CC BY
29
КЛ1Н1ЧНА ТА ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА МЕДИЦИНА
© Багацкая Н. В., Медзяновская Е. В. УДК 576. 316:616. 72 - 002 - 053. 21. 5 Багацкая Н. В., Медзяновская Е. В.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИММУНОРЕАКТИВНОСТИ ОРГАНИЗМА ДЕТЕЙ И
ПОДРОСТКОВ, БОЛЬНЫХ ЮВЕНИЛЬНЫМ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ
ГУ «Институт охраны здоровья детей и подростков НАМН Украины»
(г. Харьков)
Данная работа является фрагментом комплексной НИР ГУ «ИОЗДП НАМН» «Вивчити ктычний полiморфiзм ювентьного ревматощного артриту та розробити критерп ранньо! дiагностики i прогноз переб^у захворювання», № гос. регистрации 01411001020, шифр НАМН 77/14, 2014-2016 гг. .
Вступление. Известно, что ядрышкообразую-щими районами (ЯОР) являются участки коротких плеч 5 пар акроцентрических хромосом (АХ) человека (13, 14, 15, 21, 22); в этих районах локализованы кластеры рибосомных генов [2]. В период интерфазы ЯОР АХ объединяются в одно или несколько ядрышек, где происходит синтез рРНК. Из рРНК и белка формируются рибосомы - белоксинтезиру-ющий аппарат, от возможностей которого зависит адаптивный ответ клетки [4].
Благодаря ядрышкообразующей функции АХ феномен ассоциаций акроцентрических хромосом (ААХ) стал активно изучаться многими учеными. Так как в ЯОР АХ локализованы кластеры рибосомных генов, а продукты транскрипции этих генов арген-тофильны, это явилось основанием для разработки метода селективной окраски препаратов хромосом солями серебра [5], что позволило количественно оценить активность генов рРНК. Была установлена прямая корреляция между способностью АХ вступать в ассоциации и окрашивать ЯОР АХ солями серебра.
Лимфоциты периферической крови (ЛПК) человека - это иммунные клетки, которые специфически реагируют на любой антигенный стимул и являются удобной моделью, позволяющей оценить иммунное состояние организма. По частоте возникновения ассоциаций АХ в ЛПК можно судить о пролифера-тивной активности и миграции лимфоцитов в ответ на антигенный стимул [9]. В норме у человека превалируют клетки без ассоциаций АХ и с двумя ААХ. Это делящиеся лимфоциты, в которых ассоциации разрушаются в процессе движения хромосом при митозе. Они составляют активный пул клеток организма и отношение этих клеток к остальным
обозначается как показатель КЛ0+2. Лимфоциты с большим количеством хромосом, вступающих в ассоциацию (КЛ+10), в норме встречаются крайне редко, так они являются интактными и длительно рециркулирующими. Поэтому, по соотношению активно делящихся и интактных лимфоцитов можно судить о функциональном состоянии иммунной системы человека. Показатель КЛ0+2 используется для оценки иммунореактивности ЛПК, активированных в организме человека, при различных нарушениях со стороны иммунной системы [7]. Преимущественно это касается аутоиммунных заболеваний, при которых существует необходимость постоянного контроля за состоянием иммунной системы пациентов. Одним из таких заболеваний является ювенильный ревматоидный артрит (ЮРА), который относится к группе аутоиммунных заболеваний с неясной этиологией и сложным патогенезом [1]. Течение ЮРА характеризуется преимущественным поражением суставов в виде воспаления синовиальных оболочек, деструкцией хрящевой и костной тканей, нередко в патологический процесс вовлекаются внутренние органы. Заболевание может начинаться в раннем возрасте (до 16 лет) и нередко приводит к инвали-дизации [8].
Вышеизложенное и обусловило необходимость проведения цитогенетического анализа у пробан-дов, больных ЮРА, с определением частоты ААХ как показателя функционального состояния иммунной системы и ответной реакции организма на воздействие мутагенных факторов.
Цель исследования. Определить частоту КЛ0+2 на основании изучения ассоциативной способности акроцентрических хромосом в ЛПК у детей и подростков, больных ЮРА.
Объект и методы исследования. Цитогене-тический анализ проведен у 80 детей обоего пола, больных ЮРА, в возрасте от 5 до 17 лет, обследованных в ГУ «ИОЗДП НАМН». В исследовании приняли участие 52 (65 %) девочки и 38 (35 %) мальчиков, причем соотношение больных девочек и мальчиков
соответствует популяционной частоте заболевания (2:1) [10]. Определение частоты ААХ проводилось у больных ЮРА двух возрастных групп: 5-11 лет - 46 (57,5 %) человек и 12-17 лет - 34 (42,5 %) человека.
Культивирование ЛПК осуществлялось по стандартной схеме [6, 11] с использованием фитоге-магглютинина ("Sigma", Германия), смешанным с питательной средой RPMI 1640 и эмбриональной телячьей сывороткой в течение 72 часов при t +37°C. Остановку митозов проводили на 70-м часу культивирования внесением в смесь колхицина в концентрации 0,1 мкг/мл. Гипотенизацию осуществляли KCl (0,075 М) в течение 12 минут; фиксацию - смесью этанола и ледяной уксусной кислоты (3:1). Клеточную суспензию раскапывали на мокрые охлажденные предметные стекла. Готовые препараты окрашивали гомогенно красителем Гимза.
Анализировали по 100 метафазных пластинок у каждого пациента с определением частоты ААХ. Ассоциацией считали такое расположение АХ, когда их короткие плечи были взаимно ориентированы и примыкали друг к другу или находились на расстоянии, не превышающем диаметра хроматиды. Из всех АХ, которые вступали в ассоциацию, анализировали метафазные пластинки без ассоциаций и с
двумя ассоциирующими акроцентриками (КЛ0+2):
,
где n - число проанализированных клеток.
Всего у больных ЮРА проанализировано 8000 метафазных пластинок на бинокулярном микроскопе Leica CME (Австрия), окуляр 10х18, объектив 100х, бинокулярная насадка 1,25х.
Статистические расчеты выполнены на PC с использованием прикладного пакета программ Excel. Для выявления значимости различий между использовали критерий Стьюдента [2].
Результаты исследований и их обсуждение. Для определения иммунореактивности организма больных ЮРА проводили цитогенетический анализ с оценкой ассоциативной способности АХ. У всех обследованных кариотип соответствовал нормальному женскому - 46, ХХ или мужскому - 46, XY
У больных ЮРА ассоциации АХ определялись в 5120 клетках, что составило 64,0 %, популяция циркулирующих лимфоцитов была представлена 8-ю классами (от КЛ2 до КЛ9). Чаще всего встречались ассоциации, состоящие из 2-х (31,9 %) и 4-х (14,7 %) АХ. Ассоциации, состоящие из 3-х АХ, встречались реже (7,5 %), чем из 2-х (p < 0,001) и 4-х (p < 0,05), следовательно, распределение классов лимфоцитов с различным числом ААХ не соответствовало нормальному (рис.).
Такая асимметрия графика распределения числа ассоциирующих АХ на клетку объясняется увеличением частоты КЛ2 (31,9 %). Более частое определение классов лимфоцитов с двумя ассоциирующими АХ можно объяснить тем, что ассоциации АХ являются следствием слияния гомологичного ядрыш-кового материала в интерфазном ядре, поэтому
WJM.
и
ш
ш 14,7
JH S3
Щ рщ 3.3
ЙМ я и ¡¡и 1,0 0,3 0,02
Рис. Гистограмма распределения лимфоцитов с
различным числом ассоциирующих АХубольных ЮРА,%.
большинство ассоциирующих групп состоит из 2-х ААХ. При слиянии ядрышек между ЯОР акроцентри-ков устанамливается связь, состоящая из белковых, РНК-ковых, ДНК-ковых нитей, причем она прочнее при ассоциаци и двух или трех, но не более хро мо-сом. С увмличением числа АХ, вступающих в ассоциации, наблюдается постепенное снижение ихча-стоты [9].
ЕВ целом у больных ЮРА уровень КЛ0+2 составил 33,8%; ми нимальное значение КЛ0+2 достигало 20,5 %, максимальное значение - 48-,5 %; у 12 больныхуровень КЛ0+2 превышал 4-0,0 %. По данным А. К. Фролова [93- уровень КЛ0+2у здоровых детей 5 - 15 лет составлял 38,0 %, что значимо превышало у ровень КЛ0+2 у больных ЮРА (р < 0,01).
Согласно литературным данным, у здоровых лиц различного возраста частота активированных лимфоцитов в периферической крови существенно варьирует. У детей частота КЛ0+2 значительно выше (38,0 %), чем у взрослых лиц (26,0 %). Это связано с тем, что организм детей чаще сталкивается с новыми для него антигенами, а также продолжающимся морфогенезом лимфоидной и нелимфоидной тканей, в основе которого лежит митотическая пролиферация клеток [9]. По нашим данным, при сравнении уровня КЛ0+2 у детей младшей (34,7 ± 1,05 %) и старшей (32,9 ± 1,2 %) возрастных подгрупп значимых различий не установлено (р > 0,05). Возможно, что у больных ЮРА пролиферативная способность ЛПК зависит от целого комплекса факторов: длительности и активности патологического процесса, формы заболевания, количества пораженных суставов, а также применения медикаментозных п ре п а рато в.
Анализируя ассоциативную способность АХ в ЛПК у лиц обоего пола, установили, что и у девочек и у мальчиков с ЮРА ААХ присутствовали в 64,0 % клеток, а популяция лимфоцитов была представлена 8-ю классами (от КЛ2 до КЛ9). Чаще всего в обеих группах определялись метафазные пластинки с двумя (КЛ2), тремя (КЛ3) и четырьмя (КЛ4) АХ. Достоверных различий в уровне КЛ0+2 в группе мальчиков (34,8 %) и девочек (33,7 %) не обнаружено (р > 0,05).
Выводы. У больных ЮРА средний уровень КЛ0+2 составил 33,8 %; минимальное значение КЛ0+2 -20,5 %, максимальное значение - 48,5 %; у 12-ти больных уровень КЛ0+2 превышал 40,0 %. У детей и
подростков, больных ЮРА, установлено уменьше- Перспективы дальнейших исследований.
ние уровня КЛ0+2 в сравнении со здоровыми детьми, Планируется дальнейший анализ ассоциативной
что свидетельствует о снижении пролиферативной способности акроцентрических хромосом у боль-
способности ЛПК, а, следовательно, и иммунореак- ных ЮРА в зависимости от отягощенной наслед-
тивности организма, которая не изменялась у дево- ственности по ревматическим болезням, формы и
чек и мальчиков различного возраста. прогрессирования заболевания.
Литература
1. Алексеева Е. И. Ювенильный ревматоидный артрит: этиология, патогенез, клиника, алгоритмы диагностики и лечения / Е. И. Алексеева, П. Ф. Литвицкий : рук. для врачей, преподавателей, науч. сотр. / Под общ. ред. А. А. Баранова. -М.: ВЕДИ, 2007. - 368 с.
2. Амелина И. В. Активность ядрышкообразующих районов хромосом в популяции жителей Курской области : автореф. дисс. на соискание ученой степени канд. биол. наук : спец. 03.00.25 «Гистология, цитология, клеточная биология» / И. В. Амелина. - Саратов, 2006. - 40 с.
3. Атраментова Л. А. Статистические методы в биологии: учебник для студ. высш. зав. / Л. А. Атраментова, О. М. Утев-ская. - Горловка : Лiхтар. - 2008. - 248 с.
4. Айала Ф. Введение в популяционную и эволюционную генетику: пер. с англ. / Ф. Айала. - М.: Мир, 1984. - 232 с.
5. Захаров А. Ф. Хромосомы человека (Атлас АМН СССР) / А. Ф. Захаров, В. А. Бенюш, Н. П. Кулешов, Л. И. Барановская. - М.: Медицина, 1982. - 264 с.
6. Зерова-Любимова Т. Е. Цитогенетичш методи дослщження хромосом людини: методичш рекомендацп / Т. Е. Зерова-Любимова, Н. Г. Горовенко. - К., 2003. - 25 с.
7. Лубсанова Л. Б. Иммунореактивность лимфоцитов периферической крови больных острым клещевым энцефалитом / Л. Б. Лубсанова, Г. В. Климова // Сибирский гос. мед. университет: сб. статей. - Томск, 2010. - С. 16-17.
8. Насонова В. А. Клиническая ревматология / В. А. Насонова, М. Г. Астапенко. - Москва, 1989. - 339 с.
9. Фролов А. К. Иммуноцитогенетика / А. К. Фролов, Н. Г. Арцимович, А. А. Сохин. - М.: Медицина, 1993. - 240 с.
10. Хронические артриты у детей и подростков / Г. Н Костюрина [и др.]. - Х.: Основа, 2002. - 172 с.
11. ISCN 2013: An International System for Human Cytogenetic Nomenclature. - 2013. - 140 р.
УДК 576. 316:616. 72 - 002 - 053. 21. 5
ВИЗНАЧЕННЯ iMYHOPEAK^BHOCTi ОРГАЫЗМУ Д^ЕЙ ТА ПЩЛ^МВ, ХВОРИХ НА ЮВЕНШЬНИЙ РЕВМАТОЩНИЙ АРТРИТ
Багацька Н. В., Медзяновська О. В.
Резюме. Встановлено частоту i особливост асо^ацм акроцентричних хромосом у дггей, хворих на ювентьний ревматощний артрит: асощацп мютились в 64 % проаналiзованих клггин i були представлен 8 класами лiмфоцитiв (вщ КЛ2 до КЛ9). Визначено зниження рiвня КЛ0+2, що свщчить про зниження iмунореактивностi оргаызму хворих на ЮРА.
K^40Bi слова: асо^ацм акроцентричних хромосом, хворi на ювентьний ревматощний артрит, iмунореактивнiсть.
УДК 576. 316:616. 72 - 002 - 053. 21. 5
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИММУНОРЕАКТИВНОСТИ ОРГАНИЗМА ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ, БОЛЬНЫХ ЮВЕ-НИльНым РЕВмАТОИДНым АРТРИТОм
Багацкая Н. В., Медзяновская Е. В.
Резюме. Установлены частота и особенности ассоциаций акроцентрических хромосом у детей, больных ювенильным ревматоидным артритом: ассоциации определялись в 64,0 % клеток и были представлены 8 классами лимфоцитов (от КЛ2 до КЛ9). Определено снижение уровня КЛ0+2, что свидетельствует о снижении иммунореактивности организма больных ЮРА.
Ключевые слова: ассоциации акроцентрических хромосом, больные ювенильным ревматоидным артритом, иммунореактивность.
UDC 576. 316:616. 72 - 002 - 053. 21. 5
Evaluation of МтипогеаоНуНу of the Organism in Children and Adolescents with Juvenile Rheumatoid Arthritis
Bagatska N. V., Medzianovska О. V.
Abstract. Introduction. The index of lymphocyte number (LN0+2), which demonstrates the proliferative activity and migration of lymphocytes in response to antigenic stimulus, is used to evaluate the immune system functional status. LN0+2 index is also used to examine the immunoreactivity of peripheral blood lymphocytes (PBL), activated in the human body, as well as in various disorders on the part of the immune system. This is especially true in regard to autoimmune diseases with a pressing need for monitoring the immune system status of patients. The aim if this study was to the definite the associative ability of acrocentric chromosomes in the peripheral blood lymphocytes of patients with juvenile rheumatoid arthritis (JRA) to evaluate the immunoreactivity of the organism.
Materials and methods. Cytogenetic analysis was performed in 80 children of both sexes with JRA at the age of 5 to 17 years, who were under clinical research in the State Institution "ICAHC NAMS of Ukraine. "
Culture of peripheral blood lymphocytes was performed by a standard procedure. Materials for the cytogenetic analysis were chromosomal preparations obtained from the culture of PBL. From each child were analyzed 100 metaphases. Metaphase plates were examined using a Leica CME binocular microscope (Austria), 10x18 eyepiece, 100x lens, and 1.25 x binocular head.
Statistical processing of the obtained results was performed on a PC using the Excel and SPSS Statistics 17.0 software packages. Student's t test was used to identify the significance of differences between compared findings.
Results. Karyotypes in our patients matched normal female - 46,XX or male - 46,XY ones. Associations of acrocentric chromosomes were determined in 64.0 % (5120) of the cells of patients with JRA, and the population of circulating lymphocytes was represented by 8 classes (from LN2 to LN9). Associations, consisting of 2 (31.9 %) or 4 (14.7 %) acrocentric chromosomes, were met most often in patients with JRA. Associations, consisting of 3 acrocentric chromosomes, occurred significantly less frequent (7.5 %) than associations of 2 (p < 0,001) or 4 chromosomes (p < 0.05); distribution of lymphocytes according to their classes with different number of acrocentric chromosome associations did not correspond to normal. As a whole, in patients with JRA LN0+2 level was 33.8 %; LN0+2 minimal value came to 20.5 % and maximal value - to 48.5 %; in 12 patients LN0+2 level exceeded 40.0 %. The LN0+2 total level was significantly lower than in healthy age-matched persons (p < 0.01). No significant differences (p < 0.05) have been found when comparing the LN0+2 level in children of the younger and older age groups. Analysis of the associative ability of acrocentric chromosomes in children and adolescents of both sexes with JRA has shown that acrocentric chromosome associations are present in 64.0 % of cells both in boys and girls, and population of lymphocytes is represented by 8 classes (from LN2 to LN9). Metaphase plates with two (LN2), three (LN3) and four (LN4) associating acrocentric chromosomes are determined most often in both groups of patients. No significant differences have been found in the frequency of LN0+2 in the groups of boys and girls (p > 0.05).
Conclusion. Therefore, a decreased LN0+2 level has been established in children and adolescents with JRA, that testifies to a decline in the proliferative capacity of peripheral blood lymphocytes and, accordingly, in the immunoreactivity of the patient's organism, which does not depend on sex and age of the probands.
Keywords: associations of acrocentric chromosomes, patients with juvenile rheumatoid arthritis, immunoreactivity.
Рецензент - проф. Крючко Т. О.
Стаття надшшла 5. 12. 2014 р.
