CC BY
48
кисного окисления полиненасыщенных компонентов липидов, а использование монохроматического УФ-детектора затрудняло точную идентификацию продукта реакции 4-HNE с 2,4-ДНФГ. Главное отличие липидов морских организмов состоит в высокой степени ненасыщенности, а в процессе их продолжительного перекисного окисления происходит образование очень сложной смеси окисленных липидов. Задачей нашего исследования было усовершенствование метода, описанного Голдрингом, применительно к сложным смесям продуктов окисления рыбных жиров, при проведении которого по возможности сводились бы к минимуму потери определяемого компонента. За основу были взяты методы спек-трофотометрического определения 2,4-динитрофенилгидразонов карбонильных соединений (Jordan, Veatch, 1964) и их разделения ВЭЖХ (Svetlova et al., 1986) и метод, предложенный Голдрингом, для сравнения.
В работе использованы следующие органические растворители: хлороформ, метанол, этанол, бензол, гексан, диэтиловый эфир. Все растворители очищали по стандартным методикам (Гордон, Форд, 1976). Метанол для проведения реакции образования гидразонов карбонильных соединений перегоняли над 2,4-динитрофенилгидразином. Соляная, фос-форномолибденовая и уксусная кислоты, тридекан, сульфат натрия (безв.) были квалификации "хч"; 2,4-динитрофенилгидразин - квалификации "ч"; стандарт (2£)-4-гидрокси-2-ноненаля и антимикробный препарат (водный раствор продуктов автоокисления рыбных жиров) приготовлены по известной методике (Рыбин и др., 1999а).
Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинках с силикагелем "Silufol" (Kavalier, Чехия). Элюировали системой растворителей: гексан-диэтиловый эфир (2: 3, по объему). Вещества на хроматограм-мах обнаруживали опрыскиванием пластинок 10 %-ным раствором фосфорномолибденовой кислоты в этаноле и последующим подогревом пластинок до 60 оС.
Аналитическую высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) осуществляли на хроматографе LC-6A ("Shimadzu", Япония) c использованием колонки Zorbax ODS (4,6 х 250,0 мм, 5 мкм, "DuPont", США) и предколонки Shim-Pack FLC-ODS (4,6 x 50,0 мм, 3 мкм, "Shimadzu", Япония) при температуре колонки 55 оС. Для регистрации хроматограмм использовали УФ-детектор с диодной матрицей SPD-M6A ("Shimadzu", Я пония). Скорость элюирования 1 мл/мин. В качестве элюен-та применяли системы растворителей метанол-вода - уксусная кислота (60,0: 40,0: 0,05) и метанол-вода - уксусная кислота (85,0: 15,0: 0,05).
Газо-жидкостную хроматографию (ГЖХ) проводили на хроматографе GC-16A ("Shimadzu", Япония) с пламенно-ионизационным детектором. В работе применялась капиллярная кварцевая колонка с неподвижной фазой SE-54 (50,0 м х 0,25 мм, "Supelco", США). Скорость потока газа-носителя (гелия) 40 мл/мин. Температура инжектора 210 оС, температура детектора 220 оС, температура колонки изменялась в градиенте от 50 до 210 оС со скоростью 3 оС/мин. В качестве внутреннего стандарта был использован тридекан. Обработку хроматограмм осуществляли на интеграторе сигнала C-R4AX Сhromatopac ("Shimadzu", Япония).
Масс-спектры регистрировали на хромато-масс-спектрометре Agilent MSD 1100 ("Hewlett Packard", США) в режиме химической ионизации (элюентом) при атмосферном давлении, при регистрации отрицательных ионов.
Стандартный раствор 2,4-динитрофенилгидразина (кислый) получали следующим образом: 2,4-динитрофенилгидразин растворяли в 10 мл 1,4 М соляной кислоты при 60 °С при непрерывном перемешивании до полного насыщения раствора. Раствор фильтровали на горячем фильтре, охлаждали до 0 оС. Образовавшиеся кристаллы отфильтровывали и сушили при температуре 60 оС. 0,05 г перекристаллизованного 2,4-динитрофенилгидразина хлорида растворяли в 7 мл 1,4 М соляной кислоты. Полученный раствор 2,4-динитрофенилгидразина хлорида использовали в качестве стандарта.
Стандартный раствор 2,4-динитрофенилгидразина (нейтральный) приготавливали следующим образом: 0,05 г 2,4-динитрофенилгид-разина растворяли в 7 мл метанола, перегнанном над 2,4-динитрофенил-гидразином, при комнатной температуре, раствор охлаждали до 0 оС и фильтровали. Полученный спиртовой раствор 2,4-динитрофенилгидразина использовали в качестве стандарта.
При разработке метода определения 4-HNE в смеси продуктов окисления рыбных жиров необходимо было учитывать сложный состав исследуемых объектов. Результаты недавних исследований таких субстратов, например, антимикробного препарата из рыбных жиров, показали наличие в них более 103 различных соединений (Рыбин, 1999). Обычный ВЭЖХ-анализ такой смеси не давал приемлемых результатов (рис. 1), на хроматограмме видно не более 40 пиков. Из этого следует, что подавляющее большинство компонентов смеси при использовании этого метода не разделяются, что в свою очередь делает невозможным определение отдельных компонентов данным методом.
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 25
Время, МИН
Рис. 1. ВЭЖХ-анализ хлороформного экстракта смеси продуктов окисления жира сардины
Fig. 1. HPLC of the ch lolophormic extract f rom mixture of sardine oil oxidation products
Однако, исходя из структуры 4-NHE - aß-ненасыщенный гидро-ксиальдегид и из результатов определения 2,4-динитрофенилгидразо-нов карбонильных соединений методом ВЭЖХ, полученных Голдрингом с соавторами (1993), следует, что при использовании в качестве элюента для разделения исходной смеси компонентов, исходной смеси АП и продуктов их реакции с 2,4-ДНФГ одной и той же хроматографической системы продукты реакции будут иметь значительно большее значение
25
RT, чем исходные карбонильные соединения. Следовательно, имеется возможность проведения анализа 4-HNE в сложных смесях продуктов окисления рыбных жиров всего за две стадии, а не за 4, как было предложено ранее (Рыбин, Куклев, 1999), что, с нашей точки зрения, существенно увеличивает точность аналитической процедуры.
Известно, что образование 2,4-динитрофенилгидразонов карбонильных соединений происходит практически полностью в кислой среде . В то же время при низких значениях рН усиливается степень прохождения реакций конденсации карбонильных соединений (Агрономов, 1990). Кроме того, в смесях продуктов окисления рыбных жиров содержатся высокореакционноспособные и лабильные соединения (Чумак, 1995). Последние два обстоятельства предопределили задачу данного этапа наших исследований, а именно определение оптимальных условий образования 2,4-динитрофенилгидразона (2£)-4-гидрокси-2-ноненаля и сравнение их с условиями, предложенными Голдрингом с соавторами (Goldring et al., 1993).
С целью увеличения степени прохождения реакции мы исследовали влияние рН реакционной смеси на селективность образования 2,4-динитрофенилгидразона 4-HNE. Результаты показали, что в нейтральной среде образование гидразонов практически не происходило (рис. 2). При рН реакционной смеси 2 мы наблюдали селективное образование 2,4-динитрофенилгидразона 4-HNE за 30 мин реакции при температуре 55 оС (рис. 3).
С целью уменьшения степени прохождения возможных побочных реакций в смеси компонентов АП нами был исследован температурный фактор в реакции образования 2,4-динитрофенилгидразона 4-HNE. Известно, что оптимальная температура реакции при образовании 2,4-ди-нитрофенилгидразонов карбонильных соединений 55 0С (Jordan, Veatch, 1964), однако при этом также ускоряется процесс конденсации карбонильных соединений и, кроме того, возрастает реакционная способность присутствующих в смесях продуктов окисления рыбных жиров перок-сидов и различных активных интермедиатов. Было показано, что процесс образования 2,4-динитрофенилгидразонов 4-HNE при этой температуре является доминирующим, а продукты побочных реакций зафиксированы в реакционной смеси только через 50 мин после начала реакции. В то же время образование 2,4-динитрофенилгидразона 4-HNE происходило полностью через 30 мин реакции, из чего следует, что конверсию 4-HNE в его 2,4-ДНФГ-производное в сложной смеси продуктов окисления рыбных жиров обязательно нужно проводить непосредственно перед ВЭЖХ-анализом. Только в этом случае существует гарантия определения искомого продукта реакции с высокой степенью точности.
Таким образом, было показано, что оптимальные условия получения 2,4-динитрофенилгидразонов карбонильных соединений являются подходящими для получения 2,4-динитрофенилгидразона 4-HNE с целью его определения в сложных смесях продуктов окисления рыбных жиров.
Исходя из сложного состава смеси компонентов АП, для регистрирования 2,4-динитрофенилгидразона 4-HNE недостаточно использовать УФ-детектор с фиксированной длиной волны. Для подтверждения структуры образующегося продукта реакции 4-HNE и 2,4-ДНФГ мы использовали детектор на диодной матрице, позволяющий регистрировать полный электронный спектр компонента анализируемой смеси в диапазоне
26
нием всех его точек, показало, что отделение данного соединения от остальных компонентов реакционной смеси, в том числе и балластных соединений, произошло полностью. Это обстоятельство наблюдалось как при анализе стандартного раствора 4-Н^, так и при анализе АП. С учетом погрешности прибора было установлено, что конверсия 4-НЖ в его 2,4-динитрофенилгидразон произошла практически полностью при проведении реакции в оптимальных условиях, описанных Голдрингом с соавторами (1993). Содержание 4-НЖ в исследуемых объектах было определено методом расчета содержания компонентов смесей по результатам ВЭЖХ-анализа с УФ-детектором, при регистрации хроматог-рафического сигнала при длине волны, соответствующей максимуму поглощения вещества в данной системе растворителей (Рыбин, Саяпина, 1999).
40.5 45
Время, мин
Рис. 6. ВЭЖХ-анализ смеси компонентов АП до (а) и после (б) прохождения реакции, элюент - метанол-вода (60: 40)
Fig. 6. HPLC of the antimicrobial preparation components mixture before (a) and after (б) beginning of reaction. Methanol-water (60: 40) was used as eluent
Калибровку проводили по стандартному раствору 4-Н^, концентрация которого была определена методом ГЖХ с использованием внутреннего стандарта С13 (тридекана), а значение коэффициента молярного
31
Сравнение содержания 4-HNE, поглощения 2,4-ди-
определенного методами ГЖХ и ВЭЖХ нитрофенилгидразо-
Comparison of (2£)-4-hydroxy-2-nonenal content нов мононенасы-
determined GLC and HPLC methods щенных карбониль-
Концентрация 4-HNE, мкМ ных соединении Объект исследования ГЖХ ВЭЖХ было установлено
Стандарт 4-HNE (1 мкМ) 1 0,98
ВодныИ раствор продуктов окисления жира сардины 86,3 92,8
ранее ^о hman, 1958). Таким образом, предложенный метод анализа содержания 4-HNE высокоэффективной жидкостной хроматографией его 2,4-динитрофенилгид-разона легко может быть применим к сложным смесям продуктов окисления липидов, в том числе рыбных жиров. Точность количественного определения 4-HNE в исследованной смеси продуктов окисления жира сардины составила не менее 97 %. Более высокая точность анализа методом ВЭЖХ объясняется практически полным отсутствием потерь, связанных с проведением пробоподготовки и значительно влияющих на корректность получаемых результатов.
Таким образом, показано, что метод определения 4-HNE, описанный Голдрингом с соавторами (1993), при некотором усовершенствовании (изменение условий хроматографии и детекции разделяющихся компонентов смесей) позволяет с точностью до 97 % проводить определение 4-HNE практически в любых смесях продуктов окисления рыбных жиров, отличающихся от других подобных объектов особо сложным составом. Усовершенствованный метод Голдринга был опробован на реальном объекте исследований - антимикробном препарате (водном растворе продуктов окисления жира сардины).
Литература
Агрономов А.Е. Избранные главы органической химии. - М.: Химия, 1990. - 560 с.
Гордон Ф., Форд Р. Спутник химика. - М.: Мир, 1976. - Р. 437-444.
Давлетшина Т.А., Блинов Ю.Г., Акулин В.Н. и др. Разработка технологии получения антимикробного препарата на основе липидов рыб // Изв. ТИНРО. - 1997. - Т. 120. - С. 61-67.
Рыбин В.Г. Новый природный антимикробный препарат из рыбных жиров и отходов жирового производства // Междунар. конф. "Проблемы экологии и рационального природопользования Дальнего Востока". - Владивосток: ВГУЭС, 1999. - С. 186-187.
Рыбин В.Г., Куклев Д.В. Определение 4-гидрокси-2Е-ноненаля в смеси продуктов окисления полиненасыщенных липидов методом газо-жидко-стной хроматографии // Изв. ТИНРО. - 1999. - Т. 125. - С. 115-121.
Рыбин В.Г., Куклев Д.В., Бывальцева Т.М. и др. (2£)-4-гидрокси-2-ноненаль - активный компонент нового природного антимикробного препарата // Биоорган. химия. - 1999а. - Т. 25, № 9. - С. 716-720.
Рыбин В.Г., Куклев Д.В., Бывальцева Т.М. и др. (2£,6Z)-4-гидро-кси-2,6-нонадиеналь - активный компонент антимикробного препарата // Изв. ТИНРО. - 1999б. - Т. 125. - С. 238-243.
Рыбин В.Г. Саяпина Т.А. Применение твердофазной экстракции в одновременном определении витаминов А, D2 и Е в рыбных жирах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Изв. ТИНРО. - 1999. - Т. 125. - С. 122-126.
Рыбин В.Г., Шульгина Л.В., Куклев Д.В. и др. Факторы, определяющие активность нового антимикробного препарата из рыбных жиров различ-
32
ной природы // Прикл. биохимия и микробиология. - 2000. - Т. 36, № 4. - С. 492-496.
Чумак А.Д. Окисление липидов рыб. Методы определения // Изв. ТИН-РО. - 1995. - Т. 118. - P. 3-18.
Goldring C., Casini A.F., Maellaro E. et al. Determination of 4-hydrox-ynonenal by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection // Lipids. - 1993. - Vol. 28 , № 2. - P. 141-145.
Jordan D.E., Veatch F.C. Spectrophotometry determination of trace concentrations of carbonyl compound // Anal. Chem. - 1964. - Vol. 36, № 1. - P. 120-124.
Lohman F.H. Spectrophotometry determination of carbonyl oxygen // Ibid. - 1958. - Vol. 30, № 5. - P. 972-974.
Sakai T., Kuwazuru S. A li pid peroxidation-derived aldehyde , 4-hydroxy-2-nonenal, contents in several fish meats // Fisheries Science. - 1995. - Vol. 61, № 3. - P. 527-528.
Svetlova N.I., Sokolova L.I., Grigoryeva D.N., Golovnya R.V. Application of the universal equation for liquid chromatography to the calculation of the retention parameters for 2,4-dinitrophenylhydrazone derivatives of carbonyl compounds // J. Chromatography. - 1986. - Vol. 364. - P. 203-207.
Поступила в редакцию 18.05.2001 г.
