CC BY
38
вопросы вирусологии. 2018; 63 (1)
DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2017-63-1-29-36
Complex Proteins: Implication of Their Roles in Viral Replication (Thesis). Hong Kong; 2017.
33. Hughes D.J., Marendy E.M.., Dickerson CA., Yetming K.D.., Sample C.E., Sample J.T. Contributions of CTCF and DNA methyltransferases DNMT1 and DNMT3B to epstein-barr virus restricted latency. J. Virol. 2012; 86(2): 1034—45.
34. Park E.S., Park Y.K., Shin C.Y., Park S.H., Ahn S.H., Kim D.H. et al. Hepatitis B virus inhibits liver regeneration via epigenetic regulation of uroki-nase-type plasminogen activator. Hepatology. 2013; 58(2): 762—76.
35. Kim S., Lee H.S., Ji J.H., Cho M.Y., Yoo Y.S., Park Y.Y. et al. Hepatitis B virus X protein activates the ATM-Chk2 pathway and delays cell cycle progression. J. Gen. Virol. 2015; 96(8): 2242—51.
36. Zhu M., Guo J., Li W., Lu Y., Fu S., Xie X. et al. Hepatitis B virus X protein induces expression of alpha-fetoprotein and activates PI3K/mTOR signaling pathway in liver cells. Oncotarget. 2015; 6(14): 12196—208.
37. Matsuda Y., Wakai T., Kubota M., Osawa M., Takamura M., Yamagi-wa S. et al. DNA Damage Sensor y-H2AX Is Increased in Preneoplastic Lesions of Hepatocellular Carcinoma. ScientificWorld Journal. 2013; 2013: 597095.
оригинальные исследования
38. Ha K., Lee G.E., Palii S.S., Brown K.D., Takeda Y., Liu K. et al. Rapid and transient recruitment of DNMT1 to DNA double-strand breaks is mediated by its interaction with multiple components of the DNA damage response machinery. Hum. Mol. Genet. 2011; 20(1): 126—40.
39. O'Hagan H.M., Wang W., Sen S., Destefano Shields C., Lee S.S., Zhang Y.W. et al. Oxidative damage targets complexes containing DNA methyltransferases, SIRT1 and polycomb members to promoter CpG islands. Cancer. Cell. 2011; 20(5): 606—19.
40. Jin B., Robertson K.D. DNA Methyltransferases (DNMTs), DNA Damage Repair, and Cancer. Adv. Exp. Med. Biol. 2013; 754: 3—29.
41. Lucifora J., Xia Y., Reisinger F., Zhang K., Stadler D., Cheng X. et al. Specific and nonhepatotoxic degradation of nuclear hepatitis B virus cccDNA. Science. 2014; 343(6176): 1221—8.
42. Ran F.A., Hsu P.D., Wright J., Agarwala V., Scott D.A., Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 2013; 8(11): 2281—308.
Поступила 16.04.17 Принята в печать 20.06.17
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДк 578.833.26:578.53
Дёмина Т.В.1, КозловаИ.В.23, Ткачёв С.Е.4, Дорощенко Е.К.2, Лисак О.В.2, Савинова Ю.С.2, Сунцова О.В.2, Верхозина М.М.5, Джиоев Ю.П.3, Парамонов А.И.2, Киселёв Д.О.3, Злобин В.И.3
ОПРЕДЕЛЕНИЕ И СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОМНОЙ СТРУкТУРЫ
сибирских штаммов вируса клещевого энцефалита европейского
СУБТИПА
1ФГБОУ ВО «Иркутский государственный аграрный университет им. А.А. Ижевского», 664038, г. Иркутск; 2ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека», 664003, г. Иркутск; 3ФГБОУ ВО «Иркутский государственный медицинский университет», 664003, г. Иркутск 4ФГБНУ «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» СО РАН, 630090, г. Новосибирск; 5ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Иркутской области», 664047, г. Иркутск
Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ, TBEV) делится на 3 субтипа: дальневосточный (ВКЭ-ДВС, TBEV-FE), европейский (ВКЭ-Евр, TBEV-Eur) и сибирский (ВКЭ-Сиб, TBEV-Sib). В России их также принято называть соответственно генотипами 1, 2 и 3. Географически ВКЭ-Евр доминирует в Центральной и Северной Европе, но его представители встречаются и восточнее — по южной части лесной зоны внетропической Евразии вплоть до Восточной Сибири и Южной Кореи. Однако штаммы, изолированные за пределами Европы, остаются малоизученными. В предлагаемом исследовании определено 8 и сопоставлено 13 полных геномов сибирских изолятов ВКЭ-Евр. Анализ 152 депонированных в GenBank полногеномных последовательностей ВКЭ показал, что ВКЭ-Евр на территории всего евроазиатского ареала обладает более высокой степенью стабильности кодирующей части генома (3,1% различий) по сравнению с ВКЭ-ДВС (6,6%) и ВКЭ-Сиб (7,8%). При этом максимальные показатели различий отмечаются не между европейскими и сибирскими штаммами, как можно было бы ожидать, а между представителями из Европы. Это штаммы Mandl-2009 из норвегии и Hypr из Чешской Республики. исследованные штаммы из Сибири входят в состав компактного генетического кластера из 42 штаммов ВКЭ-Евр и подразделяются на 2 субкластера — западносибирский и восточносибирский варианты. Эти варианты отличаются по сочетаниям аминокислотных замен во всех белках, кроме NS2B. Западносибирский вариант в основном циркулирует на территории Алтая, а ближайшим родственником его представителей является штамм Absettarov из европейской части России. Штаммы, аналогичные восточносибирскому варианту европейского субтипа, зафиксированы на Алтае (штамм 84.2, 2007) и в Беларуси (N256, предположительно 1940).
Ключевые слова: клещевой энцефалит; вирус клещевого энцефалита; генотип; субтип; генетическая вариабельность; полипротеин; аминокислотные замены. Для цитирования: Дёмина Т.В., Козлова И.В., Ткачёв С.Е., Дорощенко Е.К., Лисак О.В., Савинова Ю.С., Сунцова О.В., Верхозина М.М., Джиоев Ю.П., Парамонов А.И., Киселёв Д.О., Злобин В.И. Определение и сравнительный анализ геномной структуры сибирских штаммов вируса клещевого энцефалита европейского субтипа. Вопросы вирусологии. 2018; 63(1): 29-36. DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2018-63-1-29-36
Для корреспонденции: Дёмина Татьяна Васильевна, д-р биол. наук, проф. каф. фак. биотехнологии и ветеринарной медицины при ФГБОУ ВО «Иркутский государственный аграрный университет им. А.А. Ижевского», 664038, г. Иркутск. E-mail:[email protected]
problems of virology. 2017; 63 (1)
DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2018-63-1-29-36_
ORIGINAL REsEARcH
Demina T.V.1, Kozlova I.V.23, Tkachev S.E.4, Doroshchenko E.K.2, Lisak O.V.2, Savinova Yu.S.2, Suntsova O.V.2, Verkhozina M.M.5, Dzhioev Yu.P.3, Paramonov A.I.2, Kiselev D.O.3, Zlobin V.I.3 DEFINITION AND COMPARATIVE ANALYSIS OF THE GENOMIC STRUCTURE OF SIBERIAN STRAINS OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS OF THE EUROPEAN SUBTYPE
1 Irkutsk State Agrarian University named after A.A. Ezhevsky, Irkutsk, 664038, Russian Federation;
2 Science Center of Family Health Problems and Human Reproduction, Irkutsk, 664003, Russian Federation;
3 Irkutsk State Medical University, Irkutsk, 664003, Russian Federation;
4 Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Novosibirsk, 630090, Russian Federation;
5 Center of Hygiene and Epidemiology in the Irkutsk region, Irkutsk, 664047, Russian Federation
Tick-borne encephalitis virus (TBEV) is classified into three subtypes: Far Eastern (TBEV-FE), European (TBEV-EU) and Siberian (TBEV-SIB). In Russia, these are also called genotypes 1, 2 and 3, respectively. Geographically, TBEV-EU dominates in Central and Northern Europe, but its representatives are also found to the east - along the southern part of the forest zone of extratropical Eurasia - up to Eastern Siberia and South Korea. However, the strains isolated outside Europe remain poorly investigated. In the proposed study, eight full genomes of the Siberian isolates of TBEV-EU were determined and 13 complete genomes were compared. The analysis of 152 full-genome TBEV sequences showed that the TBEV-EU has a higher degree of stability of the genome-coding region in the entire Eurasian area (3.1% of differences) compared to TBEV-FE (6.6%) and TBEV-SIB (7.8%). At the same time, the maximum differences are observed not between European and Siberian strains, as one could expect, but between the representatives from Europe - TBEV strains Mandl-2009 from Norway and Hypr from the Czech Republic. The studied strains from Siberia form the compact genetic cluster of 42 TBEV-EU strains and are divided into two subclusters - West Siberian and East Siberian variants. These variants differ in the combinations of amino acid substitutions in all proteins except NS2B. The West Siberian variant mostly circulates in the territory of Altai, and the closest relative of its representatives is Absettarov strain from the European part of Russia. The strains similar to the East Siberian variant of the European subtype were recorded in the Altai (strain 84.2, 2007) and in Belarus (N256, about 1940).
K e y w o r d s: TBE; TBEV; genotype; subtype; genetic variability; polyprotein; amino acids substitutions. For citation: .Demina T.V., Kozlova I.V., Tkachev S.E., Doroshchenko E.K., Lisak O.V., Savinova Yu.S., Suntsova O.V., Verkhozina M.M., Dzhioev Yu.P., Paramonov A.I., Kiselev D.O., Zlobin V.I. Definition and comparative analysis of the genomic structure of siberian strains of tick-borne encephalitis virus of the european subtype. Voprosy Virusologii (Problems of Virology, Russian journal). 2018; 63(1): 29-36. (In Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0507-4088-2018-63-1-29-36 For correspondence: Tatyana V. Demina, Dr. Sci. Biol., Professor of the Department of Biotechnology and Veterinary Medicine, Irkutsk State Agrarian University named after A.A. Ezhevsky, Irkutsk, 664038, Russian Federation. E-mail: [email protected] Information about authors:
Demina T.V., http://0000-0003-2459-888X; Kozlova I.V., http://0000-0002-6324-8746; Lisak O.V., http://0000-0003-3909-7551; Suntsova O.V., http://0000-0003-4057-2890; Paramonov A.I., http://0000-0002-7156-4036
Acknowledgment. This work was supported by the Russian Science Foundation (Grant No. 15-00615). Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Received 13 July 2017 Accepted 17 October 2017
Введение
Клещевой энцефалит (КЭ) — природно-очаговая ней-роинфекция, возбудителем которой является вирус, относящийся к семейству Flaviviridae. В последние годы в мире расширяются эндемичные области распространения вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) и растет заболеваемость КЭ [1]. В России регистрация заболевания введена в 1944 г. С сентября 2012 г. КЭ официально подлежит регистрации в Европейском Союзе [2]. В каталоге Международного комитета по таксономии вирусов ВКЭ подразделяется на 3 субтипа: дальневосточный (ВКЭ-ДВС, ТВЕУ^Е), европейский (ВКЭ-Евр, ТВЕУ-ЕЦ) и сибирский (ВКЭ-Сиб, ТВЕУ^Ш) [3, 4], которые в России принято также называть соответственно генотипами 1, 2 и 3. Кроме того, показано, что в Байкальском регионе России циркулируют представители еще двух предполагаемых генотипов, прототипами которых являются штаммы 178-79 (генотип 4) и 886-84 (генотип 5) [5—7]. ВКЭ-ДВС, чаще других вызывающий тяжелые симптомы КЭ, в незначительной пропорции встречается на большей части всего ареала ВКЭ, но преобладает на Дальнем Востоке, обнаружен в Китае и Японии. ВКЭ-Евр доминирует в очагах Центральной и Восточной Европы, является минорным на территории РФ, исключая Алтай, и пока не
выявлен на Дальнем Востоке. Кроме того, ВКЭ-Евр зафиксирован в Южной Корее [8]. ВКЭ-Сиб (или генотип 3) наиболее широко распространён по всему ареалу ВКЭ, доминирует на территории РФ, был изолирован в Казахстане (штамм Алма-Арасан [4]), но информация о его наличии в большинстве европейских стран, а также в Корее и Японии отсутствует. В Иркутской области и Республике Бурятия все три основных субтипа (генотипа) ВКЭ вовлечены в этиологию КЭ [5, 6], и недавно появились первые данные о полногеномных структурах штаммов ВКЭ из Сибири [9—11]. Предлагаемое исследование также посвящено этому вопросу, а именно определению и анализу полногеномной структуры представителей ВКЭ-Евр (или генотипа 2), изолированных на территории Алтая (Западная Сибирь) и Иркутской области (Восточная Сибирь). Среди изолятов ВКЭ, идентифицированных в качестве представителей ВКЭ-Евр, есть штамм Щ-98, полученный на территории Иркутской области в 1998 г. от больного лихорадочной формой КЭ, пострадавшего от укуса клеща в очаге, где штаммы, выделенные от клещей, стабильно определяются как представители ВКЭ-Сиб. Генотипическая принадлежность данного штамма была подтверждена путем секвенирования фрагмента генома ^епВапк, КР666097).
Цель данной работы — анализ генетической структуры
Вопросы Вирусологии. 2018; 63 (1)
DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2017-63-1-29-36
оригинальные исследования
штаммов европейского субтипа ВКЭ, изолированных на территории Сибири, по результатам сопоставления фрагментов генома и полногеномных последовательностей.
Материал и методы
Штаммы ВКЭ. В работе использовали штаммы ВКЭ из музейной коллекции Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека Иркутска (табл. 1). Штаммы выделяли путем внутримозгового заражения 1—3-дневных мышей-сосунков вирусной суспензией и после 2—3 пассажей на мышах хранили в лиофилизиро-ванном виде. Перед началом исследований их восстанавливали путем внутримозгового заражения белых мышей массой 5—6 г. Содержание животных и их умерщвление осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 № 755).
Нуклеотидные последовательности геномов штаммов ВКЭ для сравнительного анализа были определены нами в ходе настоящей работы или взяты из международной компьютерной базы данных GenBank.
Выделение РНК осуществляли с помощью набора РИБО-преп («ИнтерЛабСервис», Россия) в соответствии с инструкцией производителя.
Амплификация ДНК. Обратную транскрипцию проводили с использованием набора Reverta L-100 («Ам-плиСенс», Россия), содержащего случайные гексаоли-гонуклеотиды. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) выполняли в 20 мкл реакционной смеси в соответствии с инструкциями производителя («БиоСан», Россия) с применением 3 мкл кДНК в качестве матрицы и пары соответствующих праймеров (табл. 2).
Секвенирование ДНК. Нуклеотидные последовательности продуктов ПЦР, очищенных на GFX-колонках («Amersham Biosciences», США) были определены с использованием автоматического секвенатора ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США).
Анализ последовательностей ВКЭ проведен с помощью программы MEGA 6.0 [12].
Результаты
Расшифровано 8 полногеномных последовательностей штаммов, изолированных на территории Сибири (см. табл. 1), генотипическая принадлежность которых к ВКЭ-Евр предварительно была подтверждена с помощью методов молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот (МГНК) [7] и секвенирования фрагментов генома (см. номера депонентов GenBank в табл. 1, указанные в скобках). Проанализированы полногеномные последовательности всех 152 штаммов ВКЭ, депонированных в GenBank (табл. 3). При филогенетическом сопоставлении этих последовательностей исследуемые штаммы из музейной коллекции, как и ожидалось, вошли в состав группы ВКЭ-Евр (см. рисунок). Всего в этой группе было 42 представителя, 13 из которых изолированы на территории Сибири (см. табл. 1).
При сравнении как кодирующей области генома, так и соответствующей ей последовательности полипротеина среди групп штаммов трёх основных генотипов различия между штаммами европейского генотипа оказались минимальными (3,1 и 1,5% соответственно) по сравнению с дальневосточным и сибирским генотипами. Это свидетельствует о более высокой степени их генетической однородности, чем у штаммов дальневосточного
Таблица 1
Сибирские штаммы ВКЭ европейского субтипа с известными полногеномными структурами
Штамм Год изоляции Источник изоляции Инв. № GenBank
Западная Сибирь (Алтайский край)
Zmeinogorsk-1* 1986 Ixodes persulcatus KY069124 (JN936370)
Zmeinogorsk-5* 1986 persulcatus KY069125 (JN936373)
Zmeinogorsk-9* 1986 persulcatus KY069126 (JN936375)
84.2 2007 persulcatus HM120875
Восточная Сибирь (Иркутская область)
1G-98* 1998 Человек KY069119
118-71* 1971 Spermophilus undulatus KY069120 (KT895091)
126-71* 1971 I. persulcatus KY069123 (JN936333)
163-74* 1974 persulcatus KY069121 (JN936334)
262-74* 1974 persulcatus KY069122 (JN936338)
Sorex 18-10 2010 Sorex spp. KP938507
IrkutskBR1456 2009 persulcatus KP331443
IrkutskBR1434 2009 persulcatus KP331442
IrkutskBR99 2008 persulcatus KP331441
Примечание. * — штаммы, геномы которых были расшифрованы в ходе данного исследования.
(6,6 и 2,9%) и сибирского (7,8 и 4,2%) генотипов. При этом наименее тесные филогенетические отношения выявляются между представителями ВКЭ скандинавского полуострова (Швеция и Норвегия) и штаммами, изолированными в очагах всего остального ареала, включая территории других европейских стран, а также России и Южной Кореи. Максимальные показатели различий выявлены между штаммами Mandl-2009 из Норвегии и штаммом Нург из Чешской Республики.
При сопоставлении вновь расшифрованных последовательностей друг с другом оказалось, что сибирские штаммы образуют 2 группы, соответствующие географическому положению мест их изоляции. Длина генома у алтайских штаммов составляет 10 825 нуклеотидных оснований (н.о.), а у восточносибирских — 10 905 н.о. Как и у других известных представителей ВКЭ-Евр, геномы исследуемых штаммов содержат по 132 нуклеоти-да в 5'-некодирующей области (100% гомологии в обеих группах и 3% различий между группами) и по 10 242 н.о. в области, кодирующей полипротеин-предшественник 3 структурных и 7 неструктурных вирусных белков (более 99,9% гомологии внутри групп и 99,9% гомологии между группами). 3' — нетранслируемый участок исследуемых геномов сопоставим по протяженности и структуре с аналогичной областью штамма Нург (461 н.о.) и составляет для штаммов, выделенных на Алтае, 451 н.о., а для штаммов из Восточной Сибири — 531 н.о.
По итогам сравнения полной кодирующей области у 42 штаммов ВКЭ-Евр, изолированных из разных частей обширного ареала, установлено, что штаммы восточносибирского варианта сибирской популяции имеют по 97,4% гомологии с прототипным штаммом Neudoerfl, а представители западносибирского варианта — по 97,6%. В состав восточносибирского варианта вошли 9
problems of virology. 2017; 63 (1)
DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2018-63-1-29-36 ORIGINAL REsEARcH
100
100
100
Toro-2003, Швеция
- JP-296, Швеция
- Saringe-2009, Швеция
— JP-554, Швеция - Mandal-2009, Норвегия
100
84
99
100j— CGI223, Словакия 114, Словакия
- 285, Словакия
- A104, Германия
- AS33, Германия
— Joutseno, Финляндия Kubinova, Чешская Республика - К23, Германия
98
Skrivanek, Чешская Республика - Neudoerfl, Австрия
100
С
ТоЬгтап, Чешская Республика _ РеЬасоуа, Чешская Республика \Zlasaty, Чешская Республика - Нург, Чешская Республика
Ljubljanal, Словения
100
90
^^ Восточносибирский вариант (10 штаммов)
100
81
г КгМЭЗ, Южная Корея
- КгМ213, Южная Корея
263, Чешская Республика Salem, Германия — Est3476, Эстония
100
76
100
100
— 1.еПа-ВН95/15, Германия
- КитНпдеА52, Финляндия
. КитНпде25-03, Финляндия АЬвейагоу, Россия, Карельский перешеек 4 Западносибирский вариант(3)
0,002
ч
Группа ВКЭ-Евр, сформированная в результате сопоставления кодирующей области 152 полногеномных последовательностей ВКЭ с помощью компьютерной программы MEGA 6.0 [12] методом объединения ближайших соседей с использованием двухпараметри-
ческой модели Кимуры.
Вопросы Вирусологии. 2018; 63 (1)
DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2017-63-1-29-36
Таблица 2
Олигонуклеотидные праймеры, использованные для амплификации и секвени-
рования
ПЦР- фрагмент Праймер Последовательность (5'—3') Позиции в геноме ВКЭ (штамм Neudoerfl (U27495))
1 E23 AGATTTTCTTGCACGTGC 1— 18
E25R CCTGGTCTATGGTCACACACTC 625— 646
2 E27 ACTGTGATCAGGGCTGAAGG 511— 530
E27R GGAGCCAGGCAGAGGAGCAC 943— 962
3 E29 TGACCGTGGAAAGTGTGG 902— 919
E24 CTCTTCAGCCAAAGTGGC 1210— 1227
4 E3 TCAATGGATGTGTGGCTTGA 1090— -1109
E5R TGCACAACAAGGACACATCTCC 1510— -1531
5 Ef1 GAGGAAGACGGCATCCTTCAC 1449— 1469
Er1 CATCAATGTGCGCCACAGGAAC 1783— -1804
6 E31 CTGGTTGAATTTGGAGCTCC 1693— 1712
E31R GGTGTTATCAGCATGGCCAC 2032— -2051
7 E33 CCCAGTGCGGGCAGTGGCAC 1992— 2011
E4 CTCATGTTCAGGCCCAACCA 2368— 2387
8 E7 GGCATAGAAAGGCTGACAGTG 2197— -2217
E10 GATACCTCTCTCCACACAACCAG 2515— 2537
9 E35 TGGTTGGGCCTGAACATGAG 2368— 2387
E35R CGTGTGTTGGTTCCTGTCTG 2973— 2992
10 E12F TTTGGAGTTGGCCTGAGAAC 2935— 2954
E12 CACCTTGCCACTCTCTGTGG 3365— 3384
11 E13 ACAGGTGAAAGGACCATGGAAG 3249— 3270
E13RS GTCACCATCTCTCGGACAGTG 3819— 3839
12 E14F TGTGTTTGAGCTGAGGGTGG 3765— 3784
E14 TCCACACAGCCACTCCATTC 4363—4382
13 E15-W AGACGATCTTTCAGTGAACCAC 4201—4222
E15R CTGCACTGTCTCACCTTTCC 4874—4893
14 E16F TGTCCTGCACACGATGTGGC 4740—4759
E16 CAGGCGTCTGTTGACATAGG 5408— 5427
15 E17 GGAAGACCCACAGAGTCCTC 5210— 5229
E17R CTGGAGTAGTCCTTCTCAAAGG 5783— -5804
16 E18FS GATGTTTGACTGGATCAC 5653— 5672
E18RS CAATGAGTGAGAAGGTGTCG 6205— 6224
17 E19 AGGACAAGATGCCAGAGGTGG 6143— -6163
E19RS AGGGAGGCCAGCAGTACCAG 6715— 6734
18 E20FS CATCTGGTGCTTCGTTGTCC 6663— 6682
E20 GTCCAGACACCACAATGGCC 7272— -7291
19 E21F GTTCACACCATACATCATCCACC 7059— -7081
E21RS AGCCAGAGTCGGTGCCCAAG 7624— 7643
20 E22F-W AGGCCGGAGGCTGACACACTGTG 7537— 7559
E22R-W CTCACCCTCCACAGCGCATCTG 8120— -8142
21 E23F TGAAACTCCAAAGATGGTGACAAG 7995— 8018
E23R GCGTTCCATGGCCAGCTGAG 8650— 8669
22 NS5-1F GACATGGCAGTATTGGGGCAG 8571— 8591
NS5-1R GCTCCCCAGCCACATGTACC 9092— 9111
23 NS5-2F GCAGCTCGTGGATGAAGAGAGAG 8964— 8986
NS5-2RS CCACTGACGAGCATTCTTCC 9634— 9653
24 NS5-3F CACCCTCACCAACATAAAGG 9501— 9520
NS5-3R TGCATGAAGGGGTTGTCC 10 125— -10 142
25 NS5-4F GGAGCCTGGATGACCACAG 10 069— -10 087
NS5-4R TCCAGGTTTTGCTCAGTCAC 10 387— -10 406
26 3UTR-1F GCCAAGAACATTTGGGGAGC 10 246— -10 265
3UTR-1R CTTCCCTCCTCCCGGAAGC 10 968— -10 986
27 3UTR-2F CAGTGAGAGTGGCGACGGG 10 844— -10 862
3UTR-2R AGCGGGTGTTTTTCCGAGTC 11 122— 11 141
оригинальные исследования
штаммов из Иркутской области и штамм 84.2 с Алтая. Различия по кодирующей части генома в этой группе из 10 штаммов не превышают 0,5%. Алтайские штаммы Zmeinogorsk-1, Zmeinogorsk-5 и Zmeinogorsk-9 составили группу западносибирского варианта (более 99,9%). Наиболее близким к ним по уровню гомологии оказался российский штамм Absettarov, изолированный в 1951 г. от больного КЭ человека, инфицированного в природном очаге, расположенном на Карельском перешейке (99,3% гомологии по кодирующей части генома со штаммами из Змеиногорска и 97,7% — со штаммом Neudoerfl).
В результате анализа всех представленных в GenBank нуклеотидных последовательностей (фрагментов генома в том числе) установлено, что сибирская популяция ВКЭ-Евр оказалась представлена двумя группами штаммов, обозначенными нами как восточносибирский и западносибирский варианты. Циркуляция восточносибирского варианта подтверждена в период с 1971 по 2010 г. в Восточной Сибири (9 штаммов из Иркутской области), в 2007 г. — в Алтайском крае (штамм 84.2, изолированный из I. persulcatus) и Беларуси (штамм № 256 из I. ricinus) предположительно в 1940 г. Западносибирский вариант европейского субтипа зарегистрирован на территории Алтая в 1986 г. (3 штамма из Змеиногорска) и в 2007 г. (Altay-103). Наиболее близкий по степени гомологии к этой группе штамм Absettarov был изолирован в европейской части ареала.
При сопоставлении 42 полипротеиновых последовательностей ВКЭ-Евр по 3414 аминокислотных остатков каждая вне зависимости от источника выделения восточносибирский и западносибирский варианты расходятся по сочетаниям аминокислотных замен в 29 позициях у 9 из 10 белков вируса (табл. 4), причём в белке E присутствует всего одна такая позиция (E-246). В то же время по двум другим позициям этого белка — E-21 и E-335 — наблюдается дивергенция восточносибирского варианта сибирской популяции ВКЭ-Евр (см. табл. 4; 5). Ни одной замены не было обнаружено в белке NS2B.
При сравнении известных транслированных фрагментов генома ВКЭ оказалось, что замена A^-S (E-47) у восточносибирского штамма Sorex18-10 характерна не только для представителей ВКЭ-ДВС и ВКЭ-Сиб (см. табл. 5), но имеется также у штамма 886-84 — прототипа предполагаемого генотипа 5 и еще у двух штаммов ВКЭ-Евр. Это изоляты РНК из клещей I. ricinus — Bul_175_10 (инвентарный номер KC154175; выделен в 2010 г.) в Германии и LU_Dagmarsellen3
problems of virology. 2017; 63 (1 )
DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2018-63-1-29-36 ORIGINAL REsEARcH
Таблица 3
Территориальная и генотипическая принадлежность штаммов ВКЭ с расшифрованными полногеномными последовательностями (на июнь 2017 г.)
Таблица 4
Аминокислотные замены, характерные для сибирских штаммов ВКЭ-Евр, выявленные при сопоставлении 42 полипротеиновых структур
Страны Генотип Итого Белок По- Штаммы
1 2 3 4 5 зиция по западно- восточносибирский вариант другие
Россия 76 14 16 1 1 110 белку сибирский 1971—2007 гг. 2008—2010 гг. регио-
вариант ны
Азия
Киргизия Монголия Китай
Южная Корея Япония
3
6 — 1 2
15
2
Европа
Австрия, Чешская Республика, Германия,
Словения, Словакия
Эстония
Латвия
Норвегия, Швеция, Финляндия
17 1
27
В с е г о .
84 42 24 1
152
(НМ468144; 2009 г.) — в Швейцарии. Кроме того, замена А^У в позиции Е-246 у штаммов из Змеиногорска обнаружена у изолята 2201 (КС292217), полученного из пула клещей, собранных в Германии. Вид клещей и год изоляции геномной РНК авторами не указаны.
Обсуждение
Известно, что очаги КЭ на территории Сибири формируются под действием сурового резко-континентального климата и существенно отличаются по ландшафтным особенностям, составу переносчиков и резервуарных хозяев как друг от друга, так и от очагов на территории Европы, которая, являясь зоной доминирования ВКЭ европейского субтипа, расположена в умеренном климатическом поясе. Тем не менее все известные штаммы ВКЭ-Евр, изолированные на территориях от крайних западных (Норвегия, Германия) до крайних восточных границ ареала (Южная Корея), отличаются более высокой степенью гомологии друг от друга, чем штаммы внутри групп, соответствующих ВКЭ-ДВС и ВКЭ-Сиб. Следовательно, можно заключить, что ВКЭ европейского субтипа на территории Евразии обладает высокой степенью стабильности генома, хотя существует в условиях значительно различающихся очаговых экосистем.
Сибирские штаммы по итогам сравнения нуклеотид-ных последовательностей (полных геномов и их фрагментов) распределились по двум группам — западносибирскому и восточносибирскому вариантам ВКЭ-Евр. Западносибирский вариант ВКЭ-Евр демонстрирует устойчивую циркуляцию на Алтае. Судя по представленным здесь данным и сообщению В.В. Якименко и соавт. [13], к западносибирскому варианту ВКЭ-Евр относятся не только штаммы из Змеиногорска и Акау-103 (см. раздел «Результаты»), но также штаммы из Кош-Агачского района Республики Алтай и из Республики
prM
31 77 147 159 21 246 335
A
V
K R
L M
A V
V
V
V
A T
NS1 154 L F
174 E K
237 V M
287 I T
294 R K
NS2A 42 I V
53 I M
124 S G(E*)
141 I M
NS3 33 L F
447 T I
NS4A 32 R H
55 V A
NS4B 21 Q R
56 I V
119 L F
NS5 101 K R
290 G S
434 R H
521 K Q
699 A P
701 724 897
L T K
F A R
V, A K L
V
V A T F E
V
T, V, A K
V I, M S, N
I
F,L T H
V, A Q, R I
L, F R, K S, N H, R, Q K, R F, V F, L A, T, S R, K
Примечание. В сером поле представлены замены, характерные только для указанной группы штаммов; * — замена, специфичная для штамма Ю-98.
Казахстан (годы изоляции с 1990 по 2010, нуклеотидные последовательности отсутствуют в общем доступе). Примечательно, что к генетическому кластеру западносибирского варианта ВКЭ-Евр тесно примыкает штамм Absettarov из Европейской части России, изолированный 66 лет назад (см. рисунок). Представители восточносибирского варианта ВКЭ-Евр в основном обнаружены в Иркутской области, исключая штаммы 84.2 (Алтай) и 256 (Беларусь). Как видим, очаги изоляции гомологичных последовательностей расположены на значительном удалении друг от друга — более 4 тыс. км.
С
E
I
T
I
8
1
вопросы вирусологии. 2018; 63 (1)
DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2017-63-1-29-36
оригинальные исследования
Таблица 5
Аминокислотные замены в белке E у 13 штаммов генотипа 2 ВкЭ из Западной и Восточной Сибири
Субтип, штамм № позиций
21 47 67 246 335
Дальневосточный субтип V S D,N
Сибирский субтип V S D,N
Европейский субтип V A D
Западносибирские штаммы
A,V A A
T T T
Zmeinogorsk-1* V A D V T
Zmeinogorsk-5* V A D V T
Zmeinogorsk-9* V A D V T
84.2 V A D A T
Восточносибирские штаммы
1G-98* V A G A T
118-71* V A D A T
126-71* V A D A T
163-74* V A D A T
262-74* V A D A T
Sorex 18-10 I S D A I
IrkutskBR 1456-09 I A D A I
IrkutskBR 1434-09 I A D A I
IrkutskBR 99-08 I A D A I
Примечание. В группе дальневосточного субтипа сопоставлены полипротеиновые структуры 84 штаммов, в группе сибирского субтипа — 24, в группе европейского субтипа — 29; * — штаммы, являющиеся основными объектами настоящего исследования; светло-серым цветом обозначены нехарактерные для генотипа 2 ВКЭ замены, белым шрифтом в темном поле — уникальная (штам-моспецифическая) замена.
При сопоставлении полипротеиновых структур эти варианты различаются по сочетаниям аминокислотных замен во всех белках, кроме NS2B (см. табл. 4). Отсутствие замен в NS2B-белке, возможно, связано с той важной ролью, которую он играет в репродукции ВКЭ. Известно, что ^2В-белок образует комплекс с белком №3, обеспечивая ему правильную конформацию, и выступает в качестве кофактора вирусной сериновой протеазы NS2B-№3 [14]. Кроме того, было обнаружено, что белок №2В локализован в местах синтеза вирусной РНК и способен к взаимодействию с белком NS5 и З'-некодирующей областью, что предполагает его участие в репликации вирусного генома [15]. Поэтому любые изменения в аминокислотной последовательности белка NS2B с большой вероятностью приведут к изменению сайта связывания с NS3 и потере протеазной активности.
У исследованных сибирских штаммов ВКЭ-Евр не выявлено специфических замен, соответствующих определенному источнику выделения, кроме замены D^•G в позиции Е-67 у штамма Ю-98 (см. табл. 5). Мутация D67G в белке Е ранее была отмечена для клона 18А штамма Absettarov из группы ВКЭ-Евр [16, 17], а также описана для одного штамма ВКЭ-Сиб, изолированного от смертельно инфицированного индивидуума в 2001 г. ^аг46-2 (ЕШ44079)), в работе М. Хаснатино-ва и соавт. [18] и для 7 штаммов ВКЭ-ДВС. Штаммы ВКЭ-ДВС с такой мутацией были выделены в Эстонии
в 1998 г. от A. agrarius (Est2546 (DQ393779)), в 1943 г. в северо-западном регионе России (Volkhov-Khromov (FJ214114)) и в 1942 и 1943 гг. на Урале (T-blood (AF091019), Ural-Nina (FJ214119), Ural-Ponomarev (FJ214118), Ural-Belyaeva (FJ214117) и Ural-Antipov (FJ214115)). Значимая аминокислотная замена D^-G в позиции E-67 повышает заряд молекулы [16—18]. Пока она выявлена только у отдельных представителей всех трёх основных генотипов ВКЭ и только у изоля-тов ВКЭ, полученных от млекопитающих (от больных КЭ людей и грызуна). Закономерность это или случайность — покажут дальнейшие исследования.
Заключение
Европейский субтип ВКЭ на территории всего евроазиатского ареала обладает более высокой степенью стабильности генома, чем ВКЭ-ДВС и ВКЭ-Сиб. При филогенетическом сопоставлении 152 имеющихся в общем доступе полногеномных последовательностей ВКЭ штаммы ВКЭ-Евр образуют единый кластер из 42 представителей, в состав которого входят 13 представителей из Сибири. Все сибирские штаммы разделяются на западносибирский и восточносибирский варианты ВКЭ-Евр, поскольку большинство штаммов каждого из двух вариантов изолированы в соответствующем регионе. Эти варианты различаются по сочетаниям аминокислотных замен во всех белках, кроме NS2B. Штаммы, аналогичные восточносибирскому варианту европейского субтипа, зафиксированы на Алтае (84.2, 2007) и в Беларуси (N256, предположительно 1940), а ближайшим родственником представителей западносибирского варианта ВКЭ-Евр является штамм Absettarov из европейской части России.
Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 15-00615
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (п.п. 1—4, 8, 10—12, 14—16, 18 см. REFERENCES)
5. Верхозина М.М., Злобин В.И., Козлова И.В., Дорощенко Е.К., Лисак О.В., Дёмина Т.В. и др. Молекулярная эпидемиология и экология вируса клещевого энцефалита в Восточной Сибири. Новосибирск: СибАК; 2017.
6. Козлова И.В., Дорощенко Е.К., Лисак О.В., Джиоев Ю.П., Верхозина М.М., Дёмина Т.В. и др. Видовое и генетическое разнообразие возбудителей клещевых инфекций на территории Восточной Сибири. Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. 2012; (2-2): 75—82.
7. Демина Т.В., Джиоев Ю.П., Верхозина М.М, Козлова И.В., Ткачев С.Е., Дорощенко Е.К. и др. Молекулярная эпидемиология вируса клещевого энцефалита: географическая вариабельность, определяемая методом молекулярной гибридизации. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2009; (3): 27—39.
9. Андаев Е.И., Беликов С.И., Кулакова Н.В., Борисова Т.И., Сидорова Е.А. Характеристика штамма вируса клещевого энцефалита сибирского подтипа, изолированного от пациента с прогреди-ентным течением болезни. Эпидемиология и вакцинопрофилак-тика. 2014; (4): 31—7. 13. Якименко В.В., Ткачёв С.Е., Макенов М.Т., Малькова М.Г., Лю-бенко А.Ф., Рудакова С.А. и др. О распространении вируса клещевого энцефалита европейского субтипа в западной Сибири и на Алтае. Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2015; (27): 29—35. 17. Козловская Л.И., Осолодкин Д.И., Карганова Г.Г. Анализ молекулярной динамики белков E вариантов ВКЭ на основе разности корреляционных матриц. Труды Института полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова РАМН. Медицинская вирусология. 2013; 27(2): 42—53.
problems of virology. 2018; 63(1)
DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2018-63-1-36-40
ORIGINAL REsEARcH
REFERENCES
1. Kunze U. The International Scientific Working Group on TickBorne Encephalitis (ISW TBE): Review of 17 years of activity and commitment. Ticks Tick Borne Dis. 2016; 7(3): 399—404.
2. Amato-Gauci A.J., Zeller H. Tick-borne encephalitis joins the diseases under surveillance in the European Union. Euro Surveill. 2012; 17(42): 2—3.
3. King A.M.Q., Adams M.J., Carstens E.B., Lefkowitz E.J. Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. San Diego: Elsevier Academic Press; 2012.
4. Lvov D.K., Shchelkanov M.Y., Alkhovsky S.V., Deryabin P.G. Zoonotic Viruses of Northern Eurasia. Taxonomy and Ecology. London: Academic Press. Elsevier; 2015.
5. Verkhozina M.M., Zlobin V.I., Kozlova I.V., Doroshchenko E.K., Lisak O.V., Demina T.V. et al. Molecular Epidemiology and Ecology ofTick-borne Encephalitis Virus in Eastern Siberia [Molekulyarnaya epidemiologiya i ekologiya virusa kleshchevogo entsefalita v Vostochnoy Sibiri]. Novosibirsk: SibAK; 2017. (in Russian)
6. Kozlova I.V., Doroshhenko E.K., Lisak O.V., Dzhioev Yu.P., Verhozina M.M., Demina T.V. et al. Species and genetic diversity of agents of tick-borne infections in the territory of Eastern Siberia. Byulleten' Vostochno-Sibirskogo nauchnogo tsentra Sibirskogo otdeleniya Rossiyskoy akademii meditsinskikh nauk. 2012; (2-2): 75—82. (in Russian)
7. Demina T.V., Dzhioev Yu.P., Verkhozina M.M, Kozlova I.V., Tkachev S.E., Doroshchenko E.K. et al. Molecular epidemiology oftick-borne encephalitis virus: geographical variability, determined by the method of molecular hybridization. Epidemiologiya i vaktsinoprofilaktika. 2009; (3): 27—39. (in Russian)
8. Kim S.Y., Yun S.M., Han M.G., Lee I.Y., Lee N.Y., Jeong Y.E. et al. Isolation of tick-borne encephalitis viruses from wild rodents, South Korea. Vector Borne Zoonotic Dis. 2008; 8(1): 7—13.
9. Andaev E.I., Belikov S.I., Kulakova N.V., Borisova T.I., Sidorova E.A. Characterization of the virus of tick-borne encephalitis virus of the Siberian subtype isolated from a patient with a progressive
course of the disease. Epidemiologiya i vaktsinoprofilaktika. 2014; (4): 31—7. (in Russian)
10. Adelshin R.V., Melnikova O.V., Karan L.S., Andaev E.I., Balakhonov S.V. Complete Genome Sequences of Four European Subtype Strains of Tick-Borne Encephalitis Virus from Eastern Siberia, Russia. GenomeAnnounc. 2015; 3(3): 00609—15.
11. Kulakova N.V., Andaev E.I., Belikov S.I. Tick-borne encephalitis virus in Eastern Siberia: complete genome characteristics. Arch. Virol. 2012; 157(11): 2253—5.
12. Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Mol. Biol. Evol. 2013; 30(12): 2725—9.
13. Yakimenko V.V., Tkachev S.E., Makenov M.T., Mal'kova M.G., Lyubenko A.F., Rudakova S.A. et al. On the spread of tick-borne encephalitis virus of the European subtype in western Siberia and the Altai. Dal'nevostochnyy zhurnal infektsionnoypatologii. 2015; (27): 29—35. (in Russian)
14. Perera R., Kuhn R.J. Structural proteomics of dengue virus. Curr. Opin. Microbiol. 2008; 11(4): 369—77.
15. Chambers T.J., Nestorowicz A., Amberg S.M., Rice C.M. Mutagenesis of the yellow fever virus NS2B protein: effects on proteolytic processing, NS2B-NS3 complex formation, and viral replication. J. Virol. 1993; 67(11): 6797—807.
16. Kozlovskaya L.I., Osolodkin D.I., Shevtsova A.S., Romanova L.Iu., Rogova Y.V., Dzhivanian T.I. et al. GAG-binding variants of tickborne encephalitis virus. Virology. 2010; 398(2): 262—72.
17. Kozlovskaya L.I., Osolodkin D.I., Karganova G.G. Analysis of the molecular dynamics of TBEV proteins E variants based on the difference of correlation matrices. Trudy Instituta poliomielita i virusnykh entsefalitov imeni M.P. Chumakova RAMN. Meditsinskaya viruso-logiya. 2013; 27(2): 42—53. (in Russian)
18. Khasnatinov M., Ustanikova K., Frolova T.V., Pogodina V.V., Boch-kova N.G., Levina L.S. et al. Non-haemagglutinating flaviviruses: molecular mechanisms of the emergence of new strains via adaptation to European ticks. PLoS ONE. 2009; 4(10): e7295.
Поступила 13.07.17 Принята в печать 17.10.17
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018 УДК 616.831-002-022:578.833.26]-078.33
Чернохаева Л.Л.1, Майкова Г.Б.1, Рогова Ю.В.1, Романенко В.В.2, Анкудинова А.В.3, Килячина А.С.2,
Ворович М.Ф.14, Карганова Г.Г.1'4
СОПОСТАВЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА И РЕАКЦИИ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ПРИ ОЦЕНКЕ ЗАЩИЩЁННОСТИ НАСЕЛЕНИЯ
ОТ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА
1ФГБНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН», 108819, г. Москва;
2ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Свердловской области», 620078, г. Екатеринбург; 3ФБУН «Екатеринбургский НИИ вирусных инфекций» Роспотребнадзор, 620072, г. Екатеринбург; 4 ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России,119991, г. Москва
При изучении иммунной прослойки населения и для оценки иммуногенности вакцинных препаратов обычно используют метод иммуноферментного анализа (ИФА), который даёт представление об общем пуле противовирусных антител, а также реакцию нейтрализации (РН), по результатам которой можно судить о защищённости человека от вируса. Защитным титром в ИФА считается 1:100, а в РН 1:10. Очевидно, что соотношение общего пула и нейтрализующих вирус антител может варьировать как при естественной иммунизации, так и после вакцинации.
В данной работе методами ИФА и РН были исследованы сыворотки крови жителей Свердловской области в возрасте от 1 года до 60 лет, собранные до иммунизации и через 30 дней после двух иммунизаций инак-тивированными вакцинами против клещевого энцефалита разных производителей. Введение препаратов осуществляли либо по стандартной схеме (интервал между иммунизациями 30 дней), либо по экстренной схеме (интервал 14 дней). Было показано, что данные о наличии противовирусных антител в защитных титрах, полученные по результатам ИФА и РН, совпадают более чем в 85% случаев. Расхождения между
Для корреспонденции: Карганова Галина Григорьевна, д-р биол. наук, проф., зав. лаб. Биологии арбовирусов ФГБНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН», г. Москва. E-mail: [email protected]
