CC BY
10УДК 616.8-07:575.113
Т.В. Осадчук, К. А. Моссэ, Н.В. Румянцева
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭКСПАНСИИ СТС-ПОВТОРОВ В ГЕНЕ БМРК У ПАЦИЕНТОВ С МИОТОНИЧЕСКОЙ ДИСТРОФИЕЙ 1 ТИПА
ГУ Республиканский научно-практический центр «Мать и дитя», МЗ РБ Республика Беларусь, 220053, г. Минск, Орловская,66
Введение
Миотоническая дистрофия представляет собой частую форму мышечной дистрофии взрослых (распространенность - от 2 до 15 на 100000 человек) [1]. Заболевание наследуется по аутосомно-доминантному типу.
Заболевание характеризуется мультисистем-ностью поражения с широкой вариабельностью клинических проявлений, основными из которых являются миотония, мышечные атрофии и парезы скелетной мускулатуры, кардиомиопатия, катаракта, эндокринные нарушения [2, 3].
Первые симптомы обычно появляются в пубертатном возрасте или позже. Если мышечная слабость возникает до 20-летнего возраста, то она неуклонно прогрессирует и приводит к значительному снижению мышечной силы в кистях и стопах у взрослых пациентов. Для развернутой стадии болезни характерны миотония, слабость лицевой мускулатуры и дистальных отделов конечностей, катаракта, раннее облысение, эндокринные нарушения [4]. Лицо больных удлиненное и утонченное вследствие слабости височных и жевательных мышц; шея тонкая из-за атрофии грудино-ключично-сосцевидных мышц; веки и углы рта опущены, нижняя половина лица провисает. Атрофии мышц конечностей наиболее выражены в дистальных отделах: предплечьях и малоберцовых мышцах, на поздних стадиях заболевания развиваются атрофии мелких мышц кистей. Эндокринные нарушения включают тестикулярную атрофию, бесплодие у женщин, гиперинсулинизм, сахарный диабет, атрофию надпочечников и нарушение секреции гормона роста. В поздних стадиях может развиваться тяжелая кардиомиопатия [5].
Ген, ответственный за развитие миотониче-ской дистрофии, локализуется на хромосоме
19 в локусе q13.2-13.3 и кодирует синтез белка миотонинпротеинкиназы [6].
Миотоническая дистрофия - яркий представитель заболевания с «динамическим» типом мутации: у больных имеет место экспансия тандемных тринуклеотидных повторов CTG (цитозин-тимин-гуанин), расположенных в 3'-нетранслируемой области гена [7].
Природа генных дефектов, приводящих к развитию болезней «экспансии», заключается в увеличении числа тринуклеотидных повторов, расположенных в регуляторной или в ко -дирующей частях генов. Предположительно в основе механизма экспансии лежит нарушение процесса репликации микросателлитной ДНК, но целый ряд молекулярных аспектов в патогенезе болезней экспансии и их наследовании все еще остается непонятным и продолжает активно изучаться.
Увеличение числа повторов может по-разному сказываться на функциях соответствующих генов. При миотонической дистрофии увеличение числа тринуклеотидных повторов (CTG) нарушает транскрипцию и приводит к дефициту соответствующих белков (мутации типа loss-of-function) [8, 9]. Для тринуклеотидных повторов, экспансия которых блокирует функцию гена, характерен выраженный по-пуляционный полиморфизм, причем их число в норме может варьировать от единиц до нескольких десятков. Особенностью заболевания является также эффект антиципации - нарастание тяжести симптомов заболевания в последующих поколениях в результате дальнейшего увеличения числа триплетов после того, как их количество превысило нормальное.
В случае миотонической дистрофии тяжесть заболевания особенно быстро нарастает при передаче мутантного аллеля от матери [10, 11].
Врожденная форма миотонической дистрофии наблюдается только при наследовании хромосомы с экспансией от матери. Данный факт объясняется тем, что количество тринуклеоидных повторов может увеличиваться в ходе мейоза, а при сперматогенезе этот процесс не происходит. Уменьшение длины мутантного повтора (почти до нормы) у потомков с легкой клинической картиной и бессимптомным течением наблюдается при отцовской передаче гена [12].
Непосредственное определение мутантного аллеля гена миотонинпротеинкиназы (DMPK) методом ПЦР может проводиться только у больных с небольшой степенью экспансии CTG-повторов (не более 100 триплетов) [13]. При большем числе повторов амплификация с помощью ПЦР обычно не достигается. В этих случаях размер фрагмента определяют методом блот-гибридизации по Саузерну с соответствующими ДНК-зондами [14].
Классификация аллелей по размеру была принята на Втором Международном Консор-
циуме по миотонической дистрофии в 1999 году [15]. Нормальные аллели содержат от 5 до 35 CTG повторов. Премутантные аллели -от 35 до 49 CTG-повторов. Лица с прему-тантными аллелями не имеют клинических проявлений, но при наследовании их детьми такой хромосомы имеется высокий риск развития проявлений миотонической дистрофии (если один из родителей имеет экспансию в гене DMPK, то риск для каждого его ребенка составляет 50%). Мутантные аллели - это аллели, содержащие более 50 CTG-повторов, которые ассоциированы с манифестацией заболевания.
Как показано в таблице 1, существует тесная корреляция между числом CTG-повторов и тяжестью клинического симптомокомплекса: пациенты с небольшой степенью экспансии триплетов (40-160 копий) имеют минимальные клинические проявления. Больные с развернутой клинической картиной имеют большее число копий триплетов.
Таблица 1
Корреляция длины CTG-повторов и фенотипа при миотонической
дистрофии тип 1 [15, 16]
Число CTG-повторов Клинические симптомы Форма заболевания Возраст начала заболевания
5-34 Отсутствуют Норма -
35-49 Отсутствуют Премутация -
50-150 Катаракта Легкая форма миотонии Мягкая форма 20-70 лет
100-1000 Слабость Миотония Катаракта Кардиальные аритмии Классическая 10-30 лет
>2000 Врожденная гипотония Умственная отсталость Врожденная С рождения до 10 лет
В данной работе представлены результаты, впервые выполненной в Беларуси молекулярно-генетической диагностики
миотонической дистрофии 1 типа у пациентов с клинически предполагаемым диагнозом.
Материалы и методы
Исследуемую группу для ДНК-анализа составили 36 пациентов и 39 членов их семей. Отбор больных проводился в соответствии с диагностическими критериями нервно-мышечных болезней, принятыми в 1998 году
Европейским Нервно-мышечным Центром. Учитывались клинические данные, возраст начала заболевания, темпы прогрессирования, семейный анамнез. Все пациенты осмотрены неврологом, окулистом и эндокринологом. Ма-
териалом для исследования являлась геномная ДНК, выделенная из лейкоцитов периферической крови пробандов с клиническим диагнозом миотоническая дистрофия или с подозрением на нее, а также членов их семей.
Для молекулярно-генетической диагностики использовали прямое определение количества СТО-повторов в гене БМРК по размеру синте-
зированного методом ПЦР фрагмента.
Продукты ПЦР анализировали с помощью автоматического капиллярного электрофореза в генетическом анализаторе ABI PRISM 310 (Applied Biosystems). Обработку данных и определение аллелей выполняли с помощью пакета компьютерной программы GENESCAN (Applied Biosystems).
Результаты и обсуждение
По результатам ДНК-анализа было выявлено три семьи (3 пробанда и 9 членов их семей), в которых наблюдалась экспансия СТО-повторов. В первой семье, родословная которой представлена на рисунке 1, аллель с 70 СТО-повторами обнаружен у пациента (1.2) с минимальными клиническими проявлениями миотонической дистрофии. Результаты анализа БМРК-аллеля с экспансией представлены на рисунке 2. Небольшая экспансия определяет мягкую форму заболевания со стертыми клиническими проявлениями и поздним дебютом. Так как заболевание наследуется по аутосомно-доминантному типу, дети пациента имеют 50% риск наследования заболевания. В связи с этим им была рекомендована молекулярно-генетическая диагностика с целью исключения или подтверждения диагноза. У старшей дочери (П.1) было обнаружено два аллеля с нормальным
числом СТО-повторов (нормальный генотип), что свидетельствует об отсутствии заболевания. У младшей дочери (П.2) с симптомами заболевания был идентифицирован один аллель с нормальным числом СТО-повторов, который она унаследовала от матери и мутантный аллель с увеличенным числом СТО-повторов, унаследованный от отца. В данном случае при наследовании имела место мейотическая нестабильность аллеля с экспансией, которая и составляет основу феномена «антиципации» - нарастания тяжести клинических проявлений в последующих поколениях [17]. Внучка пациента имеет тяжелую врожденную форму мио-тонической дистрофии, как результат дальнейшего нарастания числа повторов при наследовании мутантного аллеля. Во всех случаях увеличение числа тринуклеотидных повторов было подтверждено блот-гибридизацией по Саузерну.
II rSJS CTG
L2
11Л1
Ш.1
11ЛЗ
Ш.2
11ЛЗ
Ш.З
□
Рис. 1. Родословная семьи Ш.
Рис. 2. Результаты анализа продуктов амплификации БМРК-аллелей с экспансией СТв-повторов. Вариант генотипа 13/70. Стрелкой показана экспансия тринуклеотидных повторов.
Как видно из родословной, представленной на рисунке 3, вторая семья представлена 6 больными с различной степенью тяжести клинических проявлений миотонии. Исследование показало, что отец пробанда (11.1) и три его сестры имеют один нормальный редкий аллель с 20 СТв-повторами. Частота этого аллеля в популяции Беларуси составляет 0,5% [18]. Соответственно, вероятность экспансии на второй хромосоме значительно выше, чем вероятность гомозиготного носительства данного аллеля. Пробанд Ш.1 также унаследовал от отца аллель
с высоким риском экспансии. Такие же результаты были получены и для дочери (Ш.2) одной из сестер (11.2). Во всех образцах увеличение числа СТв-повторов было подтверждено блот-гибридизацией по Саузерну. Пациенты Ш.3 и Ш.4 унаследовали от матери аллель с 20 СТв-повторами и являются гетерозиготами по двум нормальным аллелям. ДНК-анализ позволил исключить у них риск заболевания, несмотря на то, что у матери наблюдается типичная клиническая картина, характерная для классической формы миотонической дистрофии.
Рис. 3. Родословная семьи М.
Третья семья представлена тремя больными. Аллель с 86 СТв-повторами идентифицирован у пробанда с минимальными клиническими проявлениями миотонической дистрофии. У его
сына, унаследовавшего хромосому с экспансией, наблюдается классическая форма заболевания. Также диагноз «миотоническая дистрофия» был подтвержден у племянницы пробанда.
Заключение
Таким образом, прямое определение количества СТв-повторов в гене БМРК с помощью ПЦР-анализа является эффективным методом верификации или исключения диагноза миотонической дистрофии. Амплификация области триплетных повторов с последующим электрофоретическим анализом синтезированных продуктов позволяет провести генотипирование аллелей. Установление ге-терозиготности является важным критерием для отбора нормальных образцов на первом этапе диагностики. При этом очень большое значение имеет разрешающая способность метода. Так как пары аллелей могут отличаться по длине всего на один тринуклеотид,
необходимо, чтобы после электрофоретиче-ского анализа свободно идентифицировались фрагменты ДНК с разницей в 3 п.н. Прямое определение количества СТв-повторов с использованием автоматического капиллярного электрофореза позволяет надежно определять такие аллели. При обследовании семьи с миотонической дистрофией имеется также возможность проследить передачу мутант-ного гена из поколения в поколение даже в случае невозможности идентификации экспансии (информативная семья). У больных определяется только один аллель с нормальным числом СТв-повторов, который унаследован от здорового родителя.
Список использов
1. Emery A. Population frequencies of inherited neuromuscular diseases - a world survey/
A. Emery // Neuromuscul. Disord. - 1991. -Vol. 1. - P. 19-29.
2. Buyse M. L. Birth defects / M.L. Buyse // 1990. - Vol. 2. - P. 1206-1208.
3. Dubowitz V. Muscle disorders in childhood / V. Dubowitz // - W.B. Saunders company, 2nd edition, 1995.
4. McKusick V. A. Mendelian inheritance in man / V.A. McKusick // - The Johns Hopkins University press, 3rd edition, 1992.
5. Яхно Н.Н. Болезни нервной системы / Н.Н. Яхно, Д.Р. Штульман // - М.: Медицина. - 2001.
6. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3 end of a transcript encoding a protein kinase family member / J.D. Brook [et al.] // Cell. -1992. - Vol. 68. - P. 799-803.
7. Size of the unstable CTG repeat sequence in relation to phenotype and parental transmission in myotonic dystrophy / H.G. Harley [et al.] // Am. J. Hum. Genet. - 1993. - Vol. 52. -P. 1164-1174.
8. Richards Robert I. Dynamic mutations: a decade of unstable expanded repeats in human genetic disease / Robert I. Richards // Hum. Mol. Genet. - 2001. - Vol. 10. - P. 2187-2194.
9. Иванов В.И. Геномика - медицине /
B.И. Иванов, Л. Л. Киселев // - М.: ИКЦ «Академкнига», 2005.
10. Бочков Н.П. Клиническая генетика / Н.П. Бочков // - М.: «Гэотар-мед», 2001.
1ННЫХ источников
11. Emery A. Diagnostic Criteria for Neuro-muscular Disorders / A. Emery // 2nd edition. -1998. - P. 27-29.
12. Иллариошкин С.Н. Новый механизм мутации у человека: экспансия тринуклео-тидных повторов (обзор) / С.Н. Иллариошкин, И.А. Иванова-Смоленская, Е.Д. Маркова // Генетика. - 1995. - Т. 31, № 11. -С. 1478-1489.
13. Иллариошкин С.Н. ДНК-диагностика и медико-генетическое консультирование в неврологии / С.Н. Иллариошкин., И.А. Иванова-Смоленская, Е.Д. Маркова // -М.: МИА, 2002.
14. Горбунова В.Н. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний / В.Н. Горбунова, В.С. Баранов // - СПб.: Специальная литература, - 1997.
15. Second International Myotonic Dystrophy Consortium (2000)/ New nomenclature and DNA testing guidelines for myotonic dystrophy type 1 (DM1).
16. Genotype-phenotype correlation in myo-tonic dystrophy / E. Gharehbagni-Schnell [et al.] // Clin. Genet. - 1998. - Vol.53. - P. 20-26.
17. Малышева О.В. Популяционный и семейный анализ повторов в гене IT-15 / О.В. Малышева, Т.Э. Иващенко, В.С. Баранов // Генетика. - 2001. - Т. 37, №3. - С. 402-406.
18. Осадчук Т.В. Полиморфизм трину-клеотидных CTG-повторов в гене миотонин-протеинкиназы в белорусской популяции / Т.В. Осадчук, К.А. Моссэ // Вести АН РБ, мед. серия. - 2009. - №1. - С. 61-65.
Дата поступления статьи 17 апреля 2009 г.
