CC BY
148
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
УДК: 618.14-002-07:618.17-008.1-076 Код специальности ВАК: 14.01.01, 14.03.10
ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОМАРКЕРОВ В МЕНСТРУАЛЬНОЙ КРОВИ КАК ВОЗМОЖНОСТЬ НЕИНВАЗИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ПРОЦЕССА В ПОЛОСТИ МАТКИ
Т.М. Мотовилова1, Т.С. Качалина1, Г.О. Гречканев1, Л.В. Боровкова1, А.Н. Зиновьев1, О.А. Николаева1, И.В. Пономарева1-2, В.П. Замыслова1, Т.Н. Пучкова2, К.И. Стройкова1, Л.З. Горхелашвили1, Н.А. Козлова1,
1ФГБОУ ВО «Нижегородская государственная медицинская академия», 2ООО «Клиника современных технологий «Садко», г. Н. Новгород
Мотовилова Татьяна Михайловна - e-mail: tatyana.m.motovilova@gmail.com
В статье обсуждается проблема хронического эндометрита как одного из ведущих этиопатогенетических факторов нарушения женской фертильности. Рассматриваются современные подходы к диагностике данной патологии и акцентируется внимание на ее трудностях. Дана объективная оценка имеющихся в настоящее время возможностей качественной характеристики менструальных выделений. В качестве неинвазивного и информативного метода диагностики хронического эндометрита авторами предлагается детекция интерлейкина-6 в менструальной крови. Описывается способ измерения биомаркера в данном субстрате и результаты собственного исследования по определению диагностической ценности метода.
Ключевые слова: расстройства фертильности, хронический эндометрит, лабораторная диагностика, маркеры воспаления, менструальные выделения, цитокины.
The article discusses the problem of chronic endometritis as one of the leading etiopathogenetic factors of female fertility disorders. The modern approaches to the diagnosis of this disease are considered with focus on its difficulties. An objective assessment of the currently available opportunities qualitative characteristics of menstrual effluence is given. The detection of interleukin-6 in the menstrual blood as a noninvasive and informative method of diagnosis of chronic endometritis is suggested by the authors. The biomarkers measurement in the substrate and the results of its own study to determine the diagnostic value of the method are described.
Key words: fertility disorders, chronic endometritis, laboratory diagnostics, markers of inflammation, menstrual effluence, cytokines.
Введение
Расстройства женской фертильности нередко ассоциированы с «маточным фактором», в связи с чем патология эндометрия, прежде всего инфекционно-воспалительной природы, играет определяющую роль в генезе репродуктивных потерь [1-5]. Персистирующие микробные факторы и ассоциированные с ними медиаторные влияния являются причиной нарушений морфофункционального состояния эндометрия, процессов имплантации и плацен-тации. Следствием подобных проблем становится невынашивание, бесплодие, неудачные попытки вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), осложнения геста-ции [2, 3, 6-10]. Ведущая роль в патогенезе хронического эндометрита (ХЭ) принадлежит разбалансировке иммунной системы, в большей степени на локальном уровне, оценка функции которой необходима для коррекции имеющихся расстройств [10]. На данный момент это является для клиницистов (акушеров-гинекологов, репродуктоло-гов) довольно трудной задачей [1, 2, 4, 5, 8, 9, 11, 12]. Проблемы диагностики влекут за собой несвоевременное, неполное обследование и отсроченное лечение.
«Золотым стандартом» диагностики ХЭ до настоящего времени остаются гистероскопия и морфология эндометрия [2, 4, 11, 13]. Однако очевидно, что качественное лечение, прогноз восстановления функции эндометрия и фертильности у данной группы больных зависят не только от
информативности обследования, но и от возможности осуществить диагностические процедуры максимально неинвазивно, что приобретает особую актуальность при гипо-и дистрофическом варианте эндометрита [1, 8, 12, 14]. В связи с этим требуется продолжение разработки и внедрения методов и алгоритмов, позволяющих улучшить диагностику состояния эндометрия и сделать ее более безопасной. Важно не только первично диагностировать воспаление в полости матки, но также провести динамический анализ эффективности лечебных мероприятий в последующем.
Одним из перспективных способов оценки выраженности воспалительных изменений в эндометрии представляется характеристика менструальных выделений, так как они являются непосредственным отделяемым-субстратом из предполагаемого очага патологического процесса.
С этой целью ранее отечественными исследователями впервые были предприняты попытки определения в менструальной крови содержания белкового маркера воспаления растворимого антигена лейкоцитов (РАЛ) [6]. РАЛ-2 является гликопротеином и выполняет свою функцию в очагах деструкции и воспаления, где концентрируются лизо-сомальные протеолитические энзимы из лейкоцитов. Было установлено, что при эндометрите концентрация РАЛ-2 резко повышается. Идентификацию и измерение содержания белка осуществляли методом модифицированной
▲1
SSM
двойной иммунодиффузии в агаре с использованием стандартных тест-систем. Иммунопроявление длилось до 24 ч. Диагностическая точность метода составила 76,9%, однако стоит признать, что, несмотря на его прогрессивность и оригинальность, данный способ является полуколичественным, он громоздок, требует создания специальных условий, существенных материальных и временных затрат. Кроме того, в описании метода имеются указания на возможность самостоятельного сбора менструальной крови пациентками, что может исказить результаты исследования ввиду смешивания образцов крови с вагинальным содержимым и/или мочой, а также из-за нарушения условий хранения.
Позднее в работах ряда зарубежных авторов было показано, что определение бактериального эндотоксина в менструальных выделениях также может стать маркером воспалительного процесса в полости матки [11]. Эндотоксин представляет собой липополисахаридный комплекс, связанный с внешней мембраной грамотрицательных патогенов. Для обнаружения и определения концентрации эндотоксина был использован LAL-test и «метод конечных точек». Результаты сопоставлялись с данными гистероскопии и морфологии биоптата эндометрия и, по мнению исследователей, имели высокую диагностическую точность. Однако известно, что потенциальными возбудителями эндометрита являются не только грамотрицательные бактерии, но и грамположительная флора, вирусы, грибы, простейшие, а чаще их ассоциации [2, 5, 9, 10, 13, 15, 16]. В связи с этим представляется сомнительным объективность оценки состояния эндометрия на основании эндотоксина. Кроме того, в описании метода имеются указания на возможность заморозки образцов менструальной крови, что не исключает снижения достоверности измерений.
Таким образом, ранее предложенные способы не лишены недостатков и требуют уточнения объективной необходимости определения и показательности того или иного параметра, а также описания оптимального способа забора и хранения образцов менструальной крови, методики определения уровней биомаркеров в соответствии с рекомендациями производителей тест-систем, а также их валидизации для данного субстрата и предусмотрения возможности случайной ошибки измерения [17].
На наш взгляд, существует ряд лабораторных величин, которые ввиду их биологической роли и простоты определения наиболее целесообразно тестировать в образце менструальных выделений больных. К их числу стоит отнести цитокины, в частности, интерлейкин-6.
Интерлейкин-6 (ИЛ-6) - один из гормоноподобных белков межклеточного взаимодействия (цитокинов). Он продуцируется активированными иммунокомпетентными клетками после воздействия различных микробных возбудителей, митогенов, медиаторов воспаления [18]. ИЛ-6 является одним из наиболее активных цитокинов, участвующих в реализации воспалительной реакции и иммунного ответа. Высокие локальные уровни ИЛ-6, известного как фактор дифференцировки В-лимфоцитов, в значительной степени можно объяснить наличием плазматических клеток, являющихся морфологическим признаком хронического воспаления в ткани эндометрия. Ранее было показа-
но, что уровни ИЛ-6 в аспирате из полости матки у больных острым эндометритом выше в 3,3 раза, чем в сыворотке крови системного кровотока [10]. Закономерно ожидать, что определение уровня ИЛ-6 в менструальных выделениях поможет оценить выраженность и динамику воспалительного процесса. Тест-системы валидизированы производителями с возможностью определения в различных биологических средах. Во избежание механистичного восприятия биологической роли цитокинов и, соответственно, для формирования адекватного суждения об их нормальном содержании в менструальной крови не стоит забывать, что по современным представлениям начальный период после оплодотворения характеризуется временной локальной воспалительной реакцией [19].
Целью настоящего исследования стала оценка диагностической ценности определения концентрации ИЛ-6 в менструальных выделениях в качестве скринингового неинвазивного метода при воспалении эндометрия.
Материал и методы
Была обследована 61 пациентка с репродуктивными неудачами в анамнезе (выкидыши, неразвивающиеся беременности, бесплодие, неудачные попытки ЭКО и ПЭ). Средний возраст больных составил 34±2,5 года. Критерии исключения: эхографические и гистероскопические признаки гиперпластических процессов эндо- и миометрия, наличие системных заболеваний, а также применение антимикробных препаратов в течение последних трех месяцев.
Пациентки прошли стандартное обследование, включающее в том числе забор менструальной крови по специальной методике для определения ИЛ-6 в начале обследования и по прошествии трех месяцев после лечения (при подтверждении диагноза хронического эндометрита), гистероскопию с пайпель-биопсией и гистологическим исследованием эндометрия (на 7-11 д.м.ц.).
Менструальную кровь для исследования забирали в самый обильный день менструации. Пациентка размещалась на гинекологическом кресле, вводилось вагинальное зеркало по общепринятой методике, исключая контакт внутренней его поверхности с вагинальным отделяемым. Кровь изливалась самопроизвольно, скапливаясь в ложке зеркала, затем ее аккуратно сливали или аспирировали с помощью пипетки, помещали в пластиковую пробирку Эппендорфа и доставляли в ИФА-лабораторию.
После стойкой ретракции сгустка пробирку центрифугировали при 10000-6000 об./мин в течение 15 мин (MINISKRIN PLUS EPPENDORF). Если образца было недостаточно для постановки диагноза (например, в случае скудных менструальных выделений), его предварительно разводили 0,9% физиологическим раствором хлорида натрия, а затем при расчете результата учитывали дополнительное разведение. Для тестирования на ИЛ-6 использовался твердофазный хемилюминесцентный иммуноферментный метод «сэндвич» с моноклональными мышиными антителами к интерлейкину-6 на приборе IMMULITE 1000.
Для определения нормативных значений была исследована менструальная кровь 30 здоровых молодых женщин-добровольцев, у которых не было указаний на инвазивные внутриматочные вмешательства, аборты, а также
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
инфекционно-воспалительные заболевания гениталий, опухолевые и системные хронические патологические процессы. Референтные значения концентрации ИЛ-6 составили 177-30 00 пг/мл. Для обработки результатов использовались общепринятые в медицинской статистике формулы и программа LibreOffice Са1с.
Результаты и их обсуждение
В среднем исходная концентрация ИЛ-6 в менструальных выделениях у пациенток с хроническим эндометритом находилась на уровне 25075,2±12916,8 пг/мл. По прошествии 2,5-3 месяцев после соответствующего противовоспалительного лечения при повторном исследовании части пациенток отмечено уменьшение показателя ИЛ-6 в менструальных выделениях в среднем до 9185,4±6723,8 пг/мл (р<0,5), что было ожидаемым. Судя по всему, существенный разброс значений данного параметра связан с особенностями течения заболевания: длительностью, патогенетическим вариантом, степенью активности патологического процесса и т. п. (рис.).
После лечения у 30% пациентов концентрация данного показателя пришла к норме, у остальных произошло его существенное снижение. Вероятно, что даже при адекватно проведённой противовоспалительной терапии данный показатель, как высокочувствительный, проявляет некоторую инертность и приходит к норме гораздо позднее клинического выздоровления и улучшения других параметров.
Согласно статистическим расчетам чувствительность метода составила 80,4%, специфичность - 60%. В целом диагностическая точность (эффективность) метода составила 78,7%, что выше, чем у предложенного ранее прототипа [6].
В целом результаты исследования продемонстрировали высокую диагностическую ценность предложенного теста при наличии воспалительного процесса в полости матки, что было подтверждено стандартными гистероскопическими и морфологическими критериями после забора биоптата эндометрия.
Мы ожидаем, что добиться повышения специфичности метода в дальнейшем позволит комплексная оценка сово-
купности других параметров наряду с ИЛ-6, отображающих различные патогенетические аспекты заболевания.
Заключение
Полученные нами данные - пока лишь наброски в многообразной картине процессов, происходящих в ткани эндометрия и играющих роль в расстройстве репродуктивной функции. Тем не менее уже сейчас мы полагаем, что измерение концентрации ИЛ-6 в менструальных выделениях потенциально пригодно для первичной неинвазив-ной диагностики (скрининга) хронического эндометрита, а также для динамической оценки эффективности его лечения. Ожидаемая степень клинической значимости и надежности таких измерений, по нашим предварительным данным, достаточно велика, однако необходимы дальнейшие исследования в этом направлении перед тем, как рекомендовать его к широкому внедрению.
ЛИТЕРАТУРА
1. Волкова Е.Ю. Прегравидарная подготовка женщин с нарушением репродуктивной функции и «тонким» эндометрием: Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. М. 2014. 22 с.
Volkova E.Y. Pregravidarnaya podgotovka zhenshhin s narusheniem reproduktivnoy funkcii i «tonkim» endometriem: Avtoref. diss. ... kand. med. nauk. M. 2014. 22 s.
2. Петров Ю.А. Хронический эндометрит в репродуктивном возрасте: этиология, патогенез, диагностика, лечение и профилактика: дисс. ... докт. мед. наук. М. 2012. 289 с.
Petrov Y.A Hronicheskiy endometrit v reproduktivnom vozraste: etiologiya, patogenez, diagnostika, lechenie i profilaktika: diss. dokt. ... med.nauk. M. 2012. 289 s.
3. Cicinelli E., Matteo M., Tinelli R., Lepera A., Alfonso R., Indraccolo U., Marrocchella S., Greco P., Resta L.. Prevalence of chronic endometritis in repeated unexplained implantation failure and the IVF success rate after antibiotic therapy. Hum Reprod. 2015. Feb. № 30 (2). Р. 323-330.
4. Внутриматочная патология: клиника, гистероскопическая диагностика и лечение: учебно-метод.пособие / под ред. проф. Е.Б. Рудаковой. М.: МЕДпресс-информ, 2011. 80 с.
Vnutrimatochnaya patologiya: klinika, gisteroskopicheskaya diagnostika i lechenie: uchebno-metod.posobie / pod red. prof. E.B. Rudakovoy. M.: MEDpress-inform, 2011. 80 s.
5. Тапильская Н.И., Карпеев С.А., Кузнецова И.В. Хронический эндометрит — субклиническое воспалительное заболевание органов малого таза. Гинекология. 2014. № 1. С. 104-109.
Tapil'skaya N.I., Karpeev S.A., Kuznetsova I.V. Hronicheskiy endometrit — subklinicheskoe vospalitel'noe zabolevanie organov malogo taza. Ginekologiya. 2014. № 1. S. 104-109.
6. Посисеева Л.В., Бойко Е.Л., Борзова Н.Ю., Малышкина А.И., Шехлова Н.В. Патент № 2108750 от 20.04.1998 «Способ диагностики хронического эндометрита».
Posiseeva L.V., Boyko E.L., Borzova N.Y., Malyshkina A.I., Shekhlova N.V. Patent № 2108750 ot 20.04.1998 «Sposob diagnostiki hronicheskogo endometrita».
7. Di Pietro C., Cicinelli E., Guglielmino M.R. et al. Altered transcriptional regulation of cytokines, growth factors, and apoptotic proteins in the endometrium of infertile women with chronic endometritis. Am J Reprod Immunol. 2013. № 69 (5). Р. 509-517.
8. Kasius A., Smit J.G., Torrance H.L. et al. Endometrial thickness and pregnancy rates after IVF: a systematic review and meta-analysis. Hum Reprod Update. 2014. Vol. 20. № 4. P. 530-541.
9. Yoshii N., Hamatani T., Inagaki N., Hosaka T., Inoue O., Yamada M., Machiya R., Yoshimura Y., Odawara Y. Successful implantation after reducing matrix metalloproteinase activity in the uterine cavity. Reprod Biol Endocrinol. 2013. May. № 11. Р. 37.
) so OOO.O ISO OOO.O iao схим; 120 OOO.O 100 000,0 SO ООО, о 60 000,0 4 О OOO.O 2 О ООО,О 0,0
j-» значения ИЛ-6 до лечения
—■—значения ИЛ-6 после
f 1
1
Г 1
1 А N
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 пациентки с хроническим эндометритом
РИС.
Динамика уровней ИЛ-6 в менструальной крови, n=30.
▲1
SSM
10. Каграманова Ж.А. Разработка и обоснование комплексной клинико-иммунологической диагностики и иммунотерапии воспалительных заболеваний матки и ее придатков: автореф. дис. ... канд. мед. наук. М. 2014. 313 с.
Kagramanova Z.H. Razrabotka i obosnovanie kompleksnoy kliniko-immunologicheskoy diagnostiki i immunoterapii vospalitelnyh zabolevaniy matki i ee pridatkov: avtoref. diss.... kand. med. nauk. M. 2014.313 s.
11. Viana G.A., Cela V., Ruggiero M., Pluchino N., Genazzani A.R., Tantini C. Endometritis in infertile couples: the role of hysteroscopy and bacterial endotoxin. JBRA Assisted Reproduction. 2015. № 19 (1). Р. 21-23.
12. Gleicher N., Kim A., Michaeli T., Lee H.J., Shohat-Tal A., Lazzaroni E., Barad D.H. A pilot cohort study of granulocyte colony-stimulating factor in the treatment of unresponsive thin endometrium resistant to standard therapies. Hum Reprod. 2013. Jan. № 28 (1). Р. 172-177.
13. Cicinelli E., De Ziegler D., Nicoletti R., Colafiglio G., Saliani N., Resta L., Rizzi D., De Vito D. Chronic endometritis: correlation among hysteroscopic, histologic, and bacteriologic findings in a prospective trial with 2190 consecutive office hysteroscopies. Fertil Steril. 2008. № 89. Р. 677-684.
14. Takasaki A., Tamura H., Miwa I., Taketani T., Shimamura K., Sugino N. Endometrial growth and uterine blood flow: a pilot study for improving endometrial thickness in the patients with a thin endometrium. Fertil Steril. 2010. Apr. № 93 (6). Р. 1851-1858.
15. Гомболевская Н.А., Марченко Л.А. Современные критерии диагностики хронического эндометрита (обзор литературы). Проблемы репродукции. 2012. Т. 18. № 1. С. 42-46.
Gombolevskaya N.A., Marchenko L.A. Sovremennye kriterii diagnostiki hronicheskogo endometrita (obzor literatury). Problemy reproduktcii. 2012. T. 18. № 1. S. 42-46.
16. Мотовилова Т.М., Замыслова В.П., Боровкова Л.В., Качалина Т.С. и др. Ведущие инфекционные факторы хронического воспалительного процесса в эндометрии у пациенток нижегородской области. «Актуальные вопросы акушерства, гинекологии, неонатологии и педиатрии» // Сборник научных трудов, посвященный 35-летию со дня основания института / под ред. А.И. Малышкиной, С.Б. Назарова. Иваново: Изд-во «МИК», 2015. С. 96-101.
Motovilova T.M., Zamyslova V.P., Borovkova L.V., Kachalina T.S. i dr. Vedushie infekcionnye faktory hronicheskogo vospalitel'nogo processa v endometrii u patsientok nizhegorodskoy oblasti. «Aktual'nye voprosy akusherstva, ginekologii, neonatologii i pediatrii» // Sbornik nauchnyh trudov, posvyashhennyy 35-letiyu so dnya osnovaniya institute / pod red. A.I. Malyshkinoy, S.B. Nazarova. Ivanovo: Izd-vo «MIK», 2015. S. 96-101.
17. Van den Bruel A., Aertgeerts B., and Buntinx F. Results of diagnostic accuracy studies are not always validated. J Clin Epidemiol. 2006. № 59. Р. 559-566.
18. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. Изд-во Фолиант, 2008. 552 с.
Ketlinskiy S.A., SimbirtsevA.S. Citokiny. Izd-vo Foliant, 2008. 552 s.
19. Скуинь Л.М. Иммунологические взаимоотношения в системе «мать-плацента-плод». Новости прикладной иммунологии и аллергологии. 2003. № 7. С. 1-4.
Skuin L.M. Immunologicheskie vzaimootnosheniya vsisteme «mat'-placenta-plod». Novosti prikladnoy immunologii i allergologii. 2003. № 7. S. 1-4. ^^
ш
УДК: 579.61:616.9.001.6 Код специальности ВАК: 14.01.01, 03.02.03
АНТАГОНИСТИЧЕСКИЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ЭНТЕРОКОККОВ С КАНДИДАМИ НА УРОВНЕ ВАГИНАЛЬНОГО БИОТОПА И В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO
Н.А. Александрова1-2, М.И. Заславская1, М.В. Вахромова2,
1ФГБОУ ВО «Нижегородская государственная медицинская академия», 2ООО «Клиника современных технологий "Садко"», г. Н. Новгород
Александрова Наталья Александровна - e-mail: Nataiyuskova@rambier.ru
Изучено взаимодействие энтерококков и кандид на уровне вагинального биотопа у женщин репродуктивного возраста. Обнаружена обратная корреляционная зависимость между количеством энтерококков и кандид в вагинальном секрете у женщин. Исследованы механизмы влияния метаболитов энтерококков на кандиды в экспериментах in vitro. Установлено, что продукты метаболизма энтерококков оказывают слабый фунгицидный эффект в отношении Candida spp. Кроме того, метаболиты энтерококков подавляют адгезию кандид на эпителиальных клетках in vitro.
Ключевые слова: кандиды, энтерококки, вагинальная микрофлора,
адгезия на эпителиоцитах.
It was studied the interaction between enterococci and Candida in the vaginal biotope of women in reproductive age. It was detected a negative correlation between enterococci and candida quantity in the woman vaginal secretion. It was investigated the mechanisms of enterococci metabolites effect on Candida during experiments in vitro. It was founded that metabolites of enterococci have a small fungicidal effect on Candida spp. Furthermore the enterococcal metabolites inhibit the candida adhesion to epithelial cells in vitro.
Key words: сandida, enterococci, vaginal microflora, adhesion to epithelial cells.
