CC BY
169
УДК 57.08.043:535.082.56:576.311.347
И.А. Сосимчик, Д.В. Черкашина, А.Ю. Сомов, А.Ю. Петренко
определение активных форм кислорода в митохондриях печени крыс с использованием
дигидрородамина 123
Институт проблем криобиологии и криомедицины нАн Украины (г. Харьков)
Дана робота є фрагментом наукової теми “Вивчення дії низьких температур на властивості стовбурових клітин та клітин-попередників в умовах експериментальної трансплантації та культивування», державнийний реєстраційний номер теми 0107U000528.
Вступление. Повышенный интерес к активным формам кислорода (АФК) в биологии и медицине определяет постоянную потребность в новых чувствительных и специфических подходах, позволяющих идентифицировать продуцируемые радикалы, определить скорость их продукции и визуализировать их пространственное распределение [19]. Следует учитывать, что широкий спектр известных АФК определяет разнообразие их свойств. Некоторые из этих свойств, например, короткое время жизни и присутствие in vivo скавенджерных молекул, способных к захвату активных форм, приводят к определённым трудностям при их выявлении [6].
Считается, что зонд для определения АФК должен обладать следующими свойствами: специфичность, нетоксичность, активность при низких концентрациях, способность легко проникать в органеллы, клетки или ткани. Преимуществом также считается простота в использовании (без применения высоко специализированной аппаратуры) и, конечно же, доступность и низкая стоимость. Ни один известный зонд не соответствует всем этим требованиям, однако, метки, образующие флуоресцентные продукты или индуцирующие хемилюминесценцию, демонстрируют высокую чувствительность и могут быть успешно применены с использованием разнообразной аналитической техники - от спек-трофлуориметров до сложной оптической микроскопии, способной к созданию трёхмерных изображений [6, 19].
Общеизвестно, что наиболее широко для определения АФК используют красители, которые устойчивы в восстановленном состоянии, но могут быть окислены исследуемыми веществами, что сопровождается образованием флуоресцирующих форм [19].
К группе таких зондов относятся дигидро-родамины. Так, дигидрородамин 123 (DHR 123) - незаряженный, бесцветный индика-
тор АФК-может диффундировать через мембраны, где при взаимодействии с активными формами кислорода легко окисляется до флуоресцентной катионной липофильной формы родамин 123 (длина волны возбуждения -488 нм, эмиссии - 525 нм) [4, 6]. В процессе окисления DHR 123 одна из двух аминогрупп таутомеризуется в иминную (рис. 1).
мина 123 и реакция его окисления.
Известно, что DHR 123 окисляется в присутствии таких веществ, как пероксинитрит, гипохлорная кислота, хлорамины, диоксид азота [5, 19, 20]. В настоящее время показана специфичность этого индикатора к перекиси водорода. Например, в работе Henderson и Chappel [10], было показано, что радикал супероксиданиона не сам по себе окисляет DHR 123, а только после превращения в H2O2. Реакция окисления дигидрородамина непосредственно перекисью является медленной, но она может быть катализирована ферментом с пероксидазной активностью, в результате чего значительно увеличивается скорость прироста флуоресценции. В ряде работ [9, 10, 13, 15] DHR 123 использовался для определения внутриклеточного H2O2 в нейтрофилах, HL60 клетках, эндотелиальных клетках, клетках опухоли (SPC-A-1, аденокарцинома лёгких).
Известно, что митохондрии являются одним из основных источников АФК в клетке. В процессе работы электрон-транспортной цепи митохондрий некоторая часть кислорода может быть вовлечена в реакции одноэлектронного восстановления, вместо нормального 4х-электронного, заканчивающегося образованием воды. В результате появляются его “паразитные” формы [16]. Источниками супероксиданиона являются I и III комплексы дыхательной цепи, где происходит
одноэлектронное восстановление кислорода убисемихинон-анион-радикалом [18]. O2' далее превращается в H2O2 под действием супе-роксиддисмутазы.
Такие нарушения работы электрон-транспортной цепи митохондрий могут иметь место в условиях ишемии-реперфузии [11]. Усиление образования АФК в этих условиях может приводить к активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), ведущих, в конечном счёте, к повреждению клеточных и субклеточных мембранных структур [7, 17].
Исходя из вышеизложенного, мы предположили, что DHR 123 может быть использован в качестве индикатора для АФК, продуцируемых митохондриями, что могло бы послужить в дальнейшем обоснованием для выбора критериев оценки оксидативного повреждения.
Целью работы явилось изучение возможности использования DHR 123 для определения продукции АФК в митохондриях из интактной печени, а также печени, подвергнутой холодовой ишемии и последующей тепловой реперфузии.
Объект и методы исследования. Объектом исследования служили изолированные митохондрии, которые выделяли из интактной печени крыс, а также печени, подвергнутой гипотермическому хранению (ГХ) при 4°С в течение 18 часов и последующей нормотермической реперфузии (НР). Для ГХ печень выделяли, насыщали и хранили в сахарозосодержащем растворе (250 мМ сахарозы, 15 мМ Na2HPO4, 30 мМ KH2PO4, 1 мМ MgSO4,
0,5 мМ Cad2, 1% ПЭГ-8000, pH 7,4 ), как описано в работе [2]. Последующая НР проводилась в течение 60 мин при 37 °С. В качестве среды реперфузии использовали раствор Кребс-Рингер бикарбонатный (рН 7,4).
Митохондрии выделяли методом дифференциального центрифугирования [1]. Среда выделения митохондрий содержала 0,3 М сахарозы и 1 мМ ЭДТА, 10 мМ Tris-HCl, pH 7,4.
Содержание белка определяли спектрофотометрически биуретовым методом.
Маточный раствор DHR 123 (Sigma, США) с концентрацией 2 мМ на 100% -ном диметил-сульфоксиде, хранили в темноте при - 20 С. DHR 123 в конечной концентрации 20 мкМ вносили в среду измерения, содержащую 125 мМ KCl, 10 мМ Hepes, 10 мМ KH2PO4 (pH 7,4), и инкубировали при 37 °С.
Измерения проводили в 96-луночном планшете на спектрофлуориметре Tecan GENios (Tecan inc., Австралия). Образцы митохондрий, содержащие 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 мг белка/мл, в среду измерения вводили непосредственно перед добавкой DHR 123. Ин-
дукция перекисного окисления липидов производилась путём добавки в среду измерения 20 мкМ Fe2SO4 и 5 мМ аскорбата. В течение всего эксперимента планшет термостатиро-вался при 37 °C.
Параллельно с опытными исследовали холостые пробы, не содержащие суспензию митохондрий. При последующих расчетах эти показатели вычитались из значений опытной группы. Таким образом, конечные результаты представлены в виде УЕФ (условные единицы флуоресценции) = флуоресценция в опыте - флуоресценция в холостой пробе.
Полученные результаты обрабатывали статистически с помощью программы “Origin 7.5”. Данные оценивали, используя параметрический t-критерий Стьюдента, выражали в виде M ± m. Достоверно отличными считали результаты при р<0,05.
Результаты исследований и их обсуждение. Для оценки возможности использования DHR 123 с целью определения интенсивности продукции АФК было исследовано образование флуоресцентного родамина 123 в ходе инкубации изолированных митохондрий в среде без добавок, а также в присутствии Fe2+ и аскорбата, индуцирующих ПОЛ. Было показано, что прирост флуоресценции носил линейный характер для концентрации митохондрий в пределах 0,05-0,8 мг белка/ мл в течение 20 мин инкубации как в случае спонтанной продукции АФК, так и в условиях индукции ПОЛ. При этом интенсивность флуоресценции при Fe^-аскорбат индуцированной продукции АФК была гораздо выше, чем при спонтанной.
Изучение влияния концентрации митохондрий на образование родамина из DHR 123 показало, что как для спонтанной, так и для Fe^-аскорбат индуцированной продукции АФК оптимальной концентрацией белка являлась 0,2 мг/мл. Критерием выбора служило максимальное значение интенсивности флуоресценции в определённый момент времени, который устанавливался эмпирически как достаточный для окончательной стабилизации системы «DHR 123-суспензия митохондрий». При увеличении концентрации митохондриального белка в среде больше 0,2 мг/мл флуоресценция уменьшалась, очевидно, вследствие мутности суспензии (рис. 2).
Таким образом, последующие эксперименты проводили с использованием добавки митохондрий с содержанием белка 0,2 мг.
Рис. 2. Зависимость интенсивности флуоресценции родамина 123 от концентрации белка после 10 мин инкубации при 37 С.
Чувствительность предлагаемого теста определения АФК исследовали на модели ишемически-реперфузионного повреждения печени, которое, по данным ряда авторов, приводит к усилению продукции АФК и интенсификации ПОЛ [12, 14].
Из рис. 3 видно, что прирост флуоресценции при спонтанном образовании АФК митохондриями печени после ГХ+НР также носил линейный характер. Индикатор, начиная уже с первых минут эксперимента, позволил отразить усиление продукции АФК после ишемии-реперфузии по сравнению со свежеизолированным органом, о чём свидетельствует более высокая интенсивность флуоресценции. Скорость накопления родамина до ГХ+НР составила 33,5 ± 0,4, а после ГХ+нР - 50,4 ± 1,1 УЕФ/мин. Эти данные свидетельствуют о том, что в условиях индукции процессов образования АФК при ишемическом повреждении печени скорость окисления DHR 123 увеличилась в 1,5 раза.
Рис. 3. Влияние ГХ+НР печени на интенсивность флуоресценции родамина 123 при спонтанной продукции свободных радикалов.
Среди существующего на сегодняшний день многообразия методов определения АФК и исследования оксидативных повреждений тех или иных объектов достаточно сложно выбрать оптимальный подход. Условно их можно разделить на 2 группы: 1) оценка результатов взаимодействия АФК с биомолекулами, отражающая степень повреждения объектов; 2) определение непосредственно АФК.
Одним из самых распространённых методов первой группы является спектрофотометрическое определение первичных и вторичных продуктов ПОЛ, в том числе диеновых и других конъюгатов, а также МДА, требующее использования панели органических растворителей и большого количества биологического материала. Довольно часто исследуются продукты оксидативного повреждения молекул ДНК гидроксильными радикалами (высокоэффективная жидкостная или газовая хроматография, дорогостоящее оборудование и расходные материалы), а также продукты, образующиеся при окислении функциональных групп аминокислот, входящих в состав белков (определяют чаще всего спектрофотометрически) [8].
С появлением высокоспецифической чувствительной техники, широкое распространение получают методы определения самих АФК. К ним, например, относится электронный парамагнитный резонанс (ЭПР), суть которого заключается в использовании “спиновых ловушек”, которые перехватывают свободные радикалы и образуют стабильные радикалы, определяемые ЭПР-спектрометром. Чаще всего ЭПР используется для определения нитроксильного и гидроксильного радикалов. Недостатком этого метода является необходимость дорогостоящего оборудования [3, 8].
Для определения продукции свободных радикалов клетками чаще всего используют флуоресцентные и люминесцентные зонды. К наиболее распространённым флуоресцентным меткам относятся дихлорфлуоресцеин, Amplex Red, скополетин, гомованилиновая кислота и дигидрородамины для определения H2O2; гидроэтидин - для супероксидного радикала; флуоресцеин - для гидроксильного. Их применение основано на способности взаимодействовать непосредственно с радикалами и продуцировать флуоресцирующие вещества. Таков же механизм действия люминесцентных зондов, самыми распространёнными из которых являются люминол и люцигенин [6, 8, 19].
Как показали наши исследования, DHR 123 может быть использован в качестве индикатора продукции АФК митохондриями
печени. Преимуществами данного подхода являются: возможность оценки большого количества образцов, его простота, нетрудо-ёмкость, невысокая стоимость, отсутствие потребности в обязательном использовании катализаторов. DHR 123 показал свою пригодность для оценки спонтанной продукции АФК митохондриями интактной печени, что свидетельствует о высокой чувствительности метода, а также печени в условиях ишемии-реперфузии. Усиление интенсивности флуоресценции и увеличение скорости накопления родамина 123 при взаимодействии с органеллами из печени, подвергнутой ГХ/ НР, свидетельствует о возможности определения форм кислорода в условиях патологического процесса, приводящего к развитию оксидативного стресса в клетках.
Выводы.
1. Метод, основанный на окислении дигидрородамина 123 с образованием флуоресцентного родамина, может быть использован для определения продукции активных форм кислорода.
2. Флуоресценция родамина, образующегося при окислении дигидрородамина 123 активными формами кислорода, линейно увеличивается во время инкубации.
3. Установлены оптимальные условия (время инкубации и содержание белка в пробе) определения активных форм кислорода с использованием дигидрородамина.
4. Увеличение интенсивности и скорости окисления дигидрородамина 123 митохондриями печени после ее гипотерми-ческого хранения и нормотермической реперфузии свидетельствует о возможности использования описанного метода для оценки оксидативного повреждения.
Перспективы дальнейших исследований. Результаты проведенных исследований свидетельствуют об эффективности метода определения активных форм кислорода, основанного на окислении дигидрородамина 123 с образованием его флуоресцентной формы, а также определяют перспективу его дальнейшего использования для оценки оксидативного повреждения биологических объектов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Мосолова И.М. Выделение интактных митохондрий из печени крыс / [И.М. Мосолова, И.А. Горская, К.Ф. Шольц и др.] // Методы современной биохимии - М.: Наука, 1975. - С. 45-47.
2. Семенченко О.А. Эффективность введения ПЭГ-8000 в сахарозо-содержащий раствор для гипотермического хранения печени / О.А. Семенченко, Е.Н. Ткачева, Д.В.
Черкашина [и др.] // Трансплантология. - 2008. - Т. 10, № 1.- С. 140-142.
3. Chance B. In vivo detection of radicals in biological reactions / B. Chance, G. Gao // Environ. Health Perspect. - 1994. -Vol. 102, № 10. - P. 29-32.
4. Crow J.P. Dichlordihydrofluorescein and Dihydrorhodamine 123 are sensitive indicators of peroxinitrite in vitro: Implications for intracellular measurement of reactive nitrogen and oxygen species / J.P. Crow // Nitric Oxide. -1997.- Vol.1, № 2. - P. 145-157.
5. Glebska J. Peroxinitrite-mediated oxidation of dichlordihydrofluorescein and dihydrorhodamine / J. Glebska, W. Koppenol // Free Rad. Biol. Med. - 2003. - Vol. 35, № 6. - P. 676-682.
6. Gomes A. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species / A. Gomes, E. Fernandes, L.F.C. Lima Jose // J. Biochem. Biophys. Methods. - 2005. -Vol.65, № 2-3. - P. 45-80.
7. Grace P.A. Ischemia-reperfusion injury / P.A. Grace // Br. J. Surg. - 1994. - Vol. 81, № 5. - P.637-647.
8. Halliwell B. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do results mean? / B. Halliwell, M. Whiteman // Br. J. Pharm. - 2004. - Vol. 142, № 2. - P. 231-255.
9. Hempel S.L. Dihydrofluorescein diacetate is superior for detecting intracellular oxidants: comparison with 2'7'-dichlordihydrofluorescein diacetate, 5(and 6)-carboxy-2',7'-dichlordihydrofluorescein diacetate and dihydrirhodamine 123 / S.L. Hempel, G.R. Buettner, Yu. Q. O'Malley // Free Rad. Biol. Med. - 1999.- Vol. 27, № 1-2. - P. 146-159.
10. Henderson L. Dihydrorhodamine 123: a fluorescent probe for superoxide generation? / L. Henderson, J.B. Chappel // Eur. J. Biochem. - 1993. - vol. 217, № 3. - P. 973-980.
11. Impairment of hepatic mitochondrial respiratory function following storage and orthotopic transplantation of rat livers / I.A. Sammut, M.S. Thorniley, S. Simpkin [et al.] // Cryobiology. - 1998. - Vol. 36, № 1. - P. 49-60.
12. Jaeshke H. Molecular mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning / H. Jaeshke // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. - 2003. - Vol. 284. - P. 15-26.
13. Qin Yo. Dihydrorhodamine 123 is superior to 2'7'-dichlordihydrofluorescein diacetate and dihydrorhodamine 6G in detecting intracellular hydrogen peroxide in tumor cells / Yo. Qin, M. Lu, X. Gong // Cell Biol. Int. - 2008. - Vol. 32, № 2. - P. 224-228.
14. Role of reactive oxygen species in mediating hepatic ischemia-reperfusion injury and its therapeutic applications in liver transplantation / W. Zhang, M. Wang, H. Xie [et al.] // Transplant. Proc. - 2007. - Vol. 39, № 5. - P. 1332-1337.
15. Royall J.A. Evaluation of 2',7'- dichlorofluorescein and dihydrirhodamine 123 as fluorescent probes for intracellular H2O2 in cultured endothelial cells / J.A. Royall, H. Ischiripoulos // Arch. Biochem. Biophys. - 1993. - Vol. 302, № 2 - P. 348-355.
16. Skulachev V.P. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics / V.P. Skulachev // Mol. Aspects. Med. - 1999. - Vol. 20, № 3. - P. 139-184.
17. The role of mitochondria in ischemia-reperfusion injury / W. Jassem, S. Fuggle, M. Rela [et al.] // Transplantation. -2002. - Vol. 73, № 4. - P. 493-499.
18. Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain / J. St-Pierre, J.A. Buckingham, S.J. Roebuck [et al.] // J. Biol. Chem. - 2002. -Vol. 277, № 47. - P. 44784-44790.
19. Wardman P. Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: Progress, pitfalls and prospects / P. Wardman // Free Rad. Biol. Med. - 2007. - Vol.43, № 7. - P. 995-1022.
20. Wrona M. Reactivity of 2',7'-dichlorodihydrofluorescein and dihydrorhodamine 123 and their oxidized forms toward carbonate, nitrogen dioxide and hydroxyl radicals / M. Wrona, K. Patel, P. Wardman // Free Rad. Biol. Med. - 2005. - Vol. 38, № 2. - P. 262-270.
УДК 57.08.043:535.082.56:576.311.347
Сосімчик І.О., Черкашина Д.В., Сомов О.Ю., Петренко О.Ю.
визначення Активних форм кисню в мітохондріях печінки щурів з використанням дигідрородАміну 123
Резюме. Досліджувалась можливість застосування дигідрородаміну 123 (DHR 123) для визначення активних форм кисню (АФК). Об’єктом дослідження слугували мітохондрії печінки щурів. Показано, що під час інкубації мітохондрій у середовищі, що містило DHR 123, який не флуоресцує, останній окиснювався з утворенням флуоресцентного родаміну 123. Накопичення родаміну 123 лінійно збільшувалось під час інкубації та суттєво зростало в умовах індукції перекисного окиснення ліпідів іонами заліза. Наведено залежність інтенсивності флуоресценції від концентрації мітохондрій у середовищі інкубації та визначено оптимальні умови експерименту. Досліджено динаміку окиснення DHR 123 на моделі ішемічного пошкодження печінки, що супроводжується індукцією накопичення АФК. Показано, що гіпотермічне зберігання та наступна теплова реперфузія печінки приводить до збільшення швидкості окиснення DHR 123 в мітохондріях у 1,5 рази. Отримані дані свідчать про можливість використання DHR 123 для визначення АФК у нормі та при оксидативних пошкодженнях.
Ключові слова: дигідрородамін 123, активні форми кисню, мітохондрії, гіпотермічне зберігання печінки, теплова реперфузія.
UDC 57.08.043:535.082.56:576.311.347
REACTIVE OXYGEN SPECIES DETERMINATION USING DIHYDRORHODAMINE 123 IN RAT LIVER MITOCHONDRIA
Sosimchyk I.A., Cherkashina D.V., Somov A. Yu., Petrenko A.Yu.
Summary. he possibility of dihydrorhodamine 123 (DHR 123) application for reactive oxygen species (ROS) determination was investigated. Rat liver mitochondria were the object of investigation. It was shown that non-fluorescent DHR 123 was oxidized with fluorescent rhodamine production during incubation with mitochondria. Rhodamine 123 accumulation increased linearly during incubation and rose significantly when lipid peroxidation was induced with iron ions. The fluorescence intensity dependence on mitochondria concentration in incubation medium was given and optimal conditions for experiment were determined. The dynamics of DHR 123 oxidation was investigated on the model of hepatic ischemic injury that induced ROS accumulation. It was shown that hypothermic storage and following warm reperfusion of the liver resulted in DHR 123 oxidation rate increasing in 1,5 times. Obtained data are the evidence of possibility to use DHR 123 for ROS determination in normal conditions and during oxidative injury.
Key words: dihydrorhodamine 123, reactive oxygen species, mitochondria, liver hypothermic storage, warm reperfusion.
Стаття надійшла 19.11.2009 р.
