CC BY
205
Й О
к
V
к а и о
н о и и п К
К
80 70 60 50 40 30 20 10 0
0
0,1
0,4
0,5
0,2 0,3
[анилин], мг/мл
Рисунок 2. Зависимость величины индекса токсичности от концентрации анилина за 30 минут измерения.
В нашем исследовании мы попытались сопоставить индексы токсичности при разных концентрациях анилина, которые получены стандартным биолюминесцентным методом с данными, экспресс анализа, где при расчете, опытный образец в нулевое время. выступал в качестве контроля, и, следовательно, это позволило произвести коррекцию цвета с минимальным отклонением. При таком расчете индекс токсичности анилина при концентрации 0,17 мг/л имел значение 2,5, а при концентрации 0,34 мг/л был 24 соответственно, что в два раза меньше по токсичности, по сравнению со стандартным методом расчета индекса токсичности, где в качестве контроля выступали клетки биосенсора в воде.
Кинетика токсического действия раствора анилина, как и некоторых химических веществ быстра. При внесении реагента эффект проявляется мгновенно, свечение бактерий значительно снижается уже в первые секунды. И этот эффект, хорошо виден с органическими токсикантами, имеющими небольшой молекулярный вес.
Следовательно, сопоставление двух подходов в расчете индекса токсичности анилина позволило учитывать такие факторы, как быстрая кинетика и цвет исследуемого вещества, что сильно может влиять на достоверные
результаты по токсичности.
Список литературы
1. Данилов В. С., Зарубина А. П., Ерошников Г. Е., Соловьева Л. Н., Карташев Ф.В, Завильгельский Г.Б. (2002) Сенсорные биолюминесцентные системы на основе lux-оперонов разных видов люминесцентных бактерий. Вестн. Моск. университета, сер. биология, 3, с. 20-24.
2. Ревазова Ю. А. (2007) Методика определения токсичности химических веществ, полимеров, матера-лов и изделий с помощью биотеста «Эколюм» / Ю. М.: Методические рекомендации. -17 с.
3. Dutka BJ, Kwan KK., Rao SS, Jurkovic A, McInnis R. Use of bioassays to evaluateriver water and sediment quality. Environm Toxicol and Water Qual Intern J 1; (6):309-32
4. Lappalainen, J., Juvonen, R., Vaajasaari, K., Karp, M. A new flash method for measuring the toxicity of solid and colored samples. //Chemosphere. 1999. V.38. N5. р. 1069-1083.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНОИ АКТИВНОСТИ ПЛАЗМЫ КРОВИ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ И КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
Бабенкова Ирина Владимировна
кандидат медицинских наук, Российский национальный исследовательский медицинский университет
им. Н.И. Пирогова Минздрава России, г. Москва Буравлев Евгений Александрович
кандидат биологических наук, Российский национальный исследовательский медицинский университет
им. Н.И. Пирогова Минздрава России, г. Москва Буравлева Кристина Владимировна младший научный сотрудник, НИИ Физико-химической медицины ФМБА России, г. Москва
Теселкин Юрий Олегович
доктор биологических наук, Российский национальный исследовательский медицинский университет
им. Н.И. Пирогова Минздрава России, г. Москва
АННОТАЦИЯ
В работе дается экспериментальное и клиническое обоснование определения антиоксидантной активности плазмы крови для оценки функционального состояния антиоксидантной системы организма человека в условиях развития оксидативного стресса и эффективности антиоксидантной терапии.
ABSTRACT
The article deals with experimental and clinical substantiation of determination of blood plasma antioxidant activity for estimation status of antioxidant system of organism under the development of oxidant stress andfor the efficiency of antioxidants therapy.
Ключевые слова: оксидативный стресс, антиоксиданты, плазма крови, антиоксидантная активность, хемилю-минесценция
Keywords: oxidative stress, antioxidants, blood plasma, antioxidant activity, chemiluminescence
Известно, что оксидативный стресс или неконтролируемое усиление продукции активных формы кислорода (АФК) и свободных радикалов является важным патогенетическим фактором развития многих заболеваний человека: сердечно-сосудистых, бронхолегочных, онкологических, ревматических, нейродегенеративных и т.д. [7]. В результате активации свободнорадикальных процессов происходит окислительная модификация различных биомолекул (липидов, белков, нуклеиновых кислот и др.), что, в конечном итоге, приводит к повреждению и гибели клеток отдельных тканей и органов [2].
В норме регуляция продукции АФК и свободных радикалов в тканях и органах человека осуществляется многоуровневой антиоксидантной системой [4]. Однако, несмотря на высокую эффективность антиоксидантной системы, она не всегда способна защитить организм человека от развития оксидативного стресса. В связи с этим большое внимание уделяется разработке новых способов изучения антиоксидантного потенциала организма человека для оценки его функциональных возможностей.
В настоящее время для оценки функционального состояния антиоксидантной системы человека наряду с определением содержания отдельных антиоксидантов в плазме и клетках крови используют показатель, обозначаемый как антиоксидантная активность (АОА) плазмы крови. АОА плазмы (сыворотки) крови - это интегральный показатель, отражающий ее способность противодействовать развитию свободнорадикальных реакций в какой-либо модельно системе [3]. Основными компонентами таких модельных систем являются система генерации радикалов и субстрат (или молекула-мишень), который подвергается свободнорадикальному окислению. Инициирование образования радикалов в модельных системах может осуществляться различными способами, например, с помощью ионов металлов переменной валентности, УФ-облучения, азосоединений, ферментов, смеси метмиоглобина с Н2О2. В качестве субстрата окисления могут выступать гомогенаты тканей и органов, суспензии модельных и биологических мембран, эмульсии ненасыщенных жирных кислот, красители [3, 11]. Добавление в модельную систему плазмы крови, содержащей различные водо- и жирорастворимые антиоксиданты, приводит к уменьшению образования радикалов и торможению окисления субстрата, которое регистрируется с помощью различных методов: хемилюминесценции (ХЛ), спектрофотометрии, флуориметрии, полярографии и т.д. [3, 4, 11]. Для количественной оценки величины АОА плазмы крови ее выражают через концентрацию стандартного антиоксиданта. В качестве стандартного антиокси-данта часто используется тролокс (6-гидрокси-2,5,7,8-тет-раметилхроман-2-карбоновая кислота) - водорастворимый структурный аналог витамина Е или какой-либо другой антиоксидант [9].
Существует много способов определения АОА плазмы крови. Один из распространенных подходов для определения АОА плазмы крови основан на генерации водорастворимых пероксильных радикалов ^02^). В качестве источника R02• обычно применяют водорастворимые азосоединения, например, 2,2'-азобис (2-
амидинопропан) дигидрохлорид (АБАП). При добавлении АБАП в водную среду он подвергается термическому распаду с постоянной скоростью реакции. Возникающие в результате этого процесса радикалы взаимодействуют с кислородом, с образованием R02•. Последние индуцируют окисление люминола, которое сопровождается ХЛ. В присутствии плазмы крови наблюдается ингибирование ХЛ люминола и появление латентного периода, длительность которого прямо пропорциональна АОА или радикалпере-хватывающей активности образца [9].
Используя описанный подход, J.T. ШШа и соавт. [14] установили, что процентный вклад отдельных анти-оксидантов в измеряемую величину АОА плазмы крови для здоровых людей составляет: урата - 43+5%, аскорбата - 1+1%, витамина Е - 3+1%, 8И-групп белков - 19+6%, неидентифицированных антиоксидантов - 34+4%. Авторы работы обнаружили, что развитие преэклампсии у беременных женщин сопровождается значительным увеличением АОА их плазмы крови, которое обусловлено повышением содержания в ней мочевой кислоты и неидентифицированных антиоксидантов. ЕХ Jareno и соавт. [8] выявили уменьшение АОА сыворотки крови у детей с синдромом приобретенного иммунодефицита по сравнению со здоровыми детьми. Понижение АОА сыворотки крови коррелировало с повышением содержания в ней уровня продуктов пероксидного окисления липидов. Уменьшение АОА плазмы крови также обнаружено у добровольцев после продолжительного вдыхания сигаретного дыма [15].
Другая известная система для определения АОА плазмы крови включает метмиоглобин, Н2О2 и 2,2'-ази-нобис(3-этилбензтиазолин-6-сульфокислоту) (АБТС) в виде диаммонийной соли [11]. Взаимодействие метмио-глобина с Н2О2 приводит к образованию радикалов фер-рилмиоглобина. В результате реакции радикалов феррил-миоглобина с АБТС они восстанавливаются до метмиоглобина, а АБТС окисляется с образованием катион-радикала АБТС (АБТС^+), имеющего максимумы поглощения в длинноволновой области спектра при 660, 734 и 820 нм. Введение в систему плазмы крови сопровождается уменьшением образования (поглощения) катион-радикалов и появлением латентного периода в процессе окисления АБТС. Установлено, что вклад отдельных антиокси-дантов плазмы крови в ее общую АОА, определяемую с помощью данной модельной системы, составляет: альбумина - 43%, урата - 33%, аскорбата - 9%, а-токоферола -3%, билирубина - 2% и остальных антиоксидантов - 10%. Обнаружено понижение АОА плазмы крови у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) и курильщиков [10], что связывают с уменьшением содержания в ней отдельных ингибиторов - аскорбиновой кислоты, витамина Е, р-каротина и др. Описаны модификации этого метода, в которых для получения АБТС^+ вместо метмиоглобина и Н2О2 используется персульфат калия.
Несмотря на большую популярность способов определения радикалперехватывающей активности плазмы крови с использованием АБАП и АБТС, указанные
подходы, по-видимому, не являются в полной мере адекватными, поскольку взаимодействие с RO2^ и АБТС^+ не отражает способность антиоксидантов плазмы крови защищать субстрат окисления от физиологически важных активных форм кислорода и азота, липидных радикалов и т.д., которые являются одними из инициаторов свободно-радикальных реакций in vivo.
Нами для определения АОА плазмы крови предложена хемилюминесцентная модельная система, основными компонентами которой являются гемоглобин (Hb), пероксид водорода и люминол (система Hb-H2O2-люми-нол) [5]. Взаимодействие гемоглобина и Н2О2 в этой си-
стеме приводит к частичному разрушению гема и образованию радикалов-инициаторов. Основными радикалами-инициаторами окисления люминола в указанной модельной системе являются радикалы феррилгемоглобина и гидроксильные радикалы. Величину АОА плазмы крови выражают через концентрацию антиоксиданта сравнения, в качестве которого используется аскорбиновая кислота.
С помощью модельной системы Hb-H2O2-люми-нол зарегистрировано изменение АОА плазмы крови при ряде заболеваний, сопровождающихся усилением свобод-норадикальных реакций. Так, например, понижение АОА плазмы крови наблюдалось при ХОБЛ в стадии обострения и ремиссии (рис. 1).
Рисунок 1. АОА плазмы крови у больных ХОБЛ. * - p <0,001; ** - р <0,05 по отношению к группе здоровых доноров.
Важным направлением современной медицины является использование антиоксидантов для коррекции ан-тиоксидантного статуса организма. При этом особое значение приобретает исследование динамики АОА плазмы крови, которая в некоторых случаях позволяет судить, насколько быстро антиоксидант поступает в кровоток и насколько долго сохраняется антиоксидантный эффект. С помощью системы Hb-H2O2-люминол была исследована динамика АОА плазмы крови при введении в организм человека некоторых антиоксидантов [1, 5]. В частности, обнаружено, что после перорального приема добровольцами 2 г аскорбиновой кислоты максимальное увеличение АОА плазмы крови наблюдалось через 1 ч и составило 77%. Кроме того, было изучено влияние на АОА плазмы крови добровольцев однократного и длительного приема анти-оксидантной пищевой добавки «Магнум С» (ЗАО «Вита-макс-ХХ1 Век», Россия), которая в качестве основных ан-тиоксидантных компонентов содержит витамин С в этерифицированной форме и смесь биофлавоноидов. Установлено, что в случае длительного приема этого препарата (по 1 капсуле два раза в день в течение 30 дней) максимальное увеличение АОА плазмы крови наблюдалось на 14-е сутки. После прекращения приема препарата происходило постепенное снижение этого показателя до исходного уровня. Таким образом, изучение динамики АОА плазмы крови может оказаться полезным при выборе доз и определении оптимальных сроков для профилактического или лечебного применения антиоксидантов и биологически активных добавок к пище с антиоксидантными свойствами.
Наибольший практический интерес представляет применение антиоксидантов при различных патологических процессах, сопровождающихся развитием оксида-тивного стресса. В частности, при доклинических испытаниях биофлавоноидного препарата «Диквертин» (НПО «Вилар», Россия) с использованием экспериментальных моделей свободнорадикальной патологии - внешнего общего у-облучения мышей и тетрахлорметанового гепатита крыс - было обнаружено следующее. Развитие оксидатив-ного стресса сопровождалось не только повышением содержания продуктов липидной пероксидации в плазме крови и печени животных, но и понижением АОА плазмы крови. Введение дигидрокверцетина приводило к уменьшению уровня этих продуктов и повышению АОА плазмы крови [12, 13]. Клиническая апробация диквертина как ан-тиоксидантного средства проводилась при лечении больных острой пневмонией [6]. Были выделены три группы больных острой пневмонией: 1-я - контрольная, получавшая стандартную терапию; 2-я - группа сравнения, получавшая стандартную терапию и антиоксидантный комплекс (АОК) - а-токоферола ацетат и тиосульфат натрия в течение двух недель; и 3-я - опытная, которая на фоне основной терапии получала диквертин. Обнаружено, что в острый период заболевания (1-3-е сутки) содержание продуктов ПОЛ в плазме крови у больных всех трех групп было более высоким, чем у здоровых людей. Включение в комплексную терапию больных 2-й и 3-й групп антиокси-дантов приводило к снижению содержания продуктов ли-пидной пероксидации до уровня нормы уже в подострый период заболевания (10-14-е сутки), в то время как у больных 1 -й группы оно оставалось выше нормы. На рис. 2 приведены результаты изучения АОА плазмы крови.
норма 1-3 сутки 10-14 сутки 20-25 сутки
□ 1 группа 02 группа ИЗ группа
Рисунок 2. АОА плазмы крови у больных острой пневмонией. * - р <0,05 по отношению к норме; ** - р <0,05 по отношению к больным 1-й группы в соответствующем периоде заболевания.
Несмотря на проводимое лечение, у больных 1-й группы, не получавших антиоксиданты, АОА плазмы крови была снижена в подострый период заболевания и в фазу клинического выздоровления (20-25-е сутки). У больных, получавших антиоксиданты, АОА плазмы крови была в пределах нормы в течение всего периода наблюдения, что свидетельствует об увеличении способности их организма противостоять оксидативному стрессу. Важно отметить, что у больных 2-й и 3-й групп, также наблюдалось более быстрое исчезновение клинических признаков легочного воспаления, чем у больных 1 -й группы.
Таким образом, представленные результаты показывают, что АОА плазмы крови является важным показателем для контроля за функциональным состоянием антиоксидантной системы и эффективностью антиок-сидантной терапии.
Список литературы
1. Бабенкова И.В. Влияние антиоксидантного препарата на основе биофлавоноидов и витамина С на ан-тиоксидантную активность плазмы крови / И.В. Бабенкова, Ю.О. Теселкин, А.В. Асейчев, Б.Х. Ягмуров // Вопр. питания. - 1999. - № 3. - С. 9-11.
2. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция / Ю.А. Владимиров, Е.В. Проскурнина // Успехи биол. хим. 2009. - Т.49. - С. 341-388.
3. Клебанов Г.И. Антиоксидантная активность сыворотки крови / Г.И. Клебанов, Ю.О. Теселкин, И.В. Бабенкова, О.Б. Любицкий, Ю.А. Владимиров // Вестн. РАМН. - 1999. - Т. 99, № 2. - С. 15-22.
4. Попов И.Н. Антиокислительный гомеостаз человека: методы изучения, критерии оценки (обзор литературы) / И.Н. Попов, Г. Левин, А.К. Аносов, А.А. Маркин, Б.В. Моруков // Вестник РГМУ. -2013. - № 2. - С. 69-74.
5. Теселкин Ю.О. Определение антиоксидантной активности плазмы крови с помощью системы гемо-глобин-пероксид водорода-люминол / Ю.О. Теселкин, И.В. Бабенкова, О.Б. Любицкий, Г.И. Клебанов, Ю.А. Владимиров // Вопр. мед. химии. -1998. - Т. 44, № 1. - С. 70-76.
6. Теселкин Ю.О. Использование нового антиоксидантного средства Диквертина при лечении больных острой пневмонией / Ю.О. Теселкин, И.В. Ба-бенкова, В.Г. Новоженов, В.К. Колхир, В.А. Быков,
Н.А. Тюкавкина, И.А. Руленко, Ю.А. Колесник // Вопр. биол., мед. и фарм. химии. - 1999. - № 1. - С. 36-40.
7. Менщикова Е.Б. Окислительный стресс: патологические состояния и заболевания / Е.Б. Менщикова,
H.К. Зенков, В.З. Ланкин, И.А. Бондарь, В.А. Тру-факин - Новосибирск: АРТА, 2008. - 284 с.
8. Jareno E.J. Serum malondialdehyde in HIV seropositive children / E.J. Jareno, F. Bosch-Morell, R. Fernandez-Delgado, J. Donat, F.J. Romero // Free Radic. Biol. Med. - 1998. - V. 24, № 3. - P. 503-506.
9. Magalhaes L.M. Methodological aspects about in vitro avaluation of antioxidant properties / L.M. Magalhaes, M.A. Segundo, S. Reis, J.L.F.C. Lima // Anal. Chim. Acta. - 2008. - V. 613, № 1. - P. 1-19.
10. Rahman I. Role of oxidants/antioxidants in smoking-induced lung diseases / I. Rahman, W. MacNee // Free Radic. Biol. Med. - 1996. - V. 21, № 5. - P. 669-681.
11. Rice-Evans C. Total antioxidant status in plasma and body fluids / C. Rice-Evans, N.J. Miller // Methods in enzymology. Oxygen radicals in biological systems / Ed. L. Packer. - San Diego, California: Academic Press, Inc., 1994. - V. 234, Part D. - P. 279-293.
12. Teselkin Yu.O. Influence of dihydroquercetin on the lipid peroxidation of mice during post-radiation period / Yu.O. Teselkin, I.V. Babenkova, N.A. Tjukavkina,
I.A. Rulenko, Yu.A. Kolesnik, V.K. Kolhir, A.A. Eichholz // Phytother. Res. - 1998. - V. 12. - P. 517-519.
13. Teselkin Yu.O. Dihydroquercetin as a means of antioxidative defence in rats with tetrachloromethane hepatitis / Yu.O. Teselkin, I.V. Babenkova, V.K. Kolhir, A.I. Baginskaya, N.A. Tjukavkina, Y.A. Kolesnik, I.A. Selivanova, A.A. Eichholz // Phytother. Res. - 2000. - V. 14, № 3. - P. 160-162.
14. Uotila J.T. The total peroxyl radical-trapping ability of plasma and cerebrospinal fluid in normal and preeclamptic parturients / J.T. Uotila, A.L. Kirkkola, M. Rorarius, R.J. Tuimala, T. Metsä-Ketelä // Free Radic. Biol. Med. - 1994. - V. 16, № 5. - P. 581-590.
15. Valkonen M.M. Vitamin C prevents the acute atherogenic effects of passive smoking / M.M. Valkonen, T. Kuusi // Free Radic. Biol. Med. - 2000. -V. 28, № 3. - Р. 428-436.
