CC BY
7
DOI: 10.24412/2074-5036-2023-3-11-14 УДК: 579.61
Ключевые слова: пробиотик, пробиотический препарат, дисбактериоз, микробиологическое исследование, Life 9, лактобактерии, бифидобактерии, бактерицидное действие, антагонистическая активность, условно-патогенные микроорганизмы, антимикробное действие
Key words: probiotic, probiotic drug, dysbiosis, microbiological examination, Life 9, lactobacilli, bifidobacteria, bactericidal action, antagonistic activity, conditionally pathogenic microorganisms, antimicrobial action
хЗакрепина Е.Н., Шоскова В.И., 2Муллагалиева О.А.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ ПИЩЕВОЙ ДОБАВКИ LIFE 9
DETERMINATION OF ANTAGONISTIC ACTIVITY OF MICROORGANISMS OF PROBIOTIC FOOD ADDITIVE "LIFE 9"
'ФГБОУ ВО Вологодская государственная молочно-хозяйственная академия им. Н. В. Верещагина Адрес: Россия, Вологодская область, г. Вологда, с. Молочное, ул. Шмидта, д. 2
Vologda State Dairy Academy named after N. V. Vereshchagin Address: Vologda region, Vologda, Molochnoye village, Schmidt str., 2, Russia 2АО «Племзавод Родина» Адрес: 160503, Вологодский район, п. Огарково, д. 37
JSC "PlemzavodRodina" Address: 160503, Vologda district, Ogarkovo settlement, 37
Закрепина Елена Николаевна, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры эпизоотологии и микробиологии, е-mail: [email protected]
Zakrepina Elena Nikolaevna, PhD of Veterinary Sciences, Associate Professor of the Department of Epizootology
and Microbiology, e-mail: [email protected] Носкова Вера Ивановна, кандидат технических наук, доцент кафедры микробиологии
и эпизоотологии, е-mail: [email protected] Noskova Vera Ivanovna, PhD of Technical Sciences, Associate Professor of the Department of Microbiology and Epizootology, е-mail: [email protected] Муллагалиева Оксана Андреевна, ветеринарный врач, е-mail: [email protected] Mullagalieva Oksana Andreevna, veterinarian, e-mail: [email protected]
Аннотация. Целью работы стало микробиологическое исследование антагонистической активности микроорганизмов пробиотического препарата Life 9 по отношению к культурам условно-патогенных микроорганизмов Staphylococcus aureus и Escherichia coli. В результате проведенного исследования обнаружен антагонизм бактерий, входящих в состав пробиотической пищевой добавки Life 9, по отношению к условно-патогенному грам-положительному микроорганизму St. aureus. Кроме того, установлено, что при совместном культивировании с пробиотическим микроорганизмом условно-патогенная грамотрицательная E. coli сохраняет свою биохимическую активность. Использование пробиотических препаратов показало их явное клинико-микробиологическое преимущество перед антибиотиками, усугубляющими дисбиотические явления кишечника. Summary. The aim of the work was a microbiological study of the antagonistic activity ofmicroorganisms of the probiotic preparation "Life 9" in relation to cultures of opportunistic microorganisms Staphylococcus aureus and Escherichia coli. As a result of the study, the antagonism of bacteria that are part of the probiotic food supplement "Life 9" in relation to the opportunistic gram-positive microorganism St. aureus. In addition, it was found that when co-cultivated with a probiotic microorganism, the opportunistic gram-negative E. coli retains its biochemical activity. The use of probiotic preparations showed their clear clinical and microbiological advantage over antibiotics, which exacerbate intestinal dysbiotic phenomena.
Введение
Применение пробиотических культур микроорганизмов обусловлено и подкрепляется постоянно растущим пониманием механизма действия этих веществ и разработкой молекулярных методов анализа и выявления сложных сообществ бактерий в кишечнике млекопитающих. Пробио-тики обладают антагонистической активностью,
иммуномодулирующим действием, улучшают барьерную функцию слизистой оболочки кишечника. Антагонизм осуществляется за счет бактерицидного или бактериостатического действия пробиотических бактерий. Они продуцируют сероводород, перекись водорода и различные кислоты, которые обуславливают снижение рН в просвете кишечника и выделяют антимикробные
вещества (бактериоцины) [1, 7, 10]. Основой для производства пробиотических препаратов и премиксов являются производственные штаммы микроорганизмов. Именно свойства используемых при производстве штаммов определяют эффективность пробиотиков [6].
Пробиотики, пребиотики и синбиотики занимают определенное место в базисной терапии заболеваний, применяются в профилактических целях. Их выделяют из различных источников человеческого, животного и микробного происхождения, получают с использованием живых биологических систем, тканей организмов и их производных, применяя средства биотехнологии [1, 8]. Препарат Life 9 является пробиотиком третьего поколения (симбиотиком), т. к. в его состав входит 17 миллиардов живых культур из девяти штаммов полезных бактерий (лактобактерий, бифидобактерий и других микроорганизмов): Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum. [9].
Объект исследования - пробиотическая добавка Life 9.
Предмет исследования - микроорганизмы (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum), заявленные на упаковке добавки, условно-патогенные микроорганизмы (Staphylococcus aureus, Escherichia coli) [8, 9].
Цель: микробиологическое исследование антагонистической активности микроорганизмов пробиотического препарата Life 9 по отношению к культурам условно-патогенных микроорганизмов Staphylococcus aureus и Escherichia coli.
Задачи:
1) Провести посев пробиотика на питательные среды и выделить чистую культуру микроорганизмов.
2) Провести совместное культивирование про-биотической культуры и условно-патогенных микроорганизмов (St. aureus, E. coli).
3) Оценить результаты исследования.
Материалы и методы
Экспериментальная часть работы проводилась на кафедре эпизоотологии и микробиологии Вологодской ГМХА. При исследовании использована пробиотическая добавка Life 9 американской компании Young Living (Рис. 1).
Для выделения чистой культуры пробиотиче-ских микроорганизмов приготовили пятикратные
разведения капсулы препарата стерильным физиологическим раствором. Для опыта взяли 2-е, 3-е, 4-е и 5-е разведения. Посевы проводили на простую и специальную питательную среды (МПА (на чашку Петри, штрихом на скошенный МПА), молоко стерильное обезжиренное); культивировали в термостате при 37 оС в течение 24-96 ч. В результате, на скошенном МПА смогли выделить чистую культуру молочнокислых микроорганизмов (Рис. 2). Для исследования антагонистической активности выращенной культуры пробиотиков был использован метод сплошного газона [3, 5]. Изучали рост чистой культуры пробиотика в присутствии тест-штаммов St. aureus и E. coli. Культуры, которые не были подавлены ростом тест-штаммами St. aureus и E. coli, считаются антагонистичными в отношении данного вида микроорганизма [2, 3].
Провели посев на МПА в двух чашках Петри:
- первую чашку Петри разделили на 2 части и посеяли с одной стороны St.aureus, с другой -смесь St. aureus и пробиотика;
- вторую чашку Петри разделили на части и посеяли с одной стороны E. coli, с другой - смесь E. coli и пробиотика.
Также для выявления антагонистической активности пробиотических культур на рост условно-патогенной микрофлоры засевали чистые культуры и различные варианты сочетаний условно-патогенных микроорганизмов с пробиотиче-ской культурой в стерильное обезжиренное молоко в следующих вариантах:
- в первую пробирку провели посев золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus);
- во вторую пробирку - кишечной палочки (Escherichia coli);
- в третью пробирку - смесь пробиотика и St. aureus;
- в четвертую - смесь пробиотика и E. coli;
- в пятую - чистую культуру пробиотиков [2,
4, 6].
После культивирования провели визуальную оценку состояния молока, приготовили, окрасили по Граму и микроскопировали мазки. Результаты представлены на фото 3 и 4, а также в таблице 1.
Результаты исследований
1. Результаты посева на МПА:
При учете признаков роста на первой чашке Петри (совместный посев пробиотика и E. coli) мы не наблюдаем заметных отличий роста чистой культуры E. coli и смеси ее с пробионтом (рис. 5).
При учете признаков роста на второй чашке Петри (совместный посев пробиотика и St. aureus) мы наблюдаем заметные отличия: на половине, засеянной чистой культурой St. aureus, рост
Рис. 1. Пищевая добавка Life 9 Рис. 2. Питательная среда МПА с признаками роста
Рис. 3. Учет посева в стерильное обезжиренное молоко
Рис. 4. Микроскопия мазка чистой пробиотической культуры
Рис. 5. Выросшие культуры: слева - E. coli, справа - Рис. 6. Выросшие культуры: слева - St. aureus,
E. coli с пробиотиком справа - St. aureus с пробиотиком
Таблица 1
Результаты посева в стерильное обезжиренное молоко
Культура Внешний вид Вкус и запах Консистенция
St. aureus Отсутствие сгустка Отсутствие запаха диацетила и ацетоина (кисломолочного) Жидкая, однородная
E. coli Отделение сыворотки, наличие неоднородного сгустка Отсутствие запаха диацетила и ацетоина (кисломолочного) Вверху хлопьевидная масса, пузырьки по объему сгустка
Пробиотик и St. aureus Однородная жидкость без осадка и хлопьев Отсутствие запаха диацетила и ацетоина (кисломолочного) Жидкая, однородная, отсутствие сгустка
Пробиотик и E. coli Отделение сыворотки, наличие сгустка, в верху газообразование в виде столбика Отсутствие запаха диацетила и ацетоина (кисломолочного) Сгусток более плотный (держит форму)
Пробиотик Плотный сгусток, легкое отделение сыворотки на поверхности Выраженные кисломолочные вкус и запах Сгусток плотный
обильнее, чем на половине, засеянной смесью с пробионтом (рис. 6).
2. Результаты посева в стерильное обезжиренное молоко.
Обсуждение результатов
В ходе работы была выделена чистая культура микроорганизма-пробионта при посеве на МПА. Выявлено снижение активности роста условно-патогенного St. аureus при совместном культивировании с пробиотическим микроорганизмом. При этом антагонистическое действие пробиотика на E. coli на среде МПА не установлено. Однако, совместное культивирование E. œli и про-биотика на стерильном обезжиренном молоке показало сохранение способности обоих микроорганизмов проявлять признаки роста с выделением молочной кислоты и коагуляцией белка.
Заключение
В результате проведенного исследования обнаружен антагонизм бактерий, входящих в состав про-биотической пищевой добавки Life 9, по отношению к условно-патогенному грамположительному микроорганизму St. ctureus. Кроме того, установлено, что при совместном культивировании с проби-отическим микроорганизмом условно-патогенная грамотрицательная E. coli сохраняет свою биохимическую (сахаролитическую) активность. Опыт дифференцированного применения пробиотических препаратов неоспоримо свидетельствует о том, что их использование наиболее физиологично. Более того, использование пробиотических препаратов показало их явное клинико-микробиологическое преимущество перед антибиотиками, усугубляющих дисбиотические явления кишечника.
Список литературы
1. Антимикробные свойства пробиотиков. ООО «Про-пионикс, официальный сайт»: Текст: электронный. -URL: https://propionix.ru/antimikrobnyye-veshchestva-sinte-ziruyemyye-probiotikami
2. Афонюшкин В. Н., Юшков Ю. Г., Шкред О. В. Способ определения антагонистически активных штаммов бактерий. Патент на изобретение RU 2328734 C1, 10.07.2008. Заявка № 2006133049/15 от 14.09.2006.
3. Госманов Р. Г. Практикум по ветеринарной микробиологии и микологии: учебное пособие / Р. Г. Госманов, Н. М. Колычев, А. А. Барсков. СПб.: Лань, 2022. 384 с. Текст: электронный // Лань: электронно-библиотечная система. URL: https://e.lanbook.com/book/211544
4. Рябцева С. А. Микробиология молока и молочных продуктов: учебное пособие для вузов / С. А. Рябцева,
B. И. Ганина, Н. М. Панова. 4-е, стер. СПб.: Лань, 2021. 192 с. Текст: электронный // Лань: электронно-библиотечная система. URL: https://e.lanbook.com/book/162387
5. Садуллоева Т. И. Определение антагонистической активности пробиотических штаммов микроорганизмов / Т. И. Садуллоева, В. Р. Чичерина // Материалы IX Международной студенческой научной конфе-ренции«Студенческийнаучный форум». Текст: электронный. URL: https://scienceforum.ru/2017/article/2017039197
6. Явников Н. В. Отбор штаммов молочнокислых бактерий для создания пробиотической кормовой добавки. / Н. В. Явников // Ветеринария и кормление. 2020, № 5.
C. 55-57.
7. Guarner F. Глобальные практические рекомендации Всемирной Гастроэнтерологической Организации. Проби-отики и пребиотики / F. Guarner, M. E. Sanders, R. Eliakim, R. Fedorak, A. Gangl, J. Garisch. 2017. 37с. Текст: электронный. - URL: https://www.worldgastroenterology.org/UserFiles/ file/guidelines/probiotics-and-prebiotics-russian-2017.pdf
8. Life 9 - пробиотическая добавка. Текст: электронный. URL: https://www.youngliving.com/ru_RU/products/life-9
9. Life 9 Probiotic Supplement Young Living Essential Oils. Текст: электронный. URL: https://www.youngliving.com/us/ en/product/life-9
10. Servin A. L. Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial pathogens / A. L. Servin [Text] // FEMS Microbiol. Rev. 2004 Oct. 28(4). 405-40. PMID: 15374659.
