CC BY
32
Материалы X съезда ВНПОЭМП, Москва, 12-13 апреля 2012 г.
Инфекция и иммунитет
Применение иммунного лактоглобулина для экстренной профилактики сальмонеллезной инфекции, вызванной антибиотико- и фагорезистентными штаммами 8. 1урЫтигшш в одной из групп детского сада и в родильном доме предотвратило инфекцию у 144 человек контактных с заболевшими. Таким образом, применение лактоглобулина против условно-патогенных бактерий и сальмонелл эффективно для профилактики ОКЗ у детей раннего возраста.
ПОИСК ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИХ ГРУПП ГЕНОВ ПОВЕРХНОСТНЫХ ПРОТЕИНОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА IN SILICO
В.В. Алексеева1, О.Н. Гузенков2, Д.В. Викторов1, В.А. Антонов1
'ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора г. Волгоград; 2ГБОУ ВПО «ВолгГМУ Минздравсоцразвития России», г. Волгоград
Мелиоидоз и сап — особо опасные инфекционные заболевания человека и животных, экспресс-диагностика которых затруднена. Поэтому поиск высокоспецифичных мишеней (антигенов), пригодных для использования их в новых диагностических тест-системах остается актуальной проблемой. Целью настоящего исследования являлся сравнительный анализ известных последовательностей геномов патогенных видов Burkholderia in silico и выявление дифференцирующих групп кодирующих последовательностей поверхностных биополимеров специфичных для возбудителей ме-лиоидоза и сапа.
Для первоначального отбора кандидатных мишеней использовали интернет-ресурс Pathema (http:// pathema.jcvi.org/Pathema/). Всего было отобрано 11 поверхностных белков специфичных для возбудителя мелиоидоза и 1 белок для возбудителя сапа, общее число дифференцирующих нуклеотидных последовательностей составило 131 и 10, соответственно. Далее с использованием программы Vector NTI изучаемые сиквенсы транслировали в белковые молекулы и проверены на наличие гомологии с другими организмами в сетевом сервисе BLAST (http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), где была подтверждена их уникальность для изучаемых бактерий. После кластерного анализа в приложении Vector NTI AlignX были отобраны белки, сформировавшие наиболее гомогенные группы. Затем для каждого кластера белков в on-line программе BepiPred (http:// www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred) изучали потенциальные антигенные свойства протеинов и выделяли линейные эпитопы. Далее в программе Vector NTI была сформирована библиотека выявленных эпито-пов и проведен их кластерный анализ. После анализа полученных результатов выявлено 8 кандидатных поверхностных протеинов возбудителя мелиоидоза, содержащих от 2 до 33 эпитопных сайтов. При этом больший интерес представляли белки OmpA и HrcV, содержащие эпитопы, порядок расположения и аминокислотная последовательность которых были идентичные. Поиск дифференцирующих групп генов для возбудителя сапа не дал положительного результата. Таким образом, обнаруженные группы протеинов могут являться главной мишенью для создания универсальной тест-системы для обнаружения возбудителя мелиоидоза.
ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОГЕННЫХ СВОЙСТВ АНТИГЕНОВ Y. PESTIS EV11MP FSK3
Т.В. Аленкина, Е.Л. Воропаева, Г.В. Бочкарева, А.К. Никифоров, О.А. Волох
ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Роспотребнадзора, г. Саратов
Фракция I — основной иммуногенн Y. pestis, который широко используется при разработке диагностических и вакцинных препаратов. Для получения поли-и моноклональных антител к фракции I, применяют корпускулярный антиген — цельные клетки чумного микроба, выращенные при 37°С, а также очищенный препарат фракции FI. Штаммом продуцентом, как правило, является вакцинный штамм Y. pestis EV линии НИИЭГ, который характеризуется повышенными питательными потребностями и невысокой скоростью роста при 37°С, хотя именно эта температура является оптимальной для синтеза антигена FI.
Методы генной инженерии позволяют создавать штаммы гиперпродуценты целевого антигена с одной стороны, авирулентные — с другой. Важную роль при этом играет стабильность штаммов в наследовании генетической информации. Авторский штамм Y. pestis EV11MpFSK3 получен из вакцинного штамма Y. pestis EV и депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (Анисимов А.П., 1995). Его генетической особенностью является расположение fra-оперона на плазми-де pPst в Scopl. Является суперпродуцентом фракции I, секретируя его в среду культивирования при 28°С (Никифоров А.К., 1995). Иммуногенные свойства антигенов авторского штамма до сих пор не изучались, что и определило цель настоящего исследования.
Изучение активности сывороток, полученных к корпускулярным антигенам, в объемной РА с культурами вакцинного и авторского штаммов показало отсутствие кросс-реагирования. Активность к гомологичному штамму находилась в пределах 1:3201:1280 для Y. pestis EV, 1:1280 для Y. pestis EV11MpFSK3. Активность сывороток к фракции I выявило высокую специфичность антифракционных сывороток Y. pestis EV, которые не взаимодействовали с клетками Y. pestis EV11MpFSK3, в то время как аналогичные сыворотки Y. pestis EV11MpFSK3 агглютинировали культуру вакцинного штамма в начальных разведениях (1:20—1:40). Сыворотки к фракции I авторского штамма были в 2 раза активнее антифракционных сывороток Y. pestis EV — 1:640-1:1280 и 1:320-1:640 соответственно.
Заключение. Изучение иммуногенных свойств фракции I и корпускулярных антигенов штаммов Y. pestis EV11MpFSK3 и Y. pestis EV линии НИИЭГ на данном этапе выявило преимущество авторского штамма для получения высокоактивных сывороток к фракции I.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА К РИФАМПИЦИНУ В МОКРОТЕ У БОЛЬНЫХ С НАЛИЧИЕМ ИЛИ ОТСУТСТВИЕМ КОИНФЕКЦИИ ВИЧ
М.В. Альварес Фигероа12, Е.А. Долгова12, М.А. Гордукова12, Г.П. Лобашева2
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва; 2ГУ Туберкулезная клиническая больница № 7 Департамента здравоохранения г. Москвы
На фоне высокого распространения резистентного к антибиотикам туберкулеза (ТБ), а также уве-
2012, Т. 2, № 1-2
Современное лабораторное обеспечение.
личения количества больных на поздних стадиях ВИЧ-инфекции, при которых ТБ развивается как вторичное заболевание, быстрое определение резистентности к противотуберкулезным препаратам (ПТП) влияет на положительный исход заболевания. Золотым стандартом среди быстрых тестов является метод прямого секвенирования.
Целью нашей работы явилось сравнение определения чувствительности МБТ к основному ПТП рифампицину с помощью культурального метода и секвенирования.
Материалом для исследования явилось 135 образцов мокроты от 128 больных легочным туберкулезом, у которых традиционными микробиологическими методами было определено бактериовыделение. При исследовании методом секвенирования с помощью набора реагентов «АмплиСенс® МТС-Rif-seq» (производства ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) 33 образцов от 32 впервые выявленных больных ТБ без ВИЧ-коинфекции, в 37,5% случаев была выявлена устойчивость к рифампицину. В то время как при тестировании 12 образцов у аналогичной группы из 11 больных ВИЧ/ТБ, она была обнаружена в 45,5% случаев. Исследование 77 образцов мокроты у 72 больных хроническим ТБ, выявило наличие резистентного ТБ у 80,6% больных без ВИЧ-инфекции и у 84,6% из 13 больных на поздних стадиях ВИЧ-инфекции.
Метод секвенирования позволяет не только подтвердить наличие резистентности, но и определяет все возможные виды мутационных изменений в rpoB-гене. Кроме того, он позволяет выявить одновременное присутствие смеси штаммов МБТ в организме одного пациента. Среди всех проанализированных нами образцов в 99 были обнаружены мутации, при этом 8 образцов представляли собой смеси штаммов. Из 13 обнаруженных вариантов мутаций наиболее частой явилась 531 Leu, встретившаяся в нашей выборке в 69,4% случаев.
Время, требуемое для определения чувствительности МБТ методом секвенирования, составило 2— 4 дня, тогда как получение результатов с помощью культурального метода — 58,2+15,6 дней.
Таком образом, метод секвенирования позволяет в кратчайшие сроки получить более информативные, по сравнению с культуральным методом, данные о резистентности МБТ, необходимые для корректного лечения больных ТБ на фоне его распространения, в том числе у больных на поздних стадиях ВИЧ-инфекции.
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ПАТОГЕННОСТИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ В ОЦЕНКЕ ИХ ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ ПРИ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЯХ У ДЕТЕЙ
Е.В. Анганова12, Е.Д. Савилов12, А.В. Духанина1, Н.Н. Чемезова1, Л.А. Распопина3
1ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» СО РАМН, г. Иркутск; 2ГБОУДПО «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования», г. Иркутск; ЮГБУЗ «Иркутская областная инфекционная клиническая больница», г. Иркутск
Факт выделения условно-патогенных энтеро-бактерий (УПЭ) при острых кишечных инфекциях (ОКИ), как и их количественная оценка не всегда
определяют способность изолята вызывать заболевание (Бондаренко В.М., 2011). Для выявления этиологической значимости энтеробактерий при ОКИ необходимо заключение об их патогенном потенциале на молекулярно-генетическом уровне.
Клинические штаммы УПЭ (представители родов Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Kluyvera, Morganella, Pantoea, Serratia и Providencia), выделенные от детей с ОКИ, находящихся на лечении в Иркутской областной инфекционной клинической больнице, протестированы на наличие следующих генетических маркеров патогенности: sfaA, sfaG гены, ответственные за адгезию S типа, fimA ген — адгезия 1 типа, hlyA, hlyB — продукция гемолизинов, irp-2 — синтез железорегулируемо-го белка. Выявлена генотипическая гетерогенность энтеробактерий по оцениваемым признакам. Нуклеотидные последовательности генов, кодирующих указанные факторы патогенности, обнаружены у 23,4% штаммов. Наибольшая частота обнаружения была характерна для hlyA и hlyB генов (9,7% от всех протестированных штаммов и 60,9% от штаммов с наличием нуклеотидных последовательностей искомых генов). Среди генов, ассоциированных с адгезией, чаще обнаруживались маркеры sfaA и sfaG, а частота встречаемости генетических детерминант адгезинов 1 типа (fimA) оказалась значимо ниже (p < 0,05). Наибольшую долю среди штаммов с наличием генетических детерминант патогенности составили Klebsiella spp. и Citrobacter spp. (39,0 и 24,4% соответственно). Самый широкий набор маркеров патогенности отмечен у штаммов Klebsiella spp. (sfaA, sfaG, fimA, hlyB, hlyB, irp-2). Выявлена связь между наличием генетических детерминант патогенности у выделенных от больных детей штаммов энтеробак-терий и клиническими проявлениями вызываемых ими инфекций (продолжительность и уровень лихорадки, а также длительность диареи). Полученные данные свидетельствуют о целесообразности определения генетических маркеров патогенности условно-патогенных энтеробактерий для выявления их этиологической значимости.
РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСА ПЦР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВЫХ ШТАММОВ YERSINIA PESTIS И ESCHERICHIA COLI
Л.В. Анисимова, К.А. Никифоров, Г.Н. Одиноков, Г.А. Ерошенко, В.В. Кутырев
ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», г. Саратов
Штаммы, циркулирующие в природных очагах чумы, как правило, чувствительны к действию различных антибиотиков, однако, в 1995 г. на о. Мадагаскар от больного чумой был выделен штамм Yersinia pestis c множественной лекарственной устойчивостью к стрептомицину, хлорамфениколу, тетрациклину, канамицину, ампициллину, спекти-номицину, сульфониламидам. Изучение резистентного штамма Y. pestis показало, что гены устойчивости к антибиотикам расположены на конъюгативной плазмиде pIP1202, которая могла с высокой частотой передаваться другим штаммам возбудителя чумы. В течение трех последующих лет на этой же территории было изолировано еще несколько антибио-тикоустойчивых штаммов Y. pestis. В 2002—2005 гг. у штаммов салмонелл и у других энтеробактериаль-
