CC BY
108
УДК 613.952:612.273:616.001
Ю.В. Кореновский, Е.В. Горбено, О.В. Ремнева, Н.И. Фадеева, С.А. Ельчанинова
E-mail: [email protected]
ОКСИДАТИВНЫЙ СТРЕСС И АНТИОКСИДАНТНАЯ СПОСОБНОСТЬ У НЕДОНОШЕННЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ С ПЕРИНАТАЛЬНОЙ ГИПОКСИЕЙ ПРИ РОЖДЕНИИ И НА СЕДЬМЫЕ СУТКИ ЖИЗНИ
ГОу ВпО Алтайский государственный медицинский университет росздрава, г Барнаул ВВЕДЕНИЕ
Перинатальное гипоксически-ишемическое повреждение — важная причина заболеваемости новорожденных. Ранее показана продукция свободных радикалов и оксидативное повреждение при гипоксии плода [9]. Хотя клинические последствия гипоксии хорошо изучены, специфические биохимические процессы свободно-радикального повреждения неясны. Оксида-тивный стресс и повреждение тканей наблюдается при гиперпродукции свободных радикалов и/или дефиците антиоксидантов [7]. У новорожденных повышен риск оксидативного стресса, и они очень чувствительны к оксидативному повреждению [11] из-за дисбаланса между анти- и прооксидантами [8]. У новорожденных с гипоксией повышенная генерация свободных радикалов и окисление липидов в плазме отмечается сразу после рождения [5]. Терапия новорожденных в первую неделю после рождения (оксигенотерапия, искусственная вентиляция легких, парентеральное питание) усугубляет оксидативный стресс.
Свободные радикалы нейтрализуются антиоксидантами, включая внутриклеточные и внеклеточные
антиоксидантные энзимы (супероксиддисмутаза, ка-талаза, глутатионпероксидаза) и низкомолекулярные антиоксиданты (глутатион, витамины С и Е, кароти-ноиды), а также альбумин и метаболиты (мочевая кислота, билирубин).
Мы оценили динамику оксидативного повреждения и уровня антиоксидантов в первую неделю жизни новорожденных с перинатальной гипоксией.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В настоящее исследование были включены 79 новорожденных с гестационным возрастом 22-42 недели (табл. 1), родившихся в МУЗ «Родильный дом» № 2 г. Барнаула. Все новорожденные с дефектами развития, врожденными нарушениями метаболизма, резус-конфликтом, сепсисом, родившиеся от матерей с многоплодной беременностью и матерей с сахарным диабетом были исключены из исследования.
У 49 из 79 новорожденных диагностировалась перинатальная гипоксия по наличию по меньшей мере двух из следующих симптомов: интранаталь-ный дистресс с фетальной брадикардией < 100 ударов в минуту; < 6 баллов по шкале Апгар на 5-й мин; потребность в реанимационных мероприятиях > 1 мин с потребностью в кислородотерапии. Основанием для выбора этих критериев послужили работы G. Виопосоге [4-6], где показано, что указанные критерии оптимальны для диагностики перинатальной гипоксии даже легкой степени тяжести.
Гепаринизированные образцы крови забирались из умбиликальной вены после ее перерезания сразу после рождения и из периферической вены на 7-е сутки после рождения.
Тиобарбитурат-реактивные продукты (ТБРП) определялись фотометрически по интенсивности окраски комплекса с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [2]. В опытную пробирку вносилось 0,5 мл воды, 0,5 мл плазмы крови, 1,0 мл трихлоруксусной кислоты, 0,1 мл НС1 и 1,0 мл ТБК. В контрольную вместо плазмы добавлялась вода. После инкубации при 100е С в течение 15 мин пробы охлаждались, центрифуги-
Таблица 1
Клиническая характеристика новорожденных*
Гипоксия(n = 49) Здоровые(n = 30)
Гестационный возраст (нед.) 36,0 ± 5,1 39,0 ± 1,2
Пол мужской/женский (п) 26/23 15/15
Вес при рождении (кг) 2,53 ± 0,69 3,34 ± 0,37
Баллы Апгар на 1-й мин 6,2 ± 1,2 7,1 ± 1,0
Баллы Апгар на 5-й мин 8,0 ± 1,1 9,7 ± 1,0
Интубация (п) 22 -
Вагинальные роды/кесарево сечение (п) 25/24 26/4
Диагностические критерии перинатальной гипоксии — наличие по меньшей мере двух из следующих симптомов: интранатальный дистресс с фетальной брадикардией < 100 ударов в минуту; < 6 баллов по шкале Апгар на 5-й мин; потребность в реанимационных мероприятиях > 1 мин с подачей кислорода.
КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ровались, и измерялась оптическая плотность против контрольной пробы при 535 нм.
Общая антиоксидантная активность (ОАА) плазмы определялась по степени ингибирования Fe2+/аскорбат-индуцированного окисления ТВИН-80 плазмой [1]. При этом в посуду темного стекла с притертыми пробками объемом 200 мл вносилось 2 мл ТВИН-80, 0,2 мл раствора сульфата железа, 0,2 мл раствора аскорбиновой кислоты и 0,1 мл плазмы крови. В контрольную пробу добавлялось 0,1 мл воды. После 48 ч инкубации при 40е С к 2,0 мл смеси добавлялся 1 мл ТХУ и через 60 мин смесь центрифугировалась 15 мин при 8000 об/мин. Затем к 1 мл супернатанта добавлялось 2 мл ТБК, раствор инкубировался на кипящей водяной бане 15 мин и после охлаждения фотометрировался при 532 нм против дистиллированной воды.
Результаты работы представлены в виде значений M ± SD (средняя ± стандартное отклонение). Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с применением непараметрических тестов Вилкоксона и Фишера для сравнения связанных и несвязанных величин. Для оценки корреляционных связей между показателями использовался коэффициент ранговой корреляции Спирмана. За статистически значимые принимались различия и корреляции при величине достигнутого уровня значимости р<0,05. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы JMP 5.1.2 для Windows (SAS Institute Inc., NC, USA).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Уровни ТБРП в плазме крови у новорожденных с гипоксией были значительно выше, а ОАА — ниже, чем
у новорожденных без гипоксии в плазме пуповинной крови и на 7-е сутки после рождения (табл. 1).
Подобные результаты обнаружены у значительно недоношенных новорожденных с гестационным возрастом < 32 недель (п = 10) по сравнению со здоровыми новорожденными (п = 30). При этом у недоношенных новорожденных уровень ТБРП в пуповинной крови составил 0,56 ± 0,11 против 0,20 ± 0,06 нмоль/мл у здоровых новорожденных (р < 0,0001); ОАА 24,4 ± 1,7 против 29,9 ± 2,2 % (р < 0,0001). На 7-е сутки уровень ТБРП составил 0,76 ± 0,13 против
0,34 ± 0,06 нмоль/мл (р < 0,0001); ОАА 24,9 ± 1,4 против 44,2 ± 2,2 % (р < 0,0001).
Примечательно, что уровни ТБРП и ОАА в пуповинной крови были связаны с гестационным возрастом новорожденных (табл. 3). Причем связь между уровнем ТБРП на 7-е сутки после рождения и гестационным возрастом новорожденных усиливалась (табл. 3).
ОБСУЖДЕНИЕ
В течение родов плод из относительной гипоксии попадает в относительную гипероксию. Высокие концентрации кислорода токсичны для тканей плода. Потенциальным механизмом токсичности и патофизиологического повреждения клеток является гиперпродукция свободных радикалов [4].
Свободные радикалы генерируются при гипоксии, ишемии-реперфузии, гипероксии, активированными нейтрофилами и макрофагами, при дисфункции митохондрий, в реакциях Фентона, при повреждении эндотелия, метаболизме ненасыщенных жирных кислот [ 15]. Свободные радикалы, пероксиды липидов и протеинов обусловливают деструкцию мембран и повреждение
Таблица 2
Уровни ТБРП и ОАА в плазме крови новорожденных при рождении и на 7-е сутки жизни*
Гипоксия(n = 49) Здоровые(n = 30) р1
При рождении На 7-е сутки Р При рождении На 7-е сутки р
ТБРП 0,46 ± 0,12 0,54 ± 0,21 < 0,0001 0,20 ± 0,06 0,34 ± 0,06 < 0,0001 < 0,0001
ОАА 25,2 ± 2,2 26,4 ± 2,5 < 0,0001 29,9 ± 2,2 44,2 ± 2,2 < 0,0001 < 0,0001
*ТБрп — тиобарбитурат-реактивные продукты, ОАА — общая антоиксидантная активность. Данные представлены в виде M ± SD. р — достигнутый уровень значимости различий в парных сравнениях по критерию Вилкоксона. р1 — достигнутый уровень значимости межгрупповых различий величин ТБрп и ОАА по критерию Фишера.
Таблица 3
Корреляции между гестационным возрастом новорожденных с перинатальной гипоксией и уровнем ТБРП и ОАА при рождении и на 7-е сутки жизни (п = 49)*
ТБРП при рождении ТБРП на 7-е сутки жизни ОАА при рождении ОАА на 7-е сутки жизни
Гестационный возраст -0,43 (0,0019) -0,59 (<0,0001) 0,39 (0,0063) 0,35 (0,0150)
*значения стандартизированы по коэффициенту корреляции спирмана с величинами достигнутого уровня значимости р в скобках.
Ю.В. Кореновский, Е.В. Горбено И ДР.
ПЕРИНАТАЛЬНЫЙ ОКСИДАТИВНЫЙ СТРЕСС
клеток. В ответ на оксидативный стресс клетки индуцируют антиоксидантные энзимы, однако гиперпродукция оксирадикалов приводит к повреждению протеинов, липидов и ДНК, что ведет к трансформации или гибели клетки посредством апоптоза или некроза [10].
Новорожденные подвержены повышенному риску оксидативного повреждения из-за дисбаланса анти-и прооксидантов, что обусловливает повреждение тканей [8]. В плазме новорожденных мало глутати-онпероксидазы, супероксиддисмутазы, ^-каротина, рибофлавина, а-протеиназы, витамина Е, Se, Си, Zn, церулоплазмина и трансферрина [3].
Гиперпродукция свободных радикалов— важная особенность большинства (если не всех) болезней новорожденных [13]. Гипоксия - это один из факторов, включающих генерацию свободных радикалов в перинатальный период. В течение гипоксии снижение производства АТФ приводит к накоплению аденозина и гипоксантина [4], а продукт деградации АТ Ф является субстратом для ксантиноксидазы, продуцирующей оксирадикалов в фазу реперфузии [11, 12]. Другими источниками оксирадикалов являются цепь переноса электронов в митохондриях и реакции Фентона [10].
На первой неделе жизни у недоношенных новорожденных повышен риск развития оксидативного стресса из-за высоких концентраций кислорода в окружающей среде по сравнению с его уровнем т ^его, оксигено-терапии и высоких концентраций свободного железа в эритроцитах и плазме крови [6].
Мы обнаружили повышенное содержание в плазме крови новорожденных ТБРП и низкую ОАА у новорожденных с гипоксией. Различия в уровне ТБРП и ОАА у новорожденных с гипоксией по сравнению со здоровыми сохранялись до 7 суток после рождения.
Отрицательная корреляция обнаружена между гес-тационным возрастом и уровнем ТБРП в пуповинной крови и на 7-е сутки после рождения. При этом отмечалась положительная корреляция между гестационным возрастом новорожденных и ОАА пуповинной крови на 7-е сутки после рождения. Это указывает, что дефицит антиоксидатнов при перинатальной гипоксии, возможно, обусловливает повышенное по сравнению со здоровыми новорожденными свободно-радикальное повреждение липидов тканей новорожденных в первую неделю жизни.
У новорожденных без гипоксии на 7-е сутки после рождения также наблюдается повышение уровня оксида-тивного стресса. Это, по-видимому, связано с переходом из относительной гипоксии т ^его в условиях относительной гипероксии. Свидетельство персистирующего оксидативного стресса у новорожденных без гипоксии указывает на физиологичность этого феномена.
Следовательно, реанимация новорожденных должна проходить максимально осторожно, чтобы не усугублять оксидативный стресс, а вместо кислорода желательно использовать комнатный воздух [14]. Эти стратегии должны уменьшить генерацию оксирадика-лов и оксидативный стресс.
ЛИТЕРАТУРА
1. Благородов С.В. Метод определения антиокисли-тельной активности и синтетические антиоксиданты в ряду производных оксазина и непредельных хлоркетонов / Благородов С.В., Шелепов А.П., Дмитриева Н.А. // Тезисы II Всесоюзной конференции “Биоантиоксидант”.
— Черноголовка, 1986. — С. 28-29.
2. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. — М.: Наука, 1972. — 252 с.
3. Bracci R. The antioxidant status of erythrocytes in preterm and term infants / Bracci R., Buonocore G. // Semin Neo-natol. — 1998. — Vol. 3. — P. 191-197.
4. Buonocore G. Free radicals and brain damage in the newborn / Buonocore G., Perrone S., Bracci R. // Biol. Neonate.
— 2001. — Vol. 79. — P. 180-186.
5. Buonocore G. Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies / Buonocore G., Perrone S., Longini M., Terzuoli L., Bracci R. // Pediatr. Res. — 2000. — Vol. 47. — P. 221-224.
6. Buonocore G. 1998 Intraerythrocyte nonprotein-bound iron and plasma malondialdehyde in the hypoxic newborn / Buonocore G., Zani S., Perrone S., Caciotti B., Bracci B. // Free Radic. Biol. Med. — 1998. — Vol. 25.
— P. 766-770.
7. Halliwell B. Free radicals, antioxidants and human disease: curiosity, cause, or consequence? Lancet. — 1994. — Vol. 344. — P. 721-724.
8. Jacob R.A. The integrated antioxidant system. Nutr. Res.
— 1995. — Vol. 15. — P. 755-766.
9. Maulik D. Direct detection of oxygen free radical generation during in utero hypoxia in the fetal guinea pig brain / Maulik D., Numagami Y., Ohnishi S.T., Mishra O.P., De-livoria-Papadopoulos M. // Brain Res. — 1998. — Vol. 798.
— P. 166-172.
10. Mishra O.P. Cellular mechanisms of hypoxic injury in the developing brain / Mishra O.P., Delivoria-Papadopoulos M. // Brain Res. Bull. — 1999. — Vol. 48. — P. 233-238.
11. Saugstad O.D. Mechanisms of tissue injury by oxygen radicals: implications for neonatal disease. Acta Paediatr.
— 1996. — Vol. 85. — P. 1-4.
12. Saugstad O.D. Role of xanthine oxidase and its inhibitor in hypoxia: reoxygenation injury. Pediatrics. — 1996. — Vol. 98. — P. 103-107.
13. Saugstad O.D. Update on oxygen radical disease in neonatology Curr. Opin. Obstet. Gynecol. — 2001. — Vol. 13. — P. 147-153.
14. Saugstad O.D. Resuscitation of asphyxiated newborn infants with room air or oxygen: an international controlled trial: the Resair 2 study / Saugstad O.D., Rootwelt T., Aalen O. // Pediatrics. — 1998. — Vol. 102. — P. e1.
15. Turrens J.F. Superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Biosci. Rep. — 1997. — Vol. 17. — P. 3-8.
16. Witko-Sarsat V. 1996 Advanced oxidation protein products as a novel marker of oxidative stress in uremia / Witko-Sarsat V., Friedlander M., Capeillere-Blandin C., Nguy-en-Khoa T., Thu Nguyen A, Zingraff J., Jungers P., Descamps-Latsca B. // Kidney Int. — 1996. — Vol. 49. — P. 1304-1313.
Авторы выражают признательность за помощь в проведении исследования сотрудникам МУЗ «Родильный дом» № 2 г. Барнаула и лично главному врачу Ананину Л.П.
OXIDATIVE STRESS AND ANTIOXIDANT ABILITY IN PREMATURE NEWBORNS HAVING PERINATAL HYPOXIA DURING DELIVERY AND ON THE 7-TH DAY OF LIFE
Yu.V. Korenovski, Ye.V. Gorbeno, O.V. Remnyova, N.I. Fadeyeva, S.A. Yelchaninova
SUMMARY
Estimation results of oxidative stress and antioxidants levels in blood plasma in premature newborns during delivery and on the 7-th day of life are
presented in the article. Heparinized blood samples of 49 premature newborns and of 30 controls were obtained from the umbilical vein immediately after delivery and from a peripheral vein on postnatal 7-th day. Thiobarbituric acid-reacting substances levels were significantly higher but antioxidant capacity significantly lower in cord and the 7-th day blood samples of premature newborns compared to controls. Statistically significant correlations were observed between gestational age premature newborns concerning thiobarbituric acid-reacting substances levels and antioxidant capacity plasma levels on the 7-th day.
