CC BY
55
Онкорновирусная инфекция и методы диагностики
А.П. Жуков, профессор, д.вет.н., И.С. Пономарева, доцент, к.биол.н., Оренбургский ГАУ
Понятие о лейкемии как самостоятельной нозологической единице было введено в литературу Р. Вирховым (1845—1853), который, наблюдая в крови больных людей множество бесцветных клеток, установил связь этого явления с увеличением селезенки и лимфатических узлов.
Впервые у лошади лейкоз был описан Лейзерингом (1858), у крупного рогатого скота — О. Сидамгродским, Притчем и Ионевым в начале семидесятых годов прошлого столетия [1].
Официальная регистрация лейкоза в нашей стране произведена в 1965 г.
На 01.01.2001 года было зарегистрировано 2707 неблагополучных пунктов по лейкозу крупного рогатого скота, на 01.01.2002 г. — 2989, что в 1,10 раза больше. В 2000 г. было подвергнуто гематологическим исследованиям 4891904 головы животных, выявлено 114717 (2,3%) больных и более 104 тыс. подозрительных по заболеванию лейкозом. Серологическим исследованиям было подвергнуто 12995262 головы и выявлено инфицированных вирусом лейкоза - 1778729 (13,7%) [2].
В результате длительных исследований установлена вирусная природа возбудителя заболевания.
ВЛКРС в нуклеотиде БЬУ содержит фосфорилированный белок р 15, основной внутренний белок р24 и связующийся с нуклеиновой кислотой белок р12. Вирусный нуклеотид окружен двойным слоем липидов, в котором закреплены гликопротеиды оболочки БЬУ: gp30 — гликолизированный трансмембранный белок, содержащий 214 аминокислот, и gp51 — внешний мембранный белок (содержащий 268 аминокислот), определяющий инфекционность. Гликопротеид gp51 является протективным антигеном лейкоза, ответственным за образование нейтрализующих антител [3, 4].
В настоящее время лейкоз занимает первое место среди инфекционных заболеваний в РФ, возможно причина тому — передержка инфицированных животных в стаде, несовершенство методов диагностики.
Я. Оо12е в 1954 г. установил, что происходит увеличение количества лейкоцитов за счет лимфоцитоподобных клеток. Им была создана схема диагностики: «лейкозный ключ Гетце». Сущность гематологического метода заключалась в определении количества лейкоцитов в 1 мкл крови и процента лимфоидных клеток в лейкоформуле. В мире насчитывается всего около двух десятков лейкозных ключей (геттингемский, копенгагенский, кильский, румынский), сущность их сводится к определению
абсолютного количества лимфоцитов в 1 мкл крови. Гематологическими методами удается выявить от 10 до 60% больных лейкозом животных.
Клинический метод применяется при появлении клинических признаков, чаще это наблюдается в конце стельности, после отелов, при интоксикациях, иммунодефицитных состояниях организма. Проявляются они неспецифическими признаками: ухудшением состояния, нарушением половых циклов, отсутствием аппетита, гипотонией преджелудков, отеками в области подгрудка, живота и др. Специфические признаки — увеличение лимфатических узлов и опухолевые разрастания.
Для выявления специфических противовирусных антител в сыворотках инфицированных животных разработаны многочисленные методы.
РСК для диагностики ВЛКРС была предложена в 1974 г. Выявление серопозитивных животных наблюдалось в титрах от 1:4 до 1:2048, участвующие в РСК антитела направлены против структурных белков ВЛКРС: ёр51, gp35, р24, р15.
В конце 70-х гг. прошлого века появились сообщения о возможности обнаружения антител методом иммуноферментного анализа (ИФА). Результаты выявления антител двумя способами совпадали в 99,5% случаев. Однако ИФА более трудоемкий метод.
Реакцию иммунной диффузии (РИД) с 1982 г. в СССР было предусмотрено проводить с использованием двойного антигена — гликопротеидного ^р51) и полипептидного (р24). Совпадение результатов с РСК составляло 82,7% случаев.
Титр циркулирующих антител может снижаться у инфицированных ВЛКРС коров до и после отела и восстанавливаться через месяц.
Одним из характерных свойств ретровирусов является наличие фермента — РНК-зависимой ДНК-полимеразы, — способного синтезировать вирусспецифическую ДНК на матрице геномной РНК ретровируса. Это позволяет вирусному геному включаться в геном клетки-хозяина и долгое время существовать в форме провируса [5].
В этот период, который может длиться до нескольких лет, не наблюдается никаких признаков заболевания, в том числе не происходит образования антител.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР), используемая для выявления ВЛКРС до начала выработки антител, проводится в три этапа: выделение РНК из исследуемого материала; проведение реакции обратной транскрипции и постановка ПЦР (амплификация участка полученной к ДНК); электрофоретический анализ продуктов ПЦР. Данный метод целесообразно применять для выявления
вирусоносителей в элитных, благополучных и неблагополучных стадах на заключительном этапе оздоровления, а также для получения ранних результатов биопробы.
Биопробу ставят на овцах, но в настоящее время экономически более выгодно использовать для проведения таких исследований кроликов.
Нами проведен анализ методов диагностики лейкоза, применяемых в лабораториях области, и мониторинг эпизоотической ситуации за послед-ние 15 лет. С начала восьмидесятых годов в вирусологическом отделе лаборатории проводили гематологические исследования проб крови и гистологические исследования патологического материала от убитых животных. Для повышения диагностической ценности гематологического метода выявлялись клетки ранней зрелости, ридеровские клетки, двуядерные и другие, как это было предложено Г.А. Симонян. Малодифференцированные форменные элементы крови изображены на рис. 1.
С момента введения серологических методов и до настоящего времени основным методом диагностики остается РИД, несмотря на то, что наблюдаются случаи выпадения положительной реакции и получения ложноположительных результатов при различного рода причинах, в том числе и ассоциированном течении инфекции (с туберкулезом, колибактериозом, пироплазмозом...), проведение вакцинации поголовья, хронические маститы и др. Метод РИД является самым простым в исполнении, чувствительным, и результат не зависит откачества сыворотки. Таким образом, за рассматриваемый нами период (1991—2005 гг.) было исследовано серологическими методами в 35 районах и городах области 2650055 голов крупного рогатого скота. Процент инфицированности составил 14% (в среднем по области), максимальные
Рис. 1 - Картина крови при лимфолейкозе крупного рогатого скота (схема):
1 - лимфоциты; 2 - ридеровские формы лимфоцитов; 3 - двухъядерные лимфоциты; 4 - пролимфоцит; 5 - лимфобласт; 6 - тени Боткина-Гумпрехта; 7 - сегментоядерный нейтрофил; 8 - эритроциты; 9 - лимфоциты с митозом ядра.
выявления отмечены в Бугурусланском районе — 44,1%, Оренбургском — 23,8%, минимальными оказались показатели в Курманаевском районе —
0,21%, в Северном — 2,1%. Гематологическими методами было исследовано 2478848 голов, процент гематологически больных в среднем — 1,98%, при минимальных результатах 0,42% — в Саракташском районе, 1,39% — в Соль-Илецком районе. В последние десятилетия происходило уменьшение поголовья скота, а процент выявления серопозитивных и количество больных животных удерживались примерно на одном и том же уровне. Поэтому для более точного отражения эпизоотической ситуации по лейкозу мы использовали показатель превалентности. Превалентность — это отношение носителей возбудителя ВЛКРС к общему числу животных соответствующего вида. Нами были получены результаты, отраженные в табл. 1.
Приводим наиболее значимо отличающиеся величины за исследованный период. Инфицированность поголовья увеличивалась в 1991—2005 гг. с 7,1 до 21,2%, превалентность — с 5,8% до 37,9%.
Можно заметить, что инфицированность и превалентость поступательно увеличиваются в соответствии с эпизоотическим процессом.
1. Результаты серологических исследований на лейкоз в хозяйствах Оренбургской области
Годы Поголовье животных Иссле- довано Инфициро- ванность,% Превалентность, %
1991 1752,0 136737 7,4 5,8
1992 1697,9 179371 8,5 9,0
1995 1358,6 191284 12,6 17,8
1996 1171,2 185790 11,5 18,2
1997 990,0 194112 14,2 27,8
1998 939,9 204580 17,2 37,4
1999 830,5 200204 15,1 36,3
2000 808,7 183950 13,8 31,4
2001 819,8 188488 16,5 37,9
Таким образом, из приведенного описания характеристик динамики эпизоотических показателей по лейкозу можно сделать вывод, что эпизоо-тический процесс лейкоза в хозяйствах области находится в стадии подъема.
Литература
1 ^дрявцева, Т.П. Лейкоз животных. М.: Pоccельxозиздат, 1980. 158 с.
2 Научно-техническая программа «Неотложные меры профилактики и борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в племенных хозяйствах Pоccийcкой Федерации» // Ветеринарный консультант. 2003. №13. C. 6.
3 Burny, A. Leukaemogenesis bj bovine leukemia virus // Mechanisms of viral leukaemogenesis /Ed. Bj J.M/Goldman, O.Jarret. Edinburg, 1984. P. 229-260.
4 Орлянкин, Б.Г. Е.лассификация ретровирусов и характеристика вирусов лейкоза крупного рогатого скота / Б.Г. Орлянкин, М.И. Гулюкин, Н.В. Замараева, Е..Ю. Знаков // Ветеринария. 2000. №5. C. 17-19.
5 Klintevall K. // Dis. Uppsala, 1995, 57.
