CC BY
27
УДК 632.35
Логвинова А.Н., Бехбудзаде Н.Б., Дмитриева Е.Н., Марквичев Н.С.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ АГЕНТОВ БИОКОНТРОЛЯ ПРОТИВ ФИТОПАТОГЕННЫХ АГРОБАКТЕРИЙ В РИЗОСФЕРЕ РАСТЕНИЙ
Логвинова Анастасия Николаевна, студент 4-го курса факультета биотехнологии и промышленной экологии; e-mail: nast.logwinowa2013 @yandex.ru
Бехбудзаде Нурлан Башир оглы, аспирант факультета биотехнологии и промышленной экологии; Дмитриева Евгения Николаевна заведующая лабораторией кафедры биотехнологии Марквичев Николай Семенович к.т.н., доцент кафедры биотехнологии
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
Различные виды заболеваний растений приводят к значительному уменьшению урожайности во все мире. Основными бактериальными фитопатогенами, поражающими большое количество сельскохозяйственных культур, являются агробактерии, подавление которых возможно за счёт внесения в почву непатогенных форм, используемых в качестве агентов биоконтроля. В результате того, что существует всё больше исследований молочнокислых бактерий, как микроорганизмов, выделяющих антибактериальные соединения, то необходимо определить их влияние на агробактерии, в частности, на A. tumefaciens.
Ключевые слова: пестициды, ризосфера, фитопатоген, почва, агробактерии
DETERMINATION OF THE EFFECTIVENESS OF BIOCONTROL AGENTS AGAINST PHYTOPATHOGENIC AGROBACTERIUM IN THE RHIZOSPHERE OF PLANTS
Logvinova A.N., Behbudzade N.B., Dmitrieva E.N., Markvichev N.S. D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia
Various types of plant diseases lead to a significant reduction in crop yields throughout the world. The main bacterial phytopathogens affecting a large number of crops are agrobacteria, the suppression of which is possible due to the introduction into the soil of non-pathogenic forms used as biocontrol agents. As a result of the fact that there are more and more studies of lactic acid bacteria, like microorganisms that release antibacterial compounds, it is necessary to determine their effect on agrobacteria, in particular A. tumefaciens.
Keywords: pesticides, rhizosphere, phytopathogen, soil, agrobacteria
Сельское хозяйство является важнейшим видом деятельности человека с начала цивилизации. Неизбирательная эксплуатация ресурсов
ограничивает их продуктивность, и люди ищут альтернативные источники для удовлетворения своих потребностей в средствах к существованию. Деструктивный потенциал болезней растений усилился благодаря современным методам ведения сельского хозяйства. Основной проблемой, нарушающей экологический баланс, является чрезмерная зависимость сельского хозяйства от химических удобрений, часто приводящих к распространению опасных для жизни веществ, которые нарушают взаимодействия между растениями и микробами путем изменения биогеохимических циклов. Вследствие
возникновения резистентности к пестицидам, каждый год появляются все более токсичные препараты, поэтому необходимо сосредоточить внимание на биологических методах защиты растений в качестве жизнеспособной альтернативы для борьбы с сельскохозяйственными вредителями и фитопатогенными микроорганизмами [1].
Существует широкий круг микроорганизмов, которые находятся в динамической почвенной зоне, называемой ризосферой, попадающей
непосредственно под влияние корневых экссудатов, выступающих в качестве источников питания. Экссудаты - органические соединения, выделяемые корнями растений, включающие аминокислоты, жирные кислоты, нуклеотиды, органические кислоты и т.д. Среди ризосферных микроорганизмов могут быть и патогенные формы, вызывающие биотический стресс у растений, что приводит к значительному снижению урожайности
сельскохозяйственных культур [1].
Мировое производство продуктов питания страдает в основном из-за фитопатогенов. Наиболее распространенными из них являются агробактерии, как бактериальные возбудители болезней растений, в частности, A.tumefaciens, имеющий широкий диапазон хозяев. Данный вид бактерий вызывает такое заболевание, как «корневой рак», считающийся глобальной проблемой сельского хозяйства на данный момент, экономические потери из - за которого во всем мире только растут. В основном, это касается питомников фруктовых
деревьев, орехов, виноградном лозы, овощей и декоративных растений [2], но в последнее время все чаще данное заболевание можно встретить и в условиях защищенного грунта. Основная причина потери урожайности в том, что галлы опоясывают большую часть корня растения, тем самым ухудшая транспорт питательных веществ и воды. Более того, раны, образовавшиеся на опухоли, представляют поверхность для развития других патогенных почвенных микроорганизмов, что ещё больше увеличивает вредоносность. В настоящее время не удается избавиться от A. tumefaciens химическим методом, поэтому перспективным вариантом является биологический контроль агробактерий за счёт внесения антагонистических непатогенных форм [3], а также управление биоценозом микроорганизмов в ризосфере растения.
В качестве исследуемых микроорганизмов, потенциально влияющих на данный фитопатоген,
были выбраны Trichoderma viride (штамм F2001), Bacillus subtilis (штамм B1018) и Pseudomonas fluorescens (штамм B1001), как наиболее распространенные агенты биоконтроля. Эти и остальные штаммы, используемые в работе, были взятые из коллекции штаммов кафедры биотехнологии РХТУ им. Менделеева. Взаимодействие данных микроорганизмов вместе с A. tumefaciens (штамм В1120) рассматривалось на специальной агаризованной среде, основанной на модели экссудатов, состоящей из 0,5 г/л янтарной кислоты; 0,5 г/л лимонной кислоты и 0,1 г/л дрожжевого экстракта (рис.1). Данная модель выбрана исходя из анализа литературных данных о составе экссудатов огурца. Засев полезных микроорганизмов к агробактериям производился штрихом в стерильных условиях методом «Перекрестия», чашки инкубировали 5 суток при температуре 26-28 градусов.
Рис. 1. Взаимодействие A. tumefaciens с T. viride (слева), P. fluorescens (в центре), B. subtilis (справа)
На основе полученных данных выявлено, что предложенные микроорганизмы не оказывают влияние на исследуемый патоген, поэтому необходимо найти такой микроорганизм, который, при внесении элективного компонента, будет подавлять A. tumefaciens.
Одним из перспективных в этой области микроорганизмов могут быть молочнокислые бактерии, в частности, L.plantarum, которые способны метаболизировать молочную кислоту и разнообразные противомикробные соединения. Помимо прямого антагонизма к фитопатогенам, обработка L.plantarum может изменить реакцию растения на патогены, тем самым улучшая их врожденный иммунитет [4].
Так как растения, выделяющие значительную долю фотосинтетического фиксированного углерода в корневые экссудаты (сахара, сигнальные соединения, ферменты и другие химические вещества), изменяют почвенную среду для отбора конкретных микробных сообществ, где органические кислоты быстро распадаются, ограничивая способность Lplantarum подкислять ризосферу в свою пользу [4], то на основании данного фактора необходимо определить элективный компонент, активизирующий рост L.plantarum, позволяющий стать им доминирующим микроорганизмом в смешанных культурах,
благодаря их способности подкислять окружающую среду почвы до уровня, при котором уменьшается выживаемость патогенных микроорганизмов.
Для проведения данного эксперимента на первом этапе определяли антагонистическую активность L.plantarum (штамм В1100) по отношению к агробактериям на питательной среде MRS (рис.2). Микроорганизмы засевали методом «Перекрестия», причём посев агробактерий А. tumefaciens производили одновременно, а также через 3 и 5 сутки после молочнокислых микроорганизмов. Чашки инкубировали 2 суток, затем анализировали результаты.
Рис. 2. Взаимодействие L.plantarum и А. tumefaciens на 1 сутки (слева), 3 сутки (в центре),5 сутки(справа)
В ходе данного эксперимента было обнаружено что, при посеве агробактерий вместе с L.plantarum наблюдается подавление фитопатогена,
проявляющееся ростом L.plantarum на поверхности А. tumefaciens. При посеве А. tumefaciens к L.plantarum на 3 сутки образуется зона просветления между двумя микроорганизмами, что говорит о подавлении А. tumefaciens исследуемыми молочнокислыми бактериями за счёт выделения L.plantarum продуктов метаболизма. При посеве на 5 сутки зона подавления становится больше, что доказывает тот факт, что L.plantarum метаболизирует различные антибактериальные бактериоцины, действуя как агент биоконтроля. По опытным данным следует, что рост агробактерий заметно уменьшается, что является результатом выделения ещё большего количества противопатогенных соединений с течением времени, обеспечивающих подавление А. tumefaciens.
В дальнейшем было решено исследовать взаимодействие L.plantarum c A.tumefaciens на питательной среде, основанной на модели экссудатов огурца, которая является наиболее приближенной к реальным условиям существования ризосферных микроорганизмов. Но, поскольку молочнокислые микроорганизмы обладают слабым ростом на данной среде, было целесообразно подобрать такой стимулирующий элективный компонент, при внесении которого обеспечивался бы рост L.plantarum и подавление A.tumefaciens.В качестве такого компонента был исследован дрожжевой экстракт, как источник свободных аминокислот и пептидов. В среду, содержащую модель экссудатов огурца, описанную выше, добавляли дрожжевой экстракт в концентрациях 0,10,20,40 г/л. Результаты представлены на рис.3.
Рис. 3. Рост L.plantarum на агаризованной среде с концентрацией ДЭ: 0,10,20,40 г/л (слева направо)
Было выявлено, что Lplantarum способен расти на среде, содержащей экссудаты и дрожжевой экстракт, причём с увеличением концентрации стимулирующего агента, наблюдается усиление роста молочнокислых бактерий.
Данный опыт позволяет провести дальнейшие исследования, основанные на определении взаимодействия L.plantarum с исследуемым патогенным микроорганизмом на экссудатах, при положительном результате которых возможен контроль бактериальных заболеваний
сельскохозяйственных культур.
Таким образом, данная статья демонстрирует возможное регулирование биоценоза
микроорганизмов за счёт питательных компонентов среды, как альтернативный подход для подавления А. tumefaciens в почве, где по меньшей мере 20-40% потерь урожая вызывают фитопатогенные микроорганизмы. В качестве основного микроорганизма, влияющего на заболевания, вызываемые А. tumefaciens, можно использовать L.plantarum, как агент, метаболизирующий разнообразные противомикробные соединения,
поэтому необходимо проводить дальнейшее изучение взаимодействия молочнокислых бактерий с А. tumefaciens, с целью подавления его в ризосфере растения.
Список литературы
1. Sushanto, G., Rout G. K. Revitalization of plant growth promoting rhizobacteria for sustainable development in agriculture // Microbiological Research. - 2018. - Т. 206. - Р. 131-140.
2. Pâcurara D. I., Hans T.-C. Agrobacterium tumefaciens: From crown gall tumors to genetic transformation // Physiological and Molecular Plant Pathology. - 2011. - Vol.76. №2. - Р. 76-81.
3. Tarkowski, P. Threats and opportunities of plant pathogenic bacteria / P. Tarkowskia, D. Vereecke // Biotechnology Advances. - 2014. - Vol. 32. № 1. - Р. 215-229.
4. Lamonta, J., Wilkinsa, O. From yogurt to yield: Potential applications of lactic acid bacteria in plant production // Soil Biology and Biochemistry. - 2017. -V. 111. - P. 1-9.
