р), что приводит к увеличению экспрессии гена гормона эри-тропоэтина, ответственного за выработку эритроцитов, и кислородной емкости крови [4-8]. Более того, ранее
эритропоэз-стимулирующую активность 1 МЕ рекомби-нантного эритропоэтина сравнивали с биологическим эффектом 5 мкмоль хлорида кобальта [2, 6, 9]. Ввиду того что большие дозы солей кобальта приводили к возникновению серьезных побочных эффектов - острых отравлений и поражений желудочно-кишечного тракта, сердечных аритмий, стимуляции процессов мутагенеза, канцерогенеза за счет образования активных форм кислорода, нарушений в работе щитовидной железы, психических расстройств [10, 11], их применение с начала 1980-х гг. практически прекратилось, а вскоре через несколько лет для клинических целей были одобрены препараты рекомбинантного эритропоэтина [12]. Начиная с 2015 г. кобальт включен в Запрещенный список Всемирного антидопингового агентства (ВАДА) в соответствии со ст. S2 «Пептидные гормоны, факторы роста, подобные субстанции и миметики» п. 1.2 «Активаторы гипоксия-индуцируемого фактора» [13] из-за потенциальной способности стимулировать процесс эритропо-эза и увеличивать аэробную выносливость, однако до сих пор не установлено его пороговое значение в биологических жидкостях.
В естественном состоянии в организме человека кобальт присутствует в виде витамина В12 - кобаламина, имеющего форму хелатного комплекса Co (III). Он практически не вырабатывается в организме, лишь незначительное его количество может синтезироваться микрофлорой кишечника, а поступает с продуктами животного происхождения, при этом добавление его в рацион питания не приводит к увеличению выносливости [14, 15]. В своей химической структуре витамин В12 содержит около 4% кобальта, координационно связанного в виде хелатного комплекса. Суточная потребность организма в витамине В12 в соответствии с МР 2.3.1.0253-21 «Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации» составляет 3 мкг [16], некоторыми авторами оценивается в величину от 3 до 7 мкг [17]. Этими же авторами сообщается, что при обычном рационе питания количество поступившего кобаламина за день составляет около 10-15 мкг, а иногда при употреблении богатых им продуктов даже 50-100 мкг [17]. В США среднее суточное поступление витамина В12 с обычным рационом составляет от 3,8 мкг у женщин до 5,94 мкг у мужчин старше 20 лет [18], а в Европе варьирует от 1,0±1,2 мкг (диета, основанная на растительной пище) до 23,9 мкг [19, 20], в Иране - от 2,6 до 13,1 мкг [21]. По некоторым данным, рекомендованная суточная доза курсового приема витамина В12 составляет от 0,15 до 1 мг [6, 22, 23]. На сегодняшний день он разрешен к применению спортсменами и не рассматривается в качестве запрещенного вещества [13]. Соли же неорганического кобальта как таковые не требуются организму для его нормального функционирования [15], это всегда экзогенные вещества, принимаемые в основном перорально или в виде внутривенных инъекций. Поэтому для современного антидопинго-
вого контроля актуальной и важной задачей является дифференциация разрешенного для применения связанного кобальта в форме витамина В12 от приема его солей, запрещенных в спорте, и оценка соотношения концентраций витамина В12 и общего кобальта.
Поскольку кобальт на 90% выводится почками [24], то в большинстве работ, связанных с его идентификацией, в качестве биологической матрицы преимущественно используют мочу [7, 14, 22, 25, 26], в некоторых работах - плазму крови, а в качестве аналитического метода определения - масс-спектрометрию с индуктивно-связанной плазмой (ИСП-МС) [7, 14, 17, 25], высокоэффективную жидкостную хроматографию -тандемную масс-спектрометрию (ВЭЖХ-МС/МС) [27, 28], обладающие высокой чувствительностью и селективностью, или комбинацию этих методов (ВЭЖХ-ИСП-МС) [29, 30]. В ряде статей описаны процедуры определения кобальта в моче и плазме крови лошадей [14, 26, 29, 31]. Несколько работ посвящено изучению эритропоэтических эффектов при приеме низких доз неорганического кобальта [6, 32]. В настоящее время лишь единичные антидопинговые лаборатории ввели определение кобальта в свою методологическую базу.
Сегодня в аптечных сетях предлагается большой выбор различных поливитаминных комплексов и биологически активных добавок к пище (БАД), содержащих в том числе кобальт (II) в небольших количествах, причем ежедневная указанная на упаковках суточная доза составляет около 10 мкг. В нашем исследовании использовали ранее предложенный A. Knoop и соавт. [25] и L.L. Hillyer и соавт. [26] подход для идентификации возможных злоупотреблений солями металла применительно к пероральному приему, основанный на сравнении соотношений концентрации витамина В12 в образцах плазмы крови здоровых добровольцев, измеренной иммунохимически, и концентрации общего кобальта, измеренной методом ИСП-МС.
Цель исследования - разработка подхода по дифференциации кобальта витамина В12, присутствующего в организме в естественном состоянии в виде хелатного комплекса, от приема солей кобальта путем количественного определения и сопоставления уровней витамина В12 и общего кобальта.
Материал и методы
Дизайн исследования. В исследовании приняли участие 9 здоровых добровольцев (женщин и мужчин) в возрасте от 25 до 45 лет, ведущих активный образ жизни и не принимавших в течение 3 последних месяцев никаких иных медикаментов, содержащих витамин В12 или соединения кобальта, 3 из которых принимали 2500 мкг/сут кобаламина («В-12 1000 mcg», Now Foods, США) (группа сравнения), еще 3 - БАД, содержащую аспарагинат кобальта, из расчета 100 мкг металла в сутки (БАД «Кобальт DS», ООО «В-МИН»,
Россия), и оставшиеся - витаминно-минераль-ный комплекс с гептагидратом сульфата кобальта, по 100 мкг/сут в пересчете на чистый элемент (Компливит®, ОАО «Фармстандарт - УфаВИТА», Россия) (группы введения), популярные в России и среди спортсменов. От каждого участника было получено письменное добровольное согласие на участие в исследовании и согласие на использование биологических материалов (венозной крови) в научных целях. Все БАД были приобретены через аптечные сети и доступны для отпуска без рецепта врача. Добровольцы принимали соответствующие биодобавки в одно и то же время после приема пищи в течение 20 дней. Отбор образцов крови осуществляли в начале исследования и на 5, 9, 14 и 20-й день.
Реагенты и материалы. Все необходимые растворы и разведения готовили на деионизированной воде [18,2 мОм, система очистки воды Millipore M ill i - Q Integral 5 (Merck-Millipore, США)]; использовали концентрированную азотную кислоту (65%) (Merck, США).
Образцы для исследования. Для исследований отбирали образцы венозной крови добровольцев до и в процессе приема биодобавок, взятые натощак, в вакуумные пробирки объемом 4 мл, 13x75 мм, Vacuette с К2ЭДТА (Greiner Bio-One GmbH, Австрия) согласно правилам сбора образцов крови по программе гематологического модуля биологического паспорта спортсмена (БПС) [33]. Образцы крови центрифугировали (1500 об/мин, 10 мин, Rotixa 50 RS, Hettich Zentrifugen, Германия), весь объем плазмы крови отбирали и замораживали при -20 °C и хранили до проведения исследований. Исследование не противоречит Хельсинкской декларации Европейской медицинской ассоциации [34]. Образцы крови добровольцев отбирали согласно п. 5.3.12.2 Международного стандарта для лабораторий [35].
Определение кобаламина иммунохемилюминесцент-ным методом в плазме крови. Для определения концентрации витамина В12 в плазме крови использовали набор реагентов для количественного определения витамина В12 иммунохемилюминесцентным методом для иммунохимических анализаторов и модулей Cobas -Elecsys Vitamin B12 II Assay (100 тестов) и калибраторы Elecsys Vitamin B12 II CalSet (Cal1 -250 пг/мл и Cal2 -1500 пг/мл) (Roche Diagnostics GmbH, Германия) [22]. Объем образцов плазмы крови, взятый для исследований, - 15 мкл. Результаты определяли с помощью 2-точечной калибровочной кривой, полученной для данного прибора, а также референсной калибровки, предоставленной с набором.
Диапазон измеряемых при помощи набора концентраций 150-2000 пг/мл. Более подробное описание количественного определения В12 в образцах плазмы крови можно посмотреть в инструкции к ИФА-набору [36].
Количественное определение общего кобальта в образцах плазмы крови методом ИСП-МС. Содержание кобальта в образце оценивали методом ИСП-МС. Образец плазмы объемом 500 мм3 подвергали минерализации с 2,5 см3 концентрированной азотной кислоты с помощью микроволновой системы разложения MARS-6
Таблица 1. Настройки прибора масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой
Table 1. Inductively coupled plasma mass-spectrometry instrument settings
Показатель / Parameter Значение I Value
Параметры потока (л/мин) / Flow Parameters (L/min)
Скорость потока плазмы / Plasma Flow 9
Скорость вспомогательного потока Auxiliary Flow 1,8
Скорость потока защитного газа / Sheath Gas 0,2
Скорость потока газа через распылитель Nebulizer Flow 1
Torch-настройки (мм) I Torch Alignment (mm)
Глубина погружения автосамплера Sampling Depth 7
Другие / Other
Мощность генерации, кВт / RFPower, kW 1,1
Скорость подачи образца в распылитель, об/мин Pump Rate, rpm 6
Отсечка, с / Stabilization delay, sec 3
Настройки ионной оптики (В) / Ion Optics (V)
First Extraction Lens -10
Second Extraction Lens -160
Third Extraction Lens -310
Corner Lens -370
M rror Lens Left 35
M rror Lens Right 30
M rror Lens Bottom 40
Entrance Lens 0
Fringe Bias -4
Entrance Plate -60
Pole bias -1
(CEM, США). Минерализат переносили в мерную колбу или фалькон объемом 50 см3 (Greiner Bio One GmbH, Австрия) и доводили объем до метки деионизированной водой. Измерения концентрации кобальта в полученном растворе проводили без разбавления, подавая в систему ввода масс-спектрометра с индуктивно-связанной плазмой Varian 810 (Varian, США).
Измерение проводили в режиме «peek-hopping», время интегрирования 0,1 мс. Расчет концентраций проводили в автоматическом режиме с помощью программного обеспечения MS-Expert.
Калибровку проводили по 6 приготовленным растворам в концентрациях 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 5 и 12 мкг/л, коэффициент достоверности аппроксимации был не менее 0,99. Уровень приемлемости получаемого калибровочного значения не более ±5% от заданной концентрации. Для приготовления калибровочных растворов делали серию разведений стандартного раствора IV-ICPMS-71A (содержит элементы Ag, Al, As, B, Ba, Be, Ca, Cd, Ce, Co, Cr, Cs, Cu, Dy, Er, Eu, Fe, Ga, Gd, Ho, K, La, Lu, Mg, Mn, Na, Nd, Ni, P, Pb, Pr, Rb, S, Se, Sm, Sr, Th, Tl, Tm, U, V, Yb, Zn с концентрацией 10 мг/л) (Inorganic Ventures, США) с добавлением 2% азотной кислоты.
Образцами контроля качества (QC) (2 уровня) для оценки правильности и точности проведения анализа
Таблица 2. Концентрации кобаламина в плазме крови добровольцев до (0-й день) и в процессе приема биологически активных добавок Table 2. The concentrations of cobalamin in the blood plasma of volunteers before (day 0) and in the process of intaking dietary supplements
Доброволец, № Volunteer, № Концентрация кобаламина, пг/мл / Cobalamin concentration, pg/ml
0-й день / day 0 5-й день / day 5 9-й день / day 8 14-й день / day 14 20-й день / day 20
1 269,0 290,1 315,8 320,1 293,9
2 347,2 382,8 358,1 378,7 334,3
3 291,3 304,4 320,3 337,1 307,6
4 378,5 409,6 417,6 390,7 418,4
5 219,8 790,7 1185,3 1577,9 1849,1
6 257,2 808,2 1291,7 1521,3 1968,7
7 266,1 923,7 1307,5 1671,2 1723,5
8 273,2 319,4 290,6 300,4 337,9
9 282,3 308,6 302,2 295,2 309,7
П р и м е ч а н и е. Добровольцы 5, 6 и 7 принимали 2500 мкг/сут кобаламина (выделено полужирным шрифтом).
N o t e. Volunteers 5, 6, and 7 consumed 2500 yg cobalamine per day (highlighted in bold).
служили контроли ClinChek Plasma Control Level 1 and Level 2 (CRM) (Recipe, Германия) Lot 1518 Ref 88838885 (срок годности до декабря 2022 г.). Значения для кобальта по паспорту 2,07 (1,66-2,49) мкг/л; 9,22 (7,38-11,1) мкг/мл. Предел количественного определения метода ИСП-МС составляет 2 пг/мл.
Для анализа образцов плазмы крови методом ИСП-МС применяли следующие настройки прибора (табл. 1).
Результаты и обсуждение
Концентрацию общего кобальта и витамина В12 измеряли у всех добровольцев до и в течение приема БАД, как у группы сравнения, принимавших 2500 мкг/сут кобаламина, так и у принимавших кобальт в дозе около 100 мкг/сут. Добровольцы не отмечали никаких побочных эффектов или изменений в состоянии здоровья в течение 20-дневного периода исследований. В качестве матрицы определения брали плазму крови, несмотря на то, что в плазме содержится меньшая концентрация кобальта, чем в моче. По данным литературы, после единичного внутривенного введения неорганического кобальта взрослым уже 40% элемента экскретируется с мочой в течение 6-12 ч и 70-75% в течение недели [2, 18, 37]. Ионы Со2+ в плазме связываются с альбуминами, период полувыведения которых составляет около 20 дней, что, по всей вероятности, может увеличить окно детекции [18, 38]. В нескольких научных работах приводятся данные, что фоновые концентрации кобальта в крови людей, не принимавших содержащих этот микроэлемент БАД или его солей, колеблются в диапазоне от 100 до 400 пг/мл [18, 39], однако могут меняться в зависимости от географического положения в сторону уменьшения. Медиана концентрации Co2+ в образцах плазмы участников данного исследования составила до приема 131,3 пг/мл, ближе к нижней границе приведенного интервала.
По некоторым данным, референсные значения витамина В12 в крови варьируют от 150 до 600 пг/мл [40] при регулярном сбалансированном питании, приводятся
данные, что концентрации свыше 300 пг/мл свидетельствуют об оптимальной обеспеченности [41]. В нашем исследовании не учитывался пол добровольцев, их индекс массы тела и регулярность приема пищи, что также могло повлиять на измеренные концентрации кобаламина [40, 42]. На уровни кобаламина также может влиять прием оральных контрацептивов у женщин [43]. Медиана концентрации витамина В12 в плазме крови до приема БАД была 287,2 пг/мл, т.е. все значения находились внутри референсного интервала.
В табл. 2 приведены данные об измеренных концентрациях витамина В12 до и в течение приема БАД. В процессе перорального приема 2500 мкг/сут кобаламина на 5-й день концентрация его в плазме добровольцев увеличилась в 3,1-3,6 раза, на 9-й день - в 4,9-5,4 раза, на 14-й день - в 5,9-7,2 раза и на 20-й день - в 6,58,4 раза. При этом концентрации общего кобальта в этих же образцах крови не увеличились даже в 1,5 раза, т.е. остались практически неизменными по отношению к уровню Со2+ до приема (изменения в 1,1-1,4 раза).
Таким образом, концентрация кобаламина в образцах плазмы крови участников исследований к 20-му дню приема комплекса, содержащего витамин В12, выросла в среднем в 7,5 раза (1847,1±122,6 пг/мл) по сравнению с исходными значениями (0 день).
В процессе перорального приема Со-содержащих БАД наблюдалась обратная картина. В табл. 3 приведены данные об измеренных концентрациях общего кобальта в плазме крови всех добровольцев до и в течение приема соответствующих БАД.
При пероральном приеме добровольцами кобальта в дозе около 100 мкг/сут его концентрация в плазме крови на 5-й день варьировала от 289,3 до 376,4 пг/мл в группе введения 2 и от 216,6 до 269,3 пг/мл в группе введения 1, на 20-й день - от 713,8 до 927,5 пг/мл и от 457,6 до 549,5 пг/мл соответственно. Таким образом, в первом случае содержание Со2+ в плазме к 20-му дню увеличилось в среднем в 6,7 раза от исходного значения 845,03±114,9 пг/мл (см. табл. 3, выделено полужирным), во втором случае в среднем в 4,0 раза -
Таблица 3. Концентрации общего кобальта в плазме крови добровольцев до (0-й день) и в процессе приема биологически активных добавок Table 3. Concentrations of total cobalt of volunteers before (day 0) and during the intake of dietary supplements
Доброволец, № Volunteer, N Концентрация общего кобальта Со2+, пг/мл / Total Со^+ concentration, pg/ml
0-й день / day 0 5-й день / day 5 9-й день / day 8 14-й день / day 14 20-й день / day 20
1 141,2 376,4 568,1 746,0 927,5
2 111,6 352,1 338,9 501,2 713,8
3 107,3 245,0 318,7 379,2 457,6
4 144,0 216,6 349,4 392,0 549,5
5 153,5 156,4 161,1 173,7 164,1
6 136,7 166,3 187,9 176,0 187,4
7 149,2 132,8 181,4 159,6 174,8
8 123,4 289,3 444,6 588,5 893,8
9 118,0 269,3 237,1 367,8 486,7
П р и м е ч а н и е. Добровольцы 3, 4 и 9 принимали биологически активную добавку с аспарагинатом кобальта (100 мкг/сут чистого элемента, выделено полужирным), добровольцы 1, 2 и 8 - биологически активную добавку с сульфатом кобальта (~ 100 мкг/сут чистого элемента, выделено курсивом).
N o t e. Volunteers 3, 4 and 9 consumed dietary supplement with cobalt asparaginate (100 yg/day in terms of pure cobalt) (highlighted in bold), volunteers 1, 2 and 8 - dietary supplement with cobalt sulfate heptahydrate (~ 100 yg/day in terms of pure cobalt) (highlighted in italic).
2000
i-g 1600
Л d.
П5 .2
its 1200
И I §
« CQ
iPs
о S
800
400
B12 2500 мкг / jg /Л
V ^ -—у
,у ---ft------ ----а----- . ____—•
—Хг—
5 9 14
Длительность приема БАД, дни Duration of adminisration, days
20
—•— Доброволец 1 / Volunteer 1 —-•— Доброволец 2 / Volunteer 2 —a— Доброволец 3 / Volunteer 3 —-»— Доброволец 4 / Volunteer 4 —•— Доброволец 5 / Volunteer 5 —о— Доброволец 6 / Volunteer 6 —о— Доброволец 7 / Volunteer 7
......о......Доброволец 8 / Volunteer 8
— -•— Доброволец 9 / Volunteer 9
Рис. 1. Изменение концентраций витамина В12 в плазме крови добровольцев в ходе приема биологически активных добавок (добровольцы 5, 6 и 7 принимали по 2500 мкг/сут витамина В12)
Fig. 1. Changes of the concentrations of vitamin B12 in the blood plasma of volunteers, when intaking dietary supplement (volunteers 5, 6 and 7 consumed vitamin B12 in the dose 2500 pg/day)
0
0
497,9±45,0 пг/мл (см. табл. 3, выделено курсивом) по сравнению с 0-м днем. При этом концентрации витамина В12 в образцах этих же добровольцев остались практически на исходном уровне к 20-му дню приема микроэлемента (увеличение составило в среднем 1,1 раза, см. табл. 2).
В ряде случаев у некоторых участников исследования наблюдалось некоторое незначительное снижение концентрации общего кобальта в течение приема БАД, например, у добровольцев 2 и 9 на 9-й день отбора крови. Такие колебания могут объясняться несколькими факторами. J. Edel с соавт. [44] и S.M. Morsy и соавт. [45] показали, что способ введения и количество вводимого кобальта сильно влияет на распределение и скорость выведения металла из организма. Кроме того, на уровни кобальта в плазме сильно влияет степень его абсорбции в желудочно-кишечном тракте, которая, по некоторым
данным, составляет около 25% от принимаемой дозы с большими индивидуальными вариациями от 5 до 97% [21, 46]. К.Я. Ра1еу и соавт. [47] продемонстрировали, что абсорбция элемента значительно возрастает после приема пищи, а также зависит от времени приема и растворимости соединения. L.O. 81топвеп и соавт. [48], основываясь на своих радиологических исследованиях, показали, что Со2+ может необратимо поглощаться эритроцитами крови с ограниченной скоростью, поэтому не исключено накопление элемента в плохо перфузируе-мых тканях, таких как костная или жировая. Эти факторы в нашей работе не учитывали, хотя все участники и принимали Со-содержащие БАД после приема пищи в одно и то же время.
На рис. 1 и 2 наглядно изображены графические зависимости концентраций витамина В12 и общего кобальта от количества дней приема вышеупомянутых БАД.
=1000
о га
<2 800 Л 600
■2 „о
400
200
о с о
ж / / / ...О' .о г____ ••"■" ---
_____5* Аспарагинат Asparaginate
=,---Т.п.
5 9 14
Длительность приема БАД, дни Duration of adminisration, days
20
-•—-Доброволец -*-•— Доброволец -*-•— Доброволец — Доброволец -•— Доброволец -о— Доброволец -о— Доброволец
-о......Доброволец
-•- — Доброволец
1 / Volunteer 1
2 / Volunteer 2
3 / Volunteer 3
4 / Volunteer 4
5 / Volunteer 5
6 / Volunteer 6
7 / Volunteer 7
8 / Volunteer 8
9 / Volunteer 9
Рис. 2. Изменение концентрации общего кобальта в плазме крови при приеме добровольцами 3, 4 и 9 кобальта в форме аспарагината и добровольцами 1, 2 и 8 - в форме сульфата по 100 мкг/сут
Fig. 2. Changes in the concentrations of total cobalt in blood plasma, when volunteers 3,4 and 9 consumed dietary supplement with cobalt asparaginate and volunteers 1,2 and 8 - with cobalt sulfate (100 pg/day in terms of pure cobalt)
0
Основываясь на полученных данных, можно сделать следующие выводы: при приеме кобаламина, разрешенного в спорте, в терапевтической дозе 2500 мкг/сут не происходит увеличения концентрации общего кобальта в плазме крови (в 1,1 раза от исходного значения на 20-й день приема), в то время как при потреблении БАД, содержащих соли Со2+, при неизменном уровне витамина В12 фиксируется увеличение концентрации микроэлемента в 4,0 раза при приеме аспарагината и в 6,7 раза в случае сульфата. Данный факт может выступать в качестве маркера злоупотребления соединениями кобальта в антидопинговом контроле. Немаловажным представляется регулярный мониторинг уровней витамина В12 и общего кобальта в крови спортсменов и включения этих показателей в программу гематологического модуля БПС [31]. При подозрительном увеличении в несколько раз концентрации Со2+ на фоне неизменного содержания кобаламина в качестве подтверждающего метода анализа может быть использован ВЭЖХ-ИСП-МС, позволяющий дифференцировать Со2+ от витамина В12 за счет различных времен удерживания (около 0,5 мин и 1,5 мин соответственно) [20], или метод ВЭЖХ-МС/МС [25], адаптированный для анализа плазмы крови. При
этом для подтверждающего испытания может также потребоваться отбор дополнительных образцов мочи спортсменов и проведение соответствующих процедур по методикам, предложенным авторами.
Заключение
Несмотря на то что на сегодняшний момент ВАДА пока не установлено пороговое значение для концентрации кобальта в плазме, количественное определение и сопоставление уровней витамин В12/общий кобальт может выступать в качестве важного маркера допинга Со2+. Исследование было ограничено приемом только 1 комплекса, содержащего витамин В12, и 2 популярных в России БАД, имеющих в составе соли кобальта. Отдельно следует отметить, что мониторинг концентраций витамин В12/Со2+ в долгосрочной перспективе, подобно отслеживанию гематологических параметров по программе БПС, позволит своевременно идентифицировать подозрительное увеличение содержания общего кобальта в крови спортсменов, что будет востребовано в рутинной практике современного антидопингового контроля.
Сведения об авторах
Постников Павел Викторович (Pavel V. Postnikov) - кандидат химических наук, начальник отдела допингового контроля Национальной антидопинговой лаборатории (Института) Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-3424-0582
Орджоникидзе Зураб Гивиевич (Zurab G. Ordzhonikidze) - заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор, главный внештатный специалист по спортивной медицине, первый заместитель директора ГАУЗ МНПЦ МРВСМ ДЗМ, (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-4623-0883
Бадтиева Виктория Асланбековна (Victoria A. Badtieva) - член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий филиалом № 1 ГАУЗ «ГАУЗ МНПЦ МРВСМ ДЗМ, профессор кафедры восстановительной медицины, реабилитации и курортологии Института клинической медицины им. Н.В. Склифосовского ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет) (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-4291-679X
Тюрин Игорь Александрович (Igor A. Turin) - генеральный директор ООО «Евроаналитика» (Москва, Российская
Федерация)
E-mail: [email protected]
https://orcid.org/0000-0002-4071-1099
Павлов Владимир Иванович (Vladimir I. Pavlov) - доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник, заведующий отделением функциональной диагностики ГАУЗ МНПЦ МРВСМ ДЗМ (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/00 00-0001-5131-7401
Литература
10.
12.
13.
14.
15.
16.
Robinson J.C., James G.W. III, Kark R.M. The effect of oral therapy 17. with cobaltous chloride on the blood of patients suffering with chronic suppurative infection // N. Engl. J. Med. 1949. Vol. 240. Abstr. 749. 18.
Ebert B., Jelkmann W. Intolerability of cobalt salt as erythropoietic agent // Drug Test. Anal. 2014. Vol. 6, N 3. P. 185-189. DOI: https://doi. 19. org/10.1002/dta.1528
Пронина И.В., Мочалова Е.С., Ефимова Ю.А., Постников П.В. Биологические функции кобальта, токсикология и обнаружение в антидопинговом контроле // Тонкие химические технологии. 20. 2021. Т. 16, № 4. С. 318-336. DOI: https://doi.org/10.32362/2410-6593-2021-16-4-318-336
Beuck S., Schanzer W., Thevis M. Hypoxia-inducible factor stabilizers and other small-molecule erythropoiesis-stimulating agents in current and preventive doping analysis // Drug Test. Anal. 2012. Vol. 4, N 11. 21. 830-845. DOI: https://doi.org/10.1002/dta.390
Dery M.-A.C., Michaud M.D., Richard D.E. Hypoxia-inducible factor 1: regulation by hypoxic and non-hypoxic activators // Int. J. Bio-chem. Cell Biol. 2005. Vol. 37. 535-540. DOI: https://doi.org/10.1016/j. 22. biocel.2004.08.012
Hoffmeister T., Schwenke D., Wachsmuth N., Krug O., Thevis M., Byrnes W.C., Schmidt W.F.J. Erythropoietic effects of low-dose cobalt application // Drug Test. Anal. 2019. Vol. 11, N 2. P. 200-207. DOI: 23. https://doi.org/10.1002/dta.2478
Krug O., Kutscher D., Piper T., Geyer H., Schanzer W., Thevis M. Quantifying cobalt in doping control urine samples - a pilot study // Drug Test. Anal. 2014. Vol. 6, N 11-12. P. 1186-1190. DOI: https://doi. org/10.1002/dta.1694 24.
Lippi G., Franchini M., Guidi G.C. Cobalt chloride administration in athletes: a new perspective in blood doping? // Br. J. Sports Med. 2005. 25. Vol. 39, N 11. P. 872-873. https://doi.org/10.1136/bjsm.2005.019232 Jelkmann W. Efficacy of recombinant erythropoietins: Is there unity of international units? // Nephrol. Dial. Transplant. 2009. Vol. 24, N 5. P. 1366-1368. DOI: https://doi.org/10.1093/ndt/gfp058 26.
Finley B.L., Monnot A.D., Paustenbach D.J., Gaffney S.H. Derivation of a chronic oral reference dose for cobalt // Regul. Toxicol. Pharmacol. 2012. Vol. 64, N 3. P. 491-503. DOI: https://doi.org/10.1016/j. yrtph.2012.08.022
Kriss J.P., Carnes W.H., Gross R.T. Hypothyroidism and thyroid 27. hyperplasia in patients treated with cobalt // JAMA. 1955. Vol. 157, N 2. P. 117-121. DOI: https://doi.org/10.1001/jama.1955.02950190017004 Catlin D.H., Hatton C.K., Lasne F. Abuse of recombinant erythropoi-etins by athletes // Erythropoietins and Erythropoiesis: Molecular, Cellular, Preclinical, and Clinical Biology / eds G. Molineux, M.A. Foote, 28. S.G. Elliott. Basel, 2006. P. 205-227. DOI: https://doi.org/10.1007/3-7643-7543-4_13
Запрещенный список Всемирного антидопингового агентства [Электронный ресурс]. URL: http://www.rusathletics.com/img/ 29. files/docs/ant/prohibited_list_2015.pdf (дата обращения 10.08.2022) Ho E.N.M., Chan G.H.M., Wan T.S.M., Curl P., Riggs C.M., Hurley M.J. et al. Controlling the misuse of cobalt in horses // Drug Test. Anal. 2015. Vol. 7, N 1. P. 21-30. DOI: http://doi.wiley. 30. com/10.1002/dta.1719
Jelkmann W. The disparate roles of cobalt in erythropoiesis, and doping relevance // Open J. Hematol. 2012. Vol. 3. P. 1-9. DOI: https://doi. org/10.13055/OJHMT_3_1_6.121211 31.
Попова А.Ю., Тутельян В.А., Никитюк Д.Б. О новых (2021) Нормах физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации // Вопросы питания. 2021. Т 90, № 4. С. 6-19. DOI: https://doi. 32. org/10.33029/0042-8833-2021-90-4-6-19
Перекатова Т.Н., Остроумова М.Н. Еще раз о дефиците витамина В12 // Клиническая онкогематология. 2009. Т. 2, № 2. С. 185—195. URL: https://ods.od.nih.gov/factsheets/VitaminB12-HealthProfes-sional/
Bor V.M., Lydeking-Olsen E., Moller J., Nexo E. A daily intake of approximately 6 [ig vitamin B-12 appears to saturate all the vitamin B-12-related variables in Danish postmenopausal women // Am. J. Clin. Nutr. 2006. Vol. 83, N 1. P. 52-58. DOI: https://doi.org/10.1093/ajcn/83.L52 Dressler J., Storz M.A., Müller C., Kandil F.I., Kessler C.S., Michal-sen A. et al. Does a plant-based diet stand out for its favorable composition for heart health? Dietary intake data from a randomized controlled trial // Nutrients. 2022. Vol. 14, N 21. Abstr. 4597. DOI: https://doi. org/10.3390/nu14214597
Darand M., Hassanizadeh S., Martami F., Shams-Rad S., Mirzaei M., Hosseinzadeh M. The association between B vitamins and the risk of COVID-19 // Br. J. Nutr. 2022. Nov 9. P. 1-26. DOI: https://doi. org/10.1017/S0007114522003075
Thevis M., Krug O., Piper T., Geyer H., Schanzer W. Solutions advertised as erythropoiesis-stimulating products were found to contain undeclared cobalt and nickel species // Int. J. Sports Med. 2016. Vol. 37, N 1. P. 82-84. DOI: https://doi.org/10.1055/s-0035-1569350 Tvermoes B.E., Finley B.L., Unice K.M., Otani J.M., Paustenbach D.J., Galbraith D.A. Cobalt whole blood concentrations in healthy adult male volunteers following two-weeks of ingesting a cobalt supplement // Food Chem. Toxicol. 2013. Vol. 53. P. 432-439. DOI: https://doi. org/10.1016/j.fct.2012.11.033
Taylor A., Marks V. Cobalt: a review // J. Hum. Nutr. 1978. Vol. 32, N 3. P. 165-177. DOI: https://doi.org/10.3109/09637487809144525 Knoop A., Görgens C., Geyer H., Thevis M. Elevated urinary cobalt concentrations identified in routine doping controls can originate from vitamin B12 // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2020. Vol. 34, N 7. Abstr. e8649. DOI: https://doi.org/10.1002/rcm.8649 Hillyer L.L., Ridd Z., Fenwick S., Hincks P., Paine S.W. Pharma-cokinetics of inorganic cobalt and a vitamin B12 supplement in the Thoroughbred horse: differentiating cobalt abuse from supplementation // Equine Vet. J. 2018. Vol. 50, N 3. P. 343-349. DOI: https://doi. org/10.1111/evj.12774
Sobolevsky T., Ahrens B. Measurement of urinary cobalt as its complex with 2-(5-chloro-2-pyridylazo)-5-diethylaminophenol by liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the purpose of antidoping control // Drug Test. Anal. 2021. Vol. 13, N 6. P. 1145-1157. DOI: https://doi.org/10.1002/dta.3004
Minakata K., Suzuki M., Suzuki O. Application of electrospray ion-ization tandem mass spectrometry for the rapid and sensitive determination of cobalt in urine // Anal. Chim. Acta. 2008. Vol. 614, N 2. P. 161-164. DOI: https://doi.org/10.1016/j.aca.2008.03.043 Wenzel R., Major D., Hesp K., Doble P. Determination of vitamin B12 in equine urine by liquid chromatography - inductively coupled -plasma mass spectrometry // J. Trace Elem. Med. Biol. 2018. Vol. 50. P. 634-639. DOI: https://doi.org/10.1016/jotemb.2018.05.005 Knoop A., Planitz P., Wüst B., Thevis M. Analysis of cobalt for human sports drug testing purposes using ICP- and LC-ICP-MS // Drug Test. Anal. 2020. Vol. 12. P. 1666-1672. DOI: https://doi.org/10.1002/ dta.2962
Popot M.A., Ho E.N.M., Stojiljkovic N., Bagilet F., Remy P., Maciejew-ski P. et al. Interlaboratory trial for the measurement of total cobalt in equine urine and plasma by ICP-MS // Drug Test. Anal. 2017. Vol. 9. P. 1400-1406. DOI: https://doi.org/10.1002/dta.2191 Hoffmeister T., Schwenke D., Krug O., Wachsmuth N., Geyer H., The-vis M. et al. Effects of 3 weeks of oral low-dose cobalt on hemoglobin
4.
5
7.
8
mass and aerobic performance // Front. Physiol. 2018. Vol. 9. Absr. 1289. DOI: https://doi.org/10.3389/fphys.2018.01289
33. Руководство ВАДА по биологическому паспорту спортсмена 41. [Электронный ресурс]. URL: https://www.wada-ama.org/sites/ default/files/resources/files/guidelines_abp_v8_final.pdf (дата обращения: 15.08.2022)
34. Хельсинкская декларация Всемирной медицинской ассоциации [Электронный ресурс]. URL: http://acto-russia.org/index. php?option=com_content&task=view&id=21 (дата: обращения 42. 15.08.2022)
35. Международный стандарт для лабораторий [Электронный ресурс]. URL: https://www.wada-ama.org/sites/default/files/resourc- 43. es/files/isl_2021.pdf (дата обращения: 24 апреля 2022)
36. Инструкция к набору для иммунохемилюминесцентного определения витамина В12 [Электронный ресурс]. URL: https:// www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf15/K151786.pdf (дата обращения: 06.06.2022) 44.
37. Smith T., Edmonds C.J., Barnaby C.F. Absorption and retention of cobalt in man by whole-body counting // Health Phys. 1972. Vol. 22,
N 4. P. 359-367. DOI: https://doi.org/10.1097/00004032-197204000- 45. 00007
38. Coverdale J.P.C., Katundu K.G.H., Sobczak A.I.S., Arya S., Blindauer C.A., Stewart A.J. Ischemia-modified albumin: crosstalk between 46. fatty acid and cobalt binding // Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 2018. Vol. 135. P. 147-157. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.plefa.2018.07.014
39. Ramos P., Pinto E., Santos A., Almeida A. Reference values for trace element levels in the human brain: a systematic review of the literature // 47. J. Trace Elem. Med. Biol. 2021. Vol. 66. Article ID 126745. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.jtemb.2021.126745 48.
40. Baart A.M., Balvers M.G.J., de Vries J.H.M., Ten Haaf D.S.M., Hop-man M.T.E., Klein Gunnewiek J.M.T. Relationship between intake and plasma concentrations of vitamin B12 and folate in 873 adults with a
physically active lifestyle: a cross-sectional study // J. Hum. Nutr. Diet. 2021. Vol. 34, N 2. P. 324-333. DOI: https://doi.org/10.1111/jhn.12814 Strohle A., Richter M., Gonzalez-Gross M., Neuhauser-Berthold M., Wagner K.H., Leschik-Bonnet E. et al.; German Nutrition Society (DGE). The revised D-A-CH-reference values for the intake of vitamin B^: prevention of deficiency and beyond // Mol. Nutr. Food Res. 2019. Vol. 63, N 6. Article ID e1801178. DOI: https://doi.org/10.1002/ mnfr.201801178
Weggemans R.M., de Groot L.C., Haller J. Factors related to plasma folate and vitamin Bn. The SENECA study // Int. J. Food Sci. Nutr. 1997. Vol. 48. P. 141-150. DOI: https://doi.org/10.3109/09637489709006974 Susanna F., Zighetti M.L., Bucciarelli P., Cugno M., Cattaneo M. Blood levels of homocysteine, folate, vitamin B6 and B12 in women using oral contraceptives compared to non-users // Thromb. Res. 2003. Vol. 112. P. 37-41. DOI: https://doi.org/10.1016/j.thromres.2003. 11.007
Edel J., Pozzi G., Sabbioni E., Pietra R., Devos S. Metabolic and toxi-cological studies on cobalt // Sci. Total Environ. 1994. Vol. 150, N 1-3. P. 233-244. DOI: https://doi.org/10.1016/0048-9697(94)90159-7 Morsy S.M., el-Assaly F.M. Body elimination rates of 134CS, 60Co and 203Hg // Health Phys. 1970. Vol. 19. P. 769-773. DOI: https://doi. org/10.1097/00004032-197012000-00007
Christensen J.M., Poulsen O.M., Thomsen M. A short-term cross-over study on oral administration of soluble and insoluble cobalt compounds: sex differences in biological levels // Int. Arch. Occup. Environ. Health. 1993. Vol. 65. P. 233-240. DOI: https://doi.org/10.1007/ BF00381196
Paley K.R., Sussman E.S. Absorption of radioactive cobaltous chloride in human subjects // Metabolism. 1963. Vol. 12. P. 975-982. Simonsen L.O., Brown A.M., Harbak H., Kristensen B., Bennekou P. Cobalt uptake and binding in human red blood cells // Blood Cells Mol. Dis. 2011. Vol. 46, N 4. P. 266-276. DOI: https://doi.org/10.1016/j. bcmd.2011.02.009
References
1. Robinson J.C., James G.W. III, Kark R.M. The effect of oral therapy with cobaltous chloride on the blood of patients suffering with chronic suppurative infection. N Engl J Med. 1949; 240: 749.
2. Ebert B., Jelkmann W. Intolerability of cobalt salt as erythropoietic agent. Drug Test Anal. 2014; 6 (3): 185-9. DOI: https://doi.org/10.1002/ dta.1528
3. Pronina I.V., Mochalova E.S., Efimova Yu.A., Postnikov P.V. Biological functions of cobalt and its toxicology and detection in anti-doping control. Tonkie khimicheskie telhnologii [Fine Chemical Technologies]. 2021; 16 (4): 318-36. DOI: https://doi.org/10.32362/2410-6593-2021-16-4-318-336 (in Russian)
4. Beuck S., Schanzer W., Thevis M. Hypoxia-inducible factor stabilizers and other small-molecule erythropoiesis-stimulating agents in current and preventive doping analysis. Drug Test Anal. 2012; 4 (11): 830-45. DOI: https://doi.org/10.1002/dta.390
5. Dery M.-A.C., Michaud M.D., Richard D.E. Hypoxia-inducible factor 1: regulation by hypoxic and non-hypoxic activators. Int J Biochem Cell Biol. 2005; 37: 535-40. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.biocel.2004.08.012
6. Hoffmeister T., Schwenke D., Wachsmuth N., Krug O., Thevis M., Byrnes W.C., Schmidt W.F.J. Erythropoietic effects of low-dose cobalt application. Drug Test Anal. 2019; 11 (2): 200-7. DOI: https://doi. org/10.1002/dta.2478
7. Krug O., Kutscher D., Piper T., Geyer H., Schanzer W., Thevis M. Quantifying cobalt in doping control urine samples - a pilot study. Drug Test Anal. 2014; 6 (11-12): 1186-90. DOI: https://doi.org/10.1002/ dta.1694
8. Lippi G., Franchini M., Guidi G.C. Cobalt chloride administration in athletes: a new perspective in blood doping? Br J Sports Med. 2005; 39 (11): 872-3. https://doi.org/10.1136/bjsm.2005.019232
9. Jelkmann W. Efficacy of recombinant erythropoietins: Is there unity of international units? Nephrol Dial Transplant. 2009; 24 (5): 1366-8. DOI: https://doi.org/10.1093/ndt/gfp058
10. Finley B.L., Monnot A.D., Paustenbach D.J., Gaffney S.H. Derivation of a chronic oral reference dose for cobalt. Regul Toxicol Pharmacol. 2012; 64 (3): 491-503. DOI: https://doi.org/10.1016Zj.yrtph.2012.08.022
11. Kriss J.P., Carnes W.H., Gross R.T. Hypothyroidism and thyroid hyperplasia in patients treated with cobalt. JAMA. 1955; 157 (2): 117-21. DOI: https://doi.org/10.1001/jama.1955.02950190017004
12. Catlin D.H., Hatton C.K., Lasne F. Abuse of recombinant erythropoie-tins by athletes. In: G. Molineux, M.A. Foote, S.G. Elliott (eds). Eryth-ropoietins and Erythropoiesis: Molecular, Cellular, Preclinical, and Clinical Biology. Basel, 2006: 205-27. DOI: https://doi.org/10.1007/3-7643-7543-4 13
13. The World Anti-Doping Agency's Prohibited List [Electronic resource]. URL: http://www.rusathletics.com/img/files/docs/ant/prohibited_ list_2015.pdf (date of access August 10, 2022) (in Russian)
14. Ho E.N.M., Chan G.H.M., Wan T.S.M., Curl P., Riggs C.M., Hurley M.J., et al. Controlling the misuse of cobalt in horses. Drug Test Anal. 2015; 7 (1): 21-30. DOI: http://doi.wiley.com/10.1002/dta.1719
15. Jelkmann W. The disparate roles of cobalt in erythropoiesis, and doping relevance. Open J Hematol. 2012; 3: 1-9. DOI: https://doi. org/10.13055/0JHMT_3_1_6.121211
16. Popova A.Yu., Tutelyan V.A., Nikityuk D.B. On the new (2021) Norms of physiological requirements in energy and nutrients of various groups of the population of the Russian Federation. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2021; 90 (4): 6-19. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-4-6-19 (in Russian)
17. Perekatova T., Ostroumova M. Once again on the deficiency of vitamin Bj2. Klinicheskaya onkogematologiya [Clinical Oncohematology]. 2009; 2 (2): 185-95. (in Russian)
18. URL: https://ods.od.nih.gov/factsheets/VitaminB12-HealthProfes-sional/
19. Bor V.M., Lydeking-Olsen E., Moller J., Nexo E. A daily intake of approximately 6 |g vitamin B-12 appears to saturate all the vitamin B-12-related variables in Danish postmenopausal women. Am J Clin Nutr. 2006; 83 (1): 52-8. DOI: https://doi.org/10.1093/ajcn/ 83.1.52
20. Dressler J., Storz M.A., Müller C., Kandil F.I., Kessler C.S., Michal-sen A., et al. Does a plant-based diet stand out for its favorable composition for heart health? Dietary intake data from a randomized controlled trial. Nutrients. 2022; 14 (21): 4597. DOI: https://doi.org/10.3390/ nu14214597
21. Darand M., Hassanizadeh S., Martami F., Shams-Rad S., Mirzaei M., Hosseinzadeh M. The association between B vitamins and the risk of COVID-19. Br J Nutr. 2022; Nov 9: 1-26. DOI: https://doi.org/10.1017/ S0007114522003075
22. Thevis M., Krug O., Piper T., Geyer H., Schanzer W. Solutions advertised as erythropoiesis-stimulating products were found to contain undeclared cobalt and nickel species. Int J Sports Med. 2016; 37 (1): 82-4. DOI: https://doi.org/10.1055/s-0035-1569350
23. Tvermoes B.E., Finley B.L., Unice K.M., Otani J.M., Paustenbach D.J., Galbraith D. A. Cobalt whole blood concentrations in healthy adult male volunteers following two-weeks of ingesting a cobalt supplement. Food Chem Toxicol. 2013; 53: 432-9. DOI: https://doi.org/10.1016/. fct.2012.11.033
24. Taylor A., Marks V. Cobalt: a review. J Hum Nutr. 1978; 32 (3): 165-77. DOI: https://doi.org/10.3109/09637487809144525
25. Knoop A., Görgens C., Geyer H., Thevis M. Elevated urinary cobalt 37. concentrations identified in routine doping controls can originate from vitamin B12. Rapid Commun Mass Spectrom. 2020; 34 (7): e8649. DOI: https://doi.org/10.1002/rcm.8649
26. Hillyer L.L., Ridd Z., Fenwick S., Hincks P., Paine S.W. Pharmaco- 38. kinetics of inorganic cobalt and a vitamin B12 supplement in the Thoroughbred horse: differentiating cobalt abuse from supplementation. Equine Vet J. 2018; 50 (3): 343-9. DOI: https://doi.org/10.1111/ evj.12774 39.
27. Sobolevsky T., Ahrens B. Measurement of urinary cobalt as its complex with 2-(5-chloro-2-pyridylazo)-5-diethylaminophenol by liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the purpose of antidoping control. Drug Test Anal. 2021; 13 (6): 1145-57. DOI: https://doi. 40. org/10.1002/dta.3004
28. Minakata K., Suzuki M., Suzuki O. Application of electrospray ioniza-tion tandem mass spectrometry for the rapid and sensitive determination of cobalt in urine. Anal Chim Acta. 2008; 614 (2): 161-4. DOI: https://doi.org/10.1016/j.aca.2008.03.043 41.
29. Wenzel R., Major D., Hesp K., Doble P. Determination of vitamin B12 in equine urine by liquid chromatography - inductively coupled -plasma mass spectrometry. J Trace Elem Med Biol. 2018; 50: 634-9. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jtemb.2018.05.005
30. Knoop A., Planitz P., Wüst B., Thevis M. Analysis of cobalt for human 42. sports drug testing purposes using ICP- and LC-ICP-MS. Drug Test Anal. 2020; 12: 1666-72. DOI: https://doi.org/10.1002/dta.2962
31. Popot M.A., Ho E.N.M., Stojiljkovic N., Bagilet F., Remy P., Maciejew- 43. ski P., et al. Interlaboratory trial for the measurement of total cobalt in equine urine and plasma by ICP-MS. Drug Test Anal. 2017; 9: 1400-6. DOI: https://doi.org/10.1002/dta.2191
32. Hoffmeister T., Schwenke D., Krug O., Wachsmuth N., Geyer H., The- 44. vis M., et al. Effects of 3 weeks of oral low-dose cobalt on hemoglobin mass and aerobic performance. Front Physiol. 2018; 9: 1289. DOI: https://doi.org/10.3389/fphys.2018.01289 45.
33. WADA Athlete Biological Passport Operating Guidelines [Electronic resource]. URL: https://www.wada-ama.org/sites/default/files/resourc-es/files/guidelines_abp_v8_final.pdf (date of access August 15, 2022) 46.
34. WMA Declaration of Helsinki [Electronic resource]. URL: http://acto-russia.org/index.php?option=com_content&task=view&id=21 (date of access August 15, 2022) (in Russian)
35. International Standard for Laboratories (ISL) [Electronic resource]. 47. URL: https://www.wada-ama.org/sites/default/files/resources/files/ isl_2021.pdf (date of access April 24, 2022) 48.
36. Elecsys Vitamin B12 II Assay, Elecsys Vitamin B12 II CalSet [Electronic resource]. URL: https://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/ pdf15/K151786.pdf (date of access June 06, 2022)
Smith T., Edmonds C.J., Barnaby C.F. Absorption and retention of cobalt in man by whole-body counting. Health Phys. 1972; 22 (4): 359-67. DOI: https://doi.org/10.1097/00004032-197204000-00007
Coverdale J.P.C., Katundu K.G.H., Sobczak A.I.S., Arya S., Blindauer C.A., Stewart A.J. Ischemia-modified albumin: crosstalk between fatty acid and cobalt binding. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 2018; 135: 147-57. DOI: https://doi.org/10.1016/j.plefa.2018.07.014 Ramos P., Pinto E., Santos A., Almeida A. Reference values for trace element levels in the human brain: a systematic review of the literature. J Trace Elem Med Biol. 2021; 66: 126745. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.jtemb.2021.126745
Baart A.M., Balvers M.G.J., de Vries J.H.M., Ten Haaf D.S.M., Hop-man M.T.E., Klein Gunnewiek J.M.T. Relationship between intake and plasma concentrations of vitamin B12 and folate in 873 adults with a physically active lifestyle: a cross-sectional study. J Hum Nutr Diet. 2021; 34 (2): 324-33. DOI: https://doi.org/10.1111/jhn.12814 Ströhle A., Richter M., Gonzälez-Gross M., Neuhäuser-Berthold M., Wagner K.H., Leschik-Bonnet E., et al.; German Nutrition Society (DGE). The revised D-A-CH-reference values for the intake of vitamin B12: prevention of deficiency and beyond. Mol Nutr Food Res. 2019; 63 (6): e1801178. DOI: https://doi.org/10.1002/mnfr.201801178 Weggemans R.M., de Groot L.C., Haller J. Factors related to plasma folate and vitamin B12. The SENECA study. Int J Food Sci Nutr. 1997; 48: 141-50. DOI: https://doi.org/10.3109/09637489709006974 Susanna F., Zighetti M.L., Bucciarelli P., Cugno M., Cattaneo M. Blood levels of homocysteine, folate, vitamin B6 and B12 in women using oral contraceptives compared to non-users. Thromb Res. 2003; 112: 37-41. DOI: https://doi.org/10.1016/j.thromres.2003.11.007 Edel J., Pozzi G., Sabbioni E., Pietra R., Devos S. Metabolic and toxi-cological studies on cobalt. Sci Total Environ. 1994; 150 (1-3): 233-44. DOI: https://doi.org/10.1016/0048-9697(94)90159-7 Morsy S.M., el-Assaly F.M. Body elimination rates of 134CS, 60Co and 203Hg. Health Phys. 1970; 19: 769-73. DOI: https://doi. org/10.1097/00004032-197012000-00007
Christensen J.M., Poulsen O.M., Thomsen M. A short-term cross-over
study on oral administration of soluble and insoluble cobalt compounds:
sex differences in biological levels. Int Arch Occup Environ Health.
1993; 65: 233-40. DOI: https://doi.org/10.1007/BF00381196
Paley K.R., Sussman E.S. Absorption of radioactive cobaltous chloride
in human subjects. Metabolism. 1963; 12: 975-82.
Simonsen L.O., Brown A.M., Harbak H., Kristensen B., Bennekou P.
Cobalt uptake and binding in human red blood cells. Blood Cells Mol
Dis. 2011; 46 (4): 266-76. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bcmd.2011.
02.009
