CC BY
32
УДК 616.36-002.2-06:616.36-002.17-074 001: 10.17238/РшД609-1175.2018.4.63-70
Оксидативное и нитрозативное повреждение ДНК в патогенезе фиброза печени при хронических вирусных гепатитах
А.О. Михайлов1, А.Ф. Попов2, В.А. Иванис2, Е.В. Хамуева1, Н.С. Иванова2, А.И. Симакова2
1 Краевая клиническая больница № 2 (690105, г. Владивосток, ул. Русская, 55),
2 Тихоокеанский государственный медицинский университет (690002, г. Владивосток, пр-т Острякова, 2)
В сыворотке крови 150 пациентов с хроническими вирусными гепатитами (ХВГ) В и С и в сыворотке крови и в гомо-генатах печени, взятых после 31 аутопсии лиц, погибших от цирроза печени в исходе ХВГ, исследовали общую анти-оксидантную активность, содержание 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина, 8-нитрогуанина, восстановленного глутатиона, малонового диальдегида и 4-гидрокси-2,3-ноненаля. Также методом комет анализировали степень деструкции ДНК в лимфоцитах периферической крови и гепатоцитах. Установлено, что деструкция ДНК гепатоцитов и лимфоцитов периферической крови - один из ведущих компонентов формирования фиброза печени при ХВГ В и С и может рассматриваться, как его патогномоничный маркер. Выявлена прямая связь повреждений ДНК с выраженностью склеротических изменений в печени. Оксидативный и нитрозативный стресс вызывал в гепатоцитах и лимфоцитах значимые нарушения целостности мембранных органелл. Биохимические изменения в ткани печени при ХВГ В и С в целом сопоставимы с таковыми в сыворотке крови по всем показателям, что делает их перспективными в плане разработки алгоритмов диагностики фиброза печени.
Ключевые слова: метод ДНК-комет, оксидативный и нирозативный стресс, гепатоциты, лимфоциты
Несмотря на большое количество исследований, посвященных вирусным гепатитам, многие вопросы их патогенеза до сих пор остаются нерешенными. В первую очередь это относится к патогенным свойствам самих вирусов, характеру и закономерностям реагирования организма-хозяина на антиген, формированию цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы и ряду других аспектов [4, 10]. С другой стороны, важна и оценка непосредственной геноток-сичности вирусов гепатитов В и С [8]. В этом направлении разрабатываются теории, связанные с апопто-зом гепатоциов, считающимся ключевым моментом в патогенезе вирусного поражения печени. Однако работ, в которых оценивались бы количественные характеристики деструкции ДНК при вирусных гепатитах, не так уж много. Есть противоречивые данные о состоянии ДНК лимфоцитов периферической крови при хроническом вирусном гепатите (ХВГ). Одни авторы указывают здесь на наличие значимых изменений, другие эти данные не подтверждают [4, 7, 9]. К настоящему времени до конца не определена зависимость между степенью деструкции ДНК гепа-тоцитов и лимфоцитов в разных группах пациентов, страдающих вирусными гепатитами с циррозом печени и без него [5]. Существуют разногласия и в вопросах выделения ведущих факторов неблагоприятного прогноза заболевания. До сих пор неясным остается вклад повреждений ДНК в последующую регенерацию и пролиферацию гепатоцитов [10]. Еще более актуальными проблемами можно назвать выделение маркеров, способных предсказать переход цирроза печени в гепатоцеллюлярный рак, а также поиск путей предотвращения этой трансформации [8].
Михайлов Александр Олегович - врач-гастроэнтеролог ККБ № 2; e-mail: [email protected]
Материал и методы
Настоящее исследование выполнено с 2012 по 2018 гг. и включало 150 пациентов 18-82 лет (в среднем - 40,1 года), страдавших ХВГ С и ХВГ В и находившихся на стационарном лечении в инфекционном отделении Краевой клинической больницы № 2 и отделении вирусных гепатитов Краевой клинической инфекционной больницы. Степень выраженности фиброза печени оценивалась по данным эластометрии. Все исследуемые по выраженности фиброза (категория F шкалы METAVIR) были условно разделены на шесть групп: ХВГ B (F0), ХВГ B (F1-2), ХВГ B (F3-4), ХВГ C (F0), ХВГ C (F1-2) ХВГ C (F3-4). Контрольную группу сформировали 43 добровольца без сопутствующих аутоиммунных, острых и хронических заболеваний.
Также были проанализированы истории болезни и материалы аутопсий 31 случая ХВГ С и В за 20122018 гг. Критериями включения в исследование здесь было наступление смерти от осложнений основного заболевания или от ургентных состояний. Возраст умерших колебался от 25 до 72 лет (средний возраст - 54,1 года). В контрольную группу для этого контингента наблюдений были взяты материалы судебно-медицинских аутопсий 16 человек без инфекционных заболеваний, сопоставимых по полу и возрасту, и погибших от черепно-мозговых травм. Субстратом для анализа служили образцы периферической крови, полученные от живых и умерших пациентов, а также ткань печени, взятая на аутопсии.
Оценку степени повреждения ДНК проводили методом ДНК-комет в щелочной среде [6, 15]. Для этого 50 мкл исследуемых образцов (отмытые лимфоциты, взвесь клеток печени) смешивали с 500 мкл 1 % раствора легкоплавкой агарозы (Sigma), приготовленной
на фосфатно-солевом буфере при температуре 37 °C, до финальной концентрации 104 клеток/мл. Затем 60 мкл клеточной суспензии наносили на срезы, предварительно покрытые нормоплавкой агарозой (Sigma), и накрывали покровными стеклами. Срезы для застывания агарозы хранили 5 мин. при температуре 4 °C. После затвердевания покровные стекла снимали, и препараты помещали в холодный (4 °C) лизирующий буфер (10 мМ Tris-HCl, pH 10, 2,5 мМ NaCl, 100 мМ EDTA-Na2, 1 % Triton X-100, 10 % ДМСО) на час при 4 °C. По окончании лизиса препараты переносили в камеру для электрофореза, содержащую щелочной буфер (300 мМ NaOH, 1мМ EDTA-Na2) на 40 мин. Далее проводили электрофорез при напряжении 20 В и силе тока 300 мА в течение 25 мин. Срезы после электрофореза обрабатывали трижды по 5 мин. нейтральным буфером (0,4 М Tris-HCl, pH 7,5), затем дегидратировали метанолом и красили раствором бромида этидия (2 мкг/мл). Препараты ДНК просматривали на флюоресцентном микроскопе при увеличении в 200 крат. Полученные изображения анализировали с помощью программы CometScore. Просматривали не менее 100 клеток в каждом препарате.
Описанная модификация метода позволяла оценить количество одно- и двунитевых разрывов ДНК в ядросодержащих клетках. При ее использовании представлялось возможным классифицировать и визуально подсчитать клетки, погибшие путем апоптоза и некроза. Для оценки степени повреждения ДНК применяли показатель содержания ДНК в хвосте комет. Также регистрировали количество комет с повреждениями ДНК более 50 %, известные в литературе под названием «апоптотические ДНК-кометы». Признаком некроза считали широкие рыхло-диффузные ДНК-кометы неправильной формы.
Определение уровней 8-гидрокси-2-дезоксигуано-зина и 8-нитрогуанина осуществляли на образцах сыворотки и гомогенатах с помощью наборов для иммуно-ферментного анализа: Highly Sensitive 8-OHdG Check ELISA (Fukuroi, Shizuoka, Japan) и Nitrosative DNA/ RNA Damage ELISA Kit, 8-Nitroguanine Quantitation (Cell Biolabs, Inc.).
Для анализа общей антиоксидантной активности (ОАА) в предварительно нагретую и заполненную 0,1М фосфатным буфером (рН 7, 37 °C) кварцевую кювету вносили 90 мкл раствора, содержащего 5 ммоль 2,2'-азинобис-3-этилбензотиазолин-6-сульфоната, и 10 мкл исследуемого образца (сыворотка, гомоге-нат). После этого в кювету быстро добавляли 300 мкл раствора, содержащего 200 ммоль 2,2'-азо-бис(2-ами-динпропана) и, быстро встряхнув содержимое, ставили кювету в спектрофотометр (Shimadzu AA-6800) с термостатом (37 °C). Измеряли время, в течение которого оптическая плотность оставалась в пределах ±10 (lag-time) в режиме абсорбции при длине волны 414 нм. Результаты пересчитывали на единицы ОАА, идентичные параметрам для тролокса (в ммоль/л).
Концентрацию восстановленного глутатиона измеряли в образцах (сыворотка, гомогенат) на спектрофотометре Shimadzu UV-1650PC по методу Sedlak and Lindsay, в котором реактив Эллмана (5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойная кислота) реагирует с сульф-гидрильными группами цистеина, образуя 2-нитро-5-меркаптобензойную кислоту с максимальной адсорбцией при 412 нм.
Индекс пероксидного окисления липидов оценивали по концентрации малонового диальдегида (МДА) и 4-гидрокси-2,3-ноненаля. Для этого 200 мкл образца (сыворотка, гомогенат) смешивали с 650 мкл раствора метанола-ацетонитрила (в соотношении 1 : 3), содержавшего хромогенный агент N-метил^-фенилиндол, и встряхивали. После добавления 150 мкмоль 15,4 М метансульфоновой кислоты инкубировали 40 мин. при температуре 45 °C. Реакция между комплексом «малоновый диальдегид + 4-гидрокси-2,3-ноненаль» и N-ме-тил-2-фенилиндолом давала стабильный хромофор, который подвергали спектрофотометрически в режиме абсорбции при длине волны 586 нм, используя 10 ммоль раствор 4-гидрокси-2,3-ноненаля в качестве стандарта. Концентрация 4-гидрокси-2,3-ноненаля равнялась разнице межу общим комплексом продуктов перекисного окисления липидов и малоновым де-альдегидом. Содержание белка в образцах определяли по методу Лоури.
Морфологическая оценка степени фиброза печени у умерших проводилась по стандартным методикам, принятым в патологической анатомии. Из заключенных в парафиновые блоки образцов готовили срезы толщиной 3-4 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином для обзорной микроскопии. Для оценки степени фиброза применялась окраска по ван Гизону. Для определения активности воспалительного процесса и выраженности фиброза печени использовалась полуколичественная шкала METAVIR.
По всем показателям крови, а также возрасту и полу пациентов были рассчитаны описательные статистические характеристики, в т.ч. средние арифметические (M) и их стандартные отклонения (s). Для тестирования статистической значимости различий между средними всех количественных показателей использовали тест Манна-Уитни для каждой пары групп, и полученные уровни значимости корректировали на множественность сравнений с помощью метода Холма. Также было проведено сравнение средних значений показателей крови и печени по следующим индикаторам: ОАА, 8-нитрогу-анин, 8-гидрокси-2-дезоксигуанозин, восстановленный глутатион, 4-гидрокси-2,3-ноненаль и МДА. Для определения статистической значимости различий использовался тест знаков Вилкоксона с оценкой точных значений p-values. На ящичковых диаграммах Тьюки (рис. 1, 2, 4-8) отражены интерквартильная широта («ящик»), медиана (горизонтальная линия) и средние величины («звездочки»). Т-образные линии демонстрируют межквартиль-ный размах, кружки - статистические выбросы.
Результаты исследования
ОАА в группе пациентов с ХВГ С (Б3-4) существенно отличалась от контроля и группы ХВГ С (Б1-2). В то же время этот показатель в группе ХВГ В (Б3-4) также отличался от контроля. То есть можно допустить, что значения данного показателя связаны со стадией фи-
3,5 2,5 2,5
I 2,0 1,5
О
1,0 0,5
К I II III IV V VI
Рис. 1. ОАА сыворотки крови в зависимости от типа гепатита
и степени фиброза: К - контроль, I - ХВГ В (¥0), II - ХВГ В (¥1-2), III - ХВГ В (¥3-4), IV - ХВГ С (¥0), V - ХВГ С (¥1-2), VI - ХВГ С (¥3-4).
броза, но не связаны с типом гепатита. Можно предположить, что изменения здесь наступают еще на стадии Б1-2 при ХВГ В, и на стадии Б3-4 при ХВГ С (рис. 1).
Также обнаружено, что по следующим показателям есть значимые различия между группами пациентов с одинаковой стадией фиброза, но разными типами гепатита: доля ДНК в хвосте комет лимфоцитов для всех стадий фиброза (рис. 2, 3), содержание в сыворотке крови 8-нитрогуанина (рис. 4), 8-гидрокси-2-де-зоксигуанозина (рис. 5), восстановленного глутатиона (рис. 6), МДА - только для степени Б3-4 (рис. 7) и 4-ги-дрокси-2,3-ноненаля - только для степени Б1-2 (рис. 8). То есть значения этих показателей были связаны не только с наличием гепатита и стадией фиброза, но и с типом гепатита. Из них по 8-гидрокси-2-дезокси-гуанозину и восстановленному глутатиону изменения в группе пациентов с ХВГ С наступали, начиная с Б0, а в группе пациентов с ХВГ В - с Б1-2. По остальным показателям из данной категории изменения при гепатитах регистрировались уже со стадии Б0.
Характеризуя течение ХВГ В, следует заметить, что внутри групп пациентов с различными стадиями фиброза соотносятся следующие показатели (по остальным связи со стадией не обнаружено): доля
35 30
§ 25 §
§
К I II III IV V VI
Рис. 2. Доля ДНК в хвосте комет лимфоцитов в зависимости от типа гепатита и степени фиброза: К - контроль, I - ХВГ В (¥0), II - ХВГ В (¥1-2), III - ХВГ В (¥3-4), IV - ХВГ С (¥0), V - ХВГ С (¥1-2), VI - ХВГ С (¥3-4).
1,0
0,8
0,6
§
0,4
0,2
К IV
К I II III IV V VI
Рис. 4. Содержание 8-нитрогуанина в сыворотке крови в зависимости от типа гепатита и степени фиброза:
- контроль, I - ХВГ В (¥0), II - ХВГ В (¥1-2), III - ХВГ В (¥3-4),
- ХВГ С (¥0), V - ХВГ С (¥1-2), VI - ХВГ С (¥3-4).
Рис. 3. Микрофотографии ДНК-комет:
а - ДНК-комета, соответствующая апоптотической клетке (стрелка) у пациента с ХВГ С (¥3); б - ДНК-комета у пациента с ХВГ В (стрелка 1 - комета с 44,43 % ДНК в хвосте, стрелка 2 - комета с 2,78 % ДНК). Окр. этидиума бромидом, х200.
20 -
15
0
1
10
К I II III IV V VI
Рис. 5. Содержание 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина в сыворотке крови в зависимости от типа гепатита и степени фиброза: К - контроль, I - ХВГ В (¥0), II - ХВГ В (¥1-2), III - ХВГ В (¥3-4), IV - ХВГ С (¥0), V - ХВГ С (¥1-2), VI - ХВГ С (¥3-4).
5
66
0,7
К I II III IV V VI
Рис. 6. Содержание восстановленного глутатиона в сыворотке
крови в зависимости от типа гепатита и степени фиброза: К - контроль, I - ХВГ В (¥0), II - ХВГ В (¥1-2), III - ХВГ В (¥3-4), IV - ХВГ С (¥0), V - ХВГ С (¥1-2), VI - ХВГ С (¥3-4).
0,6
0,5
0,4
§
0,3
0,2
X
К I II III IV V VI
Рис. 7. Содержание МДА в сыворотке крови в зависимости от типа гепатита и степени фиброза: К - контроль, I - ХВГ В (¥0), II - ХВГ В (¥1-2), III - ХВГ В (¥3-4), IV - ХВГ С (¥0), V - ХВГ С (¥1-2), VI - ХВГ С (¥3-4).
ДНК в хвосте комет лимфоцитов (значимы различия между всеми парами стадий фиброза), содержание в сыворотке крови МДА и 4-гидрокси-2,3-ноненаля (существенные изменения регистрировались при Б3-4: значимые отличия от Б0 и Б1-2, при том, что различия между Б0 и Б1-2 оказались несущественными).
При ХВГ С связаны со стадией фиброза были уровни 8-нитрогуанина, 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина и доли ДНК в хвосте комет лимфоцитов (по остальным показателям подобных связей не обнаружено). Существенные изменения ОАА и уровней восстановленного глутатиона, МДА и 4-гидрокси-2,3-ноненаля в сыворотке крови регистировались на стадии Б3-4: значимые отличия от Б0 и Б1-2, при том, что различия между Б0 и Б1-2 оказались несущественными.
По умершим был проведен дескриптивный анализ, аналогичный тому, результаты которого представлены выше для живых пациентов. По аналогии, итоги тестов на сравнение средних значений показателей между различными группами умерших можно, кроме возраста, условно разделить на несколько категорий. При этом из-за малого размера выборки в качестве порогового уровня значимости использовано значение в 10 % вместо 5 % (табл. 1, 2).
Значимых различий в зависимости ни от типа гепатита для одинаковой степени фиброза печени, ни от степени фиброза для одинаковых типов гепатита по содержанию в крови 4-гидрокси-2,3-ноненаля не обнаружено. По данному показателю были значимые различия между контролем и группами с ХВГ В (Б3-4) и ХВГ С (Б3-4). Также обнаружены значимые различия в степени фиброза при одинаковых типах гепатита, но не между группами с ХВГ В и ХВГ С при одинаковой степени фиброза (табл. 1, 2):
♦ для ОАА в сыворотке крови при ХВГ С - между Б3-4 и Б0, и контролем;
♦ для восстановленого глутатиона в сыворотке крови при ХВГ С - между Б3-4 и Б0;
♦ для МДА в сыворотке крови при обоих типах гепатита - между Б3-4 и Б0, и контролем;
К I II III IV V VI
Рис. 8. Содержание 4-гидрокси-2,3-ноненаля в сыворотке крови в зависимости от типа гепатита и степени фиброза: К - контроль, I - ХВГ В (¥0), II - ХВГ В (¥1-2), III - ХВГ В (¥3-4), IV - ХВГ С (¥0), V - ХВГ С (¥1-2), VI - ХВГ С (¥3-4).
♦ для МДА в ткани печени при ХВГ В - между Б3-4 и остальными группами, включая контроль, при ХВГ С - между Б3-4 и Б0, и контролем;
♦ для 8-нитргуанана в ткани печени при ХВГ С - между Б3-4 и остальными группами, включая контроль, при ХВГ С - между Б3-4 и Б0, и Б1-2;
♦ для доли ДНК в хвосте комет гепатоцитов при обоих типах гепатита - между всеми парами стадий фиброза печени, а также в парах отдельных стадий с контролем.
То есть можно предположить, что эти показатели связаны со стадией фиброза, но не сопряжены с типом гепатита. Для показателей, по которым зарегистрированы статистически значимые различия между контролем и группами с Б0 (МДА в крови и ткани печень, % ДНК в хвосте комет гепатоцитов (только при ХВГ В), можно предположить, что изменения наступают еще на стадии Б0, то есть связаны с наличием гепатита как такового.
Заметим, что по следующим показателям обнаружены значимые различия между группами пациентов с одинаковой стадией фиброза, но разными типами гепатита (табл. 1, 2):
Таблица 1
Значимость различий в средних показателях между группами умерших пациентов в зависимости от типа гепатита и степени фиброза в сыворотке крови
Показатель" Группа M s р-уа1ие тестов Манна-Уитни с коррекцией Холма
Контроль ХВГ В ХВГ С
F0 F1-2 F3-4 F0 F1-2
ОАА, ммоль/л Контроль 2,2 0,8
ХВГ В F0 1,5 0,3 0,374
F1-2 2,0 0,3 1 0,77
F3-4 1,5 0,6 0,432 1 1
ХВГ С F0 2,0 0,1 1 0,114 1 0,77
F1-2 1,6 0,6 0,705 1 1 1 0,936
F3-4 1,2 0,4 0,063б 1 0,126 1 0,08б 1
я и о £ 00 Контроль 0,1 0,0
ХВГ В F0 0,2 0,0 <0,00б
F1-2 0,3 0,1 <0,001б 0,125
F3-4 0,4 0,0 <0,001б 0,048б 0,048б
ХВГ С F0 0,2 0,0 <0,001б 0,519 0,256 0,048б
F1-2 0,4 0,1 <0,001б 0,08б 0,519 0,519 0,096б
F3-4 0,6 0,1 <0,001б 0,045б 0,045б 0,048б 0,045б 0,084б
8-OHdG, нг/мл Контроль 6,2 0,9
ХВГ В F0 7,7 0,4 0,016б
F1-2 8,1 0,4 <0,001б 0,165
F3-4 9,1 0,6 <0,001б 0,048б 0,08б
ХВГ С F0 11,1 1,2 <0,001б 0,048б 0,048б 0,06б
F1-2 12,4 0,9 <0,001б 0,048б 0,048б 0,048б 0,165
F3-4 13,6 1,7 <0,001б 0,045б 0,045б 0,045б 0,088б 0,253
GSH, мкмоль/л Контроль 2,5 0,7
ХВГ В F0 2,4 0,1 1
F1-2 2,4 0,1 1 1
F3-4 2,1 0,3 0,924 0,555 0,715
ХВГ С F0 2,4 0,2 1 1 1 0,555
F1-2 2,3 0,2 1 1 1 1 1
F3-4 1,8 0,2 0,187 0,063б 0,063б 0,288 0,063б 0,126
4-HNE, нмоль/мг белка Контроль 0,2 0,0
ХВГ В F0 0,2 0,0 1
F1-2 0,2 0,0 1 1
F3-4 0,3 0,1 0,021б 0,114 0,16
ХВГ С F0 0,2 0,0 1 1 1 0,114
F1-2 0,2 0,0 0,924 0,832 1 0,114 1
F3-4 0,3 0,1 0,06б 0,16 1 1 0,448 1
МДА, нмоль/мг белка Контроль 0,3 0,0
ХВГ В F0 0,4 0,1 0,017б
F1-2 0,5 0,0 <0,001б 0,135
F3-4 0,5 0,0 <0,001б 0,056б 1
ХВГ С F0 0,4 0,1 0,032б 1 0,39 0,18
F1-2 0,5 0,1 <0,001б 0,056б 1 1 0,175
F3-4 0,6 0,1 <0,001б 0,045б 0,11 0,11 0,056б 0,135
%DNAt Контроль 3,8 1,7
ХВГ В F0 5,1 0,8 0,06б
F1-2 7,9 1,6 0,034б 0,05б
F3-4 14,7 3,9 <0,001б 0,048б 0,048б
ХВГ С F0 10,5 2,2 0,018б 0,048б 0,234 0,234
F1-2 15,8 2,1 <0,001б 0,048б 0,048б 0,631 0,048б
F3-4 21,2 1,8 <0,001б 0,048б 0,048б 0,048б 0,048б 0,048б
а 8-К020 - 8-нитрогуанан, 8-ОШО - 8-гидрокси-2-дезоксигуанозин, 08И- восстановленный глутатион, 4-ИКЕ - 4-гидрокси-2,3-ноненаль, %БКЛ1 - доля ДНК-комет в хвосте лимфоцита. б р-уа1ие <10%.
Таблица 2
Значимость различий в средних показателях между группами умерших пациентов в зависимости от типа гепатита и степени фиброза в гомогенате ткани печени
Показательа Группа М 8 р-уа1ие тестов Манна-Уитни с коррекцией Холма
Контроль ХВГ В ХВГ С
Б0 Б1-2 Б3-4 Б0 Б1-2
ОАА, ммоль/л Контроль 19,4 2,0
ХВГ В Б0 12,4 1,8 <0,001б
Б1-2 15,5 1,8 0,018б 0,12
Б3-4 10,6 2,1 <0,001б 0,75 0,06б
ХВГ С Б0 19,5 0,8 1 0,056б 0,056б 0,056б
Б1-2 14,0 2,7 0,018б 1 1 0,468 0,056б
Б3-4 9,7 1,5 <0,001б 0,12 0,048б 1 0,048б 0,09б
я и О 2: 00 Контроль 1,9 0,6
ХВГ В Б0 2,0 0,0 1
Б1-2 2,0 0,1 1 1
Б3-4 2,7 0,3 0,104 0,064б 0,064б
ХВГ С Б0 1,9 0,2 1 1 1 0,064б
Б1-2 2,3 0,2 0,423 0,896 0,624 0,275 0,37
Б3-4 3,6 0,6 <0,001б 0,06б 0,06б 0,264 0,06б 0,06б
8-ОЫаО, нг/мл Контроль 26,1 3,6
ХВГ В Б0 71,6 4,3 <0,001б
Б1-2 74,9 4,8 <0,001б 0,796
Б3-4 80,8 4,1 <0,001б 0,052б 0,545
ХВГ С Б0 51,7 11,9 0,016б 0,052б 0,052б 0,052б
Б1-2 68,4 9,0 <0,001б 0,796 0,796 0,12 0,222
Б3-4 83,7 4,5 <0,001б 0,045б 0,12 0,796 0,045б 0,09б
08Ы, мкмоль/л Контроль 23,5 2,0
ХВГ В Б0 19,4 0,8 0,018б
Б1-2 18,1 1,1 <0,001б 0,385
Б3-4 14,6 1,4 <0,001б 0,06б 0,09б
ХВГ С Б0 22,6 1,9 1 0,06б 0,06б 0,06б
Б1-2 16,8 2,5 0,018б 0,385 1 0,545 0,06б
Б3-4 15,3 2,7 <0,001б 0,06б 0,256 1 0,048б 1
4-ЫЫЕ, нмоль/мг белка Контроль 4,8 0,4
ХВГ В Б0 6,1 0,5 0,018б
Б1-2 7,2 0,6 <0,001б 0,15
Б3-4 10,1 2,3 <0,001б 0,056б 0,056б
ХВГ С Б0 4,7 0,8 1 0,09б 0,056б 0,056б
Б1-2 6,6 1,3 0,105 0,8 1 0,09б 0,275
Б3-4 10,6 2,5 <0,001б 0,051б 0,051б 1 0,051б 0,056б
МДА, нмоль/мг белка Контроль 20,7 6,6
ХВГ В Б0 54,2 4,7 <0,001б
Б1-2 58,0 7,1 <0,001б 1
Б3-4 70,7 6,8 <0,001б 0,052б 0,135
ХВГ С Б0 48,4 2,2 <0,001б 0,259 0,259 0,052б
Б1-2 55,2 4,9 <0,001б 1 1 0,052б 0,259
Б3-4 67,9 4,5 <0,001б 0,045б 0,135 1 0,045б 0,052б
%ПЫЛ1 Контроль 19,9 6,6
ХВГ В Б0 27,3 1,7 0,09б
Б1-2 34,0 1,9 0,019б 0,052б
Б3-4 42,6 5,7 <0,001б 0,052б 0,052б
ХВГ С Б0 23,2 3,9 0,37 0,234 0,052б 0,052б
Б1-2 33,1 2,9 0,019б 0,06б 0,522 0,052б 0,052б
Б3-4 48,9 2,4 <0,001б 0,051б 0,051б 0,184 0,051б 0,051б
а 8-КО2С - 8-нитрогуанан, 8-ОШО - 8-гидрокси-2-дезоксигуанозин, С8Ы- восстановленный глутатион, 4-ЫКЕ - 4-гидрокси-2,3-ноненаль, %БКЛ1 - доля ДНК-комет в хвосте гепатоцита. б р-уа1ие <10%.
♦ для 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина сыворотки крови и для % ДНК в хвосте комет лимфоцитов (для всех значений Б);
♦ для 8-нитргуанана сыворотки крови (только для Б3-4);
♦ для ОАА, 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина, восстановленного глутатиона и 4-гидрокси-2,3-ноненаля ткани печени (только для Б0).
То есть значения этих показателей, возможно, были соотнесены не только с наличием ХВГ и стадией фиброза, но и с типом ХВГ.
В целом, внутри группы пациентов с ХВГ В со стадией фиброза оказались связаны следующие показатели (табл. 1, 2):
♦ 8-нитрогуанан и 8-гидрокси-2-дезоксигуанозин сыворотки крови, восстановленных глутатион и 4-ги-дрокси-2,3-ноненаль ткани печени, % ДНК в хвосте комет лимфоцитов и гепатоцитов (значимы различия между всеми парами Б);
♦ 4-гидрокси-2,3-ноненаль сыворотки крови, 8-ни-трогуанан и МДА ткани печени (значимы только различия между Б3-4 и Б0, и Б1-2);
♦ МДА сыворотки крови (значимы только различия между Б0 и Б1-2, и Б3-4);
♦ ОАА ткани печени (значимы различия между Б0 и Б1-2, а также между Б3-4 и Б1-2);
♦ 8-нитрогуанан ткани печени (значимы различия только между Б3-4 и Б0).
В целом, внутри группы пациентов с ХВГ С связаны со стадией фиброза были следующие показатели (табл. 1, 2):
♦ уровни 8-нитрогуанана и МДА сыворотки крови, ОАА, 8-нитрогуанана, 8-гидрокси-2-дезоксигуано-зина, 4-гидрокси-2,3-ноненаля и МДА ткани печени, % ДНК в хвостах комет лимфоцитов и гепатоцитов (значимы различия между всеми парами Б);
♦ уровень восстановленного глутатиона сыворотки крови (значимы различия между Б3-4 и Б0, и Б1-2);
♦ уровень восстановленного глутатиона ткани печени (значимы различия между Б0 и Б1-2, и Б3-4);
♦ уровни ОАА, 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина и 4-ги-дрокси-2,3-ноненаля сыворотки крови (значимы различия между Б3-4 и Б0).
Заметим, что различия между показателями крови и показателями ткани печени абсолютно по всем параметрам, как в целом по выборке умерших, так и по отдельным ее подгруппам, статистически значимы.
Между живыми и умершими пациентами было проведено сравнение средних значений по следующим показателям сыворотки крови: ОАА, 8-нитрогуанан, 8-гидрокси-2-дезоксигуанозин, восстановленный глу-татион, 4-гидрокси-2,3-ноненаль, МДА и % ДНК в хвосте комет. В целом, значимые различия между живыми и умершими обнаруживались только:
♦ по 8-гидрокси-2-дезоксигуанозину между контролями и пациентами с ХВГ С с Б0 или Б1-2;
♦ по восстановленому глутатиону среди всех пациентов, а также среди пациентов контрольной группы, пациентов с ХВГ В (в том числе со стадией Б0 или
Б1-2), а также среди пациентов с ХВГ С и стадией Б1-2 или Б3-4;
♦ по 4-гидрокси-2,3-ноненалю среди всех пациентов, а также среди пациентов контрольной группы, пациентов с ХВГ В (в том числе со стадией Б3-4), а также пациентов с ХВГ С со стадией Б1-2;
♦ по МДА среди пациентов с ХВГ В (в том числе со стадией Б0 или Б3-4) или с ХВГ С (в том числе со стадией Б3-4).
Следует обратить внимание на то, что эти различия зафиксированы при том, что группы умерших и живых лиц существенно различались по возрасту. Если уровень перечисленных показателей связан с возрастом пациента, тогда указанные различия могут, по крайней мере отчасти, объясняться разницей в возрасте, а не статусом индивида (жив/мертв).
Обсуждение полученных данных
Характеризуя состояние ДНК, как в целом макроорганизма, так и отдельно лимфоцитов следует заметить несколько важных моментов. Во-первых, непосредственно степень повреждения ДНК лимфоцитов периферической крови достоверно отличалась от контрольных цифр даже при отсутствии изменений в ткани печени. Причем на аналогичных стадиях фиброза параметры между типами гепатита были разными. Наименьший % ДНК в хвосте комет имели пациенты с ХВГ В - 5,1 (против 12,7 % при ХВГ С). Также следует заметить, что с прогрессированием заболевания степень деструкции ДНК в этих двух группах не выравнивалась. Значения, характеризующие стадию цирроза печени при ХВГ В, практически сопоставимы со стадией Б0 при ХВГ С. Из чего следует вывод о большей генотоксичности вируса гепатита С [1, 3].
Во-вторых, динамика изменений уровня маркеров оксидативного и нитрозативного повреждения ДНК -8-гидрокси-2-дезоксигуанозина и 8-нитрогуанана -в целом соответствует таковой в отношении степени деструкции ДНК [2]. Таким образом, мы можем говорить о значимом вкладе в деструкцию процессов окси-дативного и нитрозативного стрессов [11, 14] (причем эти изменения начинались до формирования фиброза у пациентов обеих групп).
В-третьих, буферная емкость антиоксидантной системы организма в ходе естественного течения вирусных гепатитов истощается. Об этом свидетельствует отрицательная динамика интегративного показателя -ОАА, включающего в себя как низкомолекулярные антиоксиданты, так и высокофункциональные белковые молекулы. При ХВГ С, очевидно в силу большей генотоксичности вируса и индукции более выраженного оксидативного и нитрозативного стресса, анти-оксиданты истощаются быстрее. Такая же тенденция характерна и для восстановленного глутатиона [13, 14].
Несмотря на это, другой показатель - МДА, косвенно характеризующий процесс перикисного окисления ли-пидов, имел несколько иную динамику. Существенное увеличение его концентрации было характерно для
пациентов с ХВГ В, причем межгрупповые отличия с ХВГ С здесь оказались статистически значимы. Следует заметить, что оксидативный стресс помимо окисления липидов включает в себя окисление и нуклеиновых кислот, и углеводов, и отдельных компонентов клетки.
В-четвертых, оксидативный и нитрозативный стресс вызывает в клетке значимые нарушения целостности многих мембранных органелл. Так, при окислении специфического липида мембран митохондрий -кардиолипина - обнаруживается 4-гидрокси-2,3-ноне-наль. Динамика его накопления в крови при вирусных гепатитах имеет тенденцию к постепенному увеличению по мере усиления фиброза. Причем межгрупповые отличия на одинаковых стадиях фиброза при разных типах гепатита оказываются недостоверными [13].
Изменения в ткани печени при хронических вирусных гепатитах в целом сопоставимы с таковыми в сыворотке крови по всем показателям. Но ввиду большей концентрации ферментов и продуктов окисления непосредственно внутри клеток значения каждого из параметров закономерно в несколько раз выше таковых в сыворотке крови. Литература / References
1. Кропотов А.В., Челомин В.П., Слободскова В.В. [и др.]. Оценка генотоксичности тетрахлорметана и защитного действия силибинина и хаурантина с помощью метода ДНК-комет в печени крыс // Тихоокеанский мед. журнал. 2013. № 2. С. 63-66. Kropotov A.V., Chelomin V.P., Slobodskova V.V. [et al.]. Estimating carbon tetrachloride toxicity and protective action of silibinin and haurantin using DNA-comet assay in rat liver // Pacific Medical Journal. 2013. No. 2. P. 63-66.
2. Михайлов А.О., Попов А.Ф., Иванова Н.С. [и др.]. Деструкция, окисление ДНК и липидов мембран митохондрий при хронических вирусных гепатитах С, В // Инфекционные болезни. 2018. Т. 16, № 1. С. 15-21.
Mikhaylov A.O., Popov A.F., Ivanova N.S. [et al.]. Destruction, oxidation ofDNA and lipids ofmitochondrial membranes in chronic viral hepatitis C, B // Infectious Diseases. 2018. Vol. 16, No. 1. P. 15-21.
3. Михайлов А.О., Попов А.Ф., Иванова Н.С., Симакова А.И. Исследование повреждений ДНК лимфоцитов у больных хроническим вирусным гепатитом в методом ДНК-комет // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2017. Т. 22, № 2. С. 64-68. Mikhaylov A.O., Popov A.F., Ivanova N.S., Simakova A.I. The investigation of DNA damage in lymphocytes by comet assay in chronic viral hepatitis B patients // Epidemiology and Infectious Diseases. 2017. Vol. 22, No. 2. P. 64-68.
4. Михайлов А.О., Попов А.Ф., Иванова Н.С., Симакова А.И. Повреждения ДНК лимфоцитов при хронических вирусных гепатитах В, С // Журнал инфектологии. 2017. Т. 9, № 2. С. 29-36.
Mikhaylov A.O., Popov A.F., Ivanova N.S., Simakova A.I. DNA damage in lymphocytes in chronic viral hepatitis B, C // Journal Infectology. 2017. Vol. 9, No. 2. P. 29-36.
5. Попов А.Ф., Михайлов А.О., Иванова Н.С., Симакова А.И. Метод ДНК-комет в диагностике фиброза печени при хроническом вирусном гепатите С // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2015. Т. 20, № 2. С. 29-33.
Popov A.F., Mikhaylov A.O., Ivanova N.S., Simakova A.I. Method of DNA-comet assay in the diagnosis of liver fibrosis in patients with chronic viral hepatitis C // Epidemiology and Infectious Diseases. 2015. Vol. 20, No. 2. P. 29-33.
6. Чернигина И.А., Щербатюк Т.Г. Новая версия метода ДНК-комет // Современные технологии в медицине. 2016. Т. 8, № 1. С. 20-27.
Chernigina I.A., Shcherbatyuk T.G. A new version of comet assay // Modern Technologies in Medicine. 2016. Vol. 8, No. 1. P. 20-27.
7. Bolukbas C., Bolukbas F.F., Kocyigit A. [et al.]. Relationship between levels of DNA damage in lymphocytes and histopatho-logical severity of chronic hepatitis C and various clinical forms of hepatitis B // J. Gastroenterol. Hepatol. 2006. Vol. 21, No. 3. P. 610-616.
8. Cao L., Quan Xi-B., Zeng W.-J. [et al.]. Mechanism ofhepatocyte apoptosis // J. Cell Death. 2016. No. 9. P. 19-29.
9. Grossi S., Sumberaz A., Gosmar M. [et al.]. DNA damage in peripheral blood lymphocytes of patients with cirrhosis related to alcohol abuse or to hepatitis B and C viruses // Eur. J. Gastro-enterol. Hepatol. 2008. Vo. 20, No. 1. P. 22-25.
10. Ivanov A.I., Valuev-Elisston VT., Tyurina D.A. [et al.]. Oxidative stress, a trigger of hepatitis C and B virus-induced liver carcinogenesis // Oncotarget. 2017. Vol. 8, No. 3. P. 3895-3932.
11. Iwakiri Ya. Nitric oxide in liver fibrosis: The role of inducible nitric oxide synthase // Clin. Mol. Hepatol. 2015. Vol. 21, No. 4. P. 319-325.
12. Iwakiri Ya., Kim M.Y. Nitric oxide in liver diseases // Trends Pharmacol. Sci. 2015. Vol. 36, No. 8. P. 524-536.
13. Kawanishi S., Ohnishi S., Ma N. [et al.]. Nitrative and oxidative DNA damage in infection-related carcinogenesis in relation to cancer stem cells // Genes and Environment. 2016. doi: 10.1186/ s41021-016-0070-8 (date of access: 03.08.2018).
14. Li P., Ramm G.A., Macdonald G.A. Value ofthe 8-oxodG/dG ratio in chronic liver inflammation of patients with hepatocellular carcinoma // Redox Biology. 2016. doi: 10.1016/j.redox.2016.02.003 (date of access: 03.08.2018).
15. Olive P.L., Banath J.P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells // Nature Protocols. 2006. Vol. 1, No. 1. P. 23-29.
Поступила в редакцию 19.09.2018.
OXIDATIVE AND NITROSATIVE DNA DAMAGE IN HEPATIC FIBROSIS PATHOGENESIS IN CHRONIC VIRAL HEPATITIS
А.О. Mikhaylov1, A.F. Popov2, V.A. Ivanis2, E.V. Khamueva1, N.S. Ivanova2, A.I. Simakova2
1 Regional Clinical Hospital No. 2 (55 Russkaya St. Vladivostok 690105 Russian Federation), 2 Pacific State Medical University (2 Os-tryakova Ave. Vladivostok 690002 Russian Federation) Objective. Despite a large number of studies on chronic viral hepatitis , many issues related to its pathogenesis remain unsettled. First of all, it refers to pathogenic effects of the viruses themselves, the nature and patterns of the host organism's response to the pathogen, the formation of liver cirrhosis, hepatocellular carcinoma, and several other aspects.
Methods. In the serum of 150 patients with chronic viral hepatitis B and C and in the serum and in the liver homogenates taken after 31 autopsies of persons who died of cirrhosis in the outcome of chronic viral hepatitis, the total antioxidant activity was studied, the content of 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, 8-nitroguanine , reduced glutathione, malonic dialdehyde and 4-hydroxy-2,3-none-nal. Also, the degree of DNA destruction in peripheral blood lymphocytes and hepatocytes was analyzed using the comet assay. Results. It has been established that DNA destruction of hepatocytes and peripheral blood lymphocytes is one of the leading components of the formation of hepatic fibrosis in chronic viral hepatitis B and C and can be considered as its pathognomonic marker. One of the leading mechanisms of this process can be called the enhancement of oxidative and nitrosative processes. Conclusions. There is a direct link between DNA damage and the severity of sclerotic changes in the liver. Oxidative and nitrosa-tive stress in hepatocytes and lymphocytes causes significant violations of the integrity of membrane organelles. Biochemical changes in the liver tissue during chronic viral hepatitis B and C are generally comparable to those in the serum in all respects, which makes them promising in terms of developing algorithms for diagnosing hepatic fibrosis.
Keywords: DNA comet assay, oxidative and nitrosative stress, hepatocytes, lymphocytes
Pacific Medical Journal, 2018, No. 4, p. 63-70.
