CC BY
2УДК 577.29:616.69-008.6:616.697
Н. И. Рябоконь, И. Д. Кужель
ОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ ДНК СПЕРМАТОЗОИДОВ У ПАЦИЕНТОВ С НОРМО- И ПАТОЗООСПЕРМИЕЙ
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: n.ryabokon@igc.by
Проведено пилотное исследование окислительных повреждений ДНК в сперматозоидах мужчин репродуктивного возраста с нормозооспермией и патозооспермией (диагнозы астено-, астенотерато-, олиго- и олиго-астенозооспермия). Для проведения исследования адаптирована энзим-модифицированная щелочная версия метода ДНК-комет, включающая обработку сперматозоидов гликозилазой hOGGl. Этот фермент специфически распознает наиболее частые окислительные повреждения ДНК — окисленные формы гуанина: 7,8-диги-дро-8-оксогуанин (8-оксогуанин) и 2,6-диамино-4-гидрокси-5^метилформамидопиримидин (Fapy-гуанин). Установлено существенно повышенное количество окислительных повреждений ДНК в группе с патозооспер-мией по сравнению с нормозооспермией. Показана обратная корреляция между количеством окислительных повреждений ДНК и общей подвижностью сперматозоидов, что указывает на окислительный стресс как на общую причину возникновения исследуемых повреждений ДНК и снижения подвижности сперматозоидов.
Ключевые слова: нормозооспермия, патозооспермия, окислительные повреждения ДНК сперматозоидов, 8-оксогуанин, Fapy-гуанин, энзим-модифицированная щелочная версия метода ДНК-комет, hOGGl.
Введение
Согласно данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), по состоянию на начало 2023 г. в среднем около 17,5% взрослого населения (приблизительно каждый шестой человек репродуктивного возраста) имеет бесплодие [1], что делает это заболевание серьезной проблемой здоровья во всем мире [2]. При этом около 50% случаев бесплодия в браке частично или полностью обусловлены мужским фактором [2, 3]. Ситуация усложняется ухудшением репродуктивных качеств спермы мужчин, а именно снижением концентрации и общего количества сперматозоидов в сперме, которое наблюдается с 1970-х гг. [4]. Среди основных причин мужского бесплодия отмечают заболевания общего характера, варикоцеле, гормональные отклонения, генетические нарушения, нездоровый образ жизни и др. Однако в 30-50% случаев точная этиология мужского бесплодия остается неопределенной, и заболевание классифицируется как идиопатическое [5]. Поэтому поиск причин мужского бесплодия имеет актуальный характер.
В настоящее время накоплено неопровер-
жимое количество данных о том, что окислительный стресс играет значимую роль в формировании мужского бесплодия. Клетки человека постоянно находятся под окислительным воздействием внутреннего и внешнего происхождения. Основными источниками активных форм кислорода (АФК) и азота (АФА) в сперме являются лейкоциты и незрелые сперматозоиды. Однако важно отметить, что АФК и АФА в умеренных концентрациях необходимы для нормального созревания и функционирования половых клеток, а потому генерируются их окислительной системой и поддерживаются на нормальном физиологическом уровне их антиоксидантной системой. Дисбаланс в работе этих двух систем с преобладанием АФК и АФА может приводить к окислительному стрессу, повреждению ДНК и патозооспермии [3, 5-7]. Отмечается, что 30-80% мужчин с бесплодием имеют повышенные концентрации АФК, а у 84% пациентов с идиопатическим бесплодием обнаружен дисбаланс между АФК и количеством антиоксидантов в сперме в сторону преобладания АФК. Международными эксперта-
ми предлагается ввести новый термин MOSI (male oxidative stress infertility) для обозначения мужского бесплодия, связанного с окислительным стрессом, и рекомендовать пациентам с диагнозом идиопатическое бесплодие проведение скрининга на окислительно-восстановительный потенциал спермы [5].
ДНК сперматозоидов имеет высокую степень упаковки хроматина по сравнению с соматическими клетками, что частично защищает ее от повреждений, которые могут быть индуцированы АФК и АФА. В то же время считается, что ограниченное количество цитоплазмы с элементами системы антиок-сидантной защиты делают сперматозоиды наиболее чувствительными к окислительному стрессу клетками у многоклеточных организмов [8]. Более того, предполагается, что окислительный стресс является основным фактором, повреждающим ДНК сперматозоидов. Имеются отрывочные данные, свидетельствующие о высоких уровнях окислительных повреждений в сперматозоидах человека и отмечается необходимость их изучения у мужчин с пониженной фертильностью [3, 8]. Кроме того, разработанные протоколы исследования окислительных повреждений ДНК сперматозоидов требуют их оптимизации и более широкого апробирования.
Поэтому целью нашей работы был сравнительный анализ окислительных повреждений ДНК в сперматозоидах пациентов с нормо-и патозооспермией для оценки их диагностической значимости в отношении мужской фертильности. В задачи исследования входила адаптация энзим-модифицированной щелочной версии метода ДНК-комет на сперматозоидах мужчин с использованием фермента hOGGl (human 8-oxoguanine DNA glycosylase), специфически распознающей и вырезающей из ДНК окисленные формы гуанина: 7,8-дигидро-8-оксогуанин (8-оксогуанин, или 8-oxoGuo) и 2,6-диамино-4-гидрокси-5№ме-тилформамидопиримидин (Fapy-гуанин, или Fapy-Gua) [9, 10]. Энзим-модифицирован-ный метод ДНК-комет широко используется в биомониторинге с 1990-х гг. [10]. Предполагается, что он распознает более реалистичные уровни окислительных повреждений ДНК при меньших финансовых затратах, чем высокоэффективная жидкостная хроматография,
при которой дополнительное окисление ДНК происходит при подготовке к анализу (на этапах выделения, хранения и гидролиза ДНК) [11, 12]. Однако ранее в подавляющем большинстве работ с энзим-модифицированным методом ДНК-комет использовался фермент Fpg (formamidopyrimidine-DNA glycosylase), который, по данным С. С. Smith с соавторами [9], менее специфичен к окислительным повреждениям ДНК, чем hOGG1.
Материалы и методы
Объектами исследований являлись образцы спермы в количестве 35 ед., полученные в 2021 г. из Республиканского банка ДНК человека, животных, растений и микроорганизмов (Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, г. Минск). Сбор и депонирование образцов в банк осуществлены в 2013-2015 гг. при выполнении задания отраслевой научно-технической программы «Здоровая мать — здоровое дитя — сильное государство» (2013-2017 гг.), одобренного этическим комитетом Республиканского научного-практического центра «Мать и дитя» в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. От каждого пациента при сборе образцов получено информированное согласие об участии в научных исследованиях. Образцы спермы собраны пациентами путем мастурбации. Диагнозы поставлены по результатам спермограммы, выполненной с использованием автоматического анализатора SQA-V (Medical Electronic Systems, Israel), и на основании рекомендаций ВОЗ 2010 г. [13]. В исследуемые группы по анкетным данным включены образцы от пациентов белорусской национальности. Группу с нормозооспермией составили образцы от 16 человек (средний возраст 31,1 года), с патозооспермией — от 19 человек (средний возраст 34,5 года). Индивидуальный возраст пациентов в группах находился в диапазоне 25-48 лет. В группе с патозооспермией преобладали образцы от пациентов с диагнозами астенозооспермия (пониженная подвижность сперматозоидов, n = 11). Затем по численности в сторону уменьшения следовали образцы с диагнозами астенотератозооспермия (пониженная подвижность в сочетании с повышенным количеством морфологических аномалий сперматозоидов, n = 4), олигозооспермия (по-
ниженное количество сперматозоидов, n = 2) и олигоастенозооспермия (пониженные количество и подвижность сперматозоидов, n = 2).
Общая фрагментация ДНК сперматозоидов в образцах изучена с применением щелочной версии метода ДНК-комет в соответствии с инструкцией, утвержденной Министерством здравоохранения Республики Беларусь [14]. Метод состоит из следующих этапов, подробно описанных в работе [15]: погружение сперматозоидов в агарозу, лизис клеточных мембран, денатурация и электрофорез ДНК при рН >13, фиксация и анализ препаратов с использованием флуоресцентного микроскопа и визуального способа учета повреждений ДНК [10, 16].
Изучение окислительных повреждений ДНК выполнено с помощью энзим-модифицирован-ной щелочной версии метода ДНК-комет с использованием фермента hOGG1. Поскольку нами не найдено публикаций, описывающих применение данного фермента на сперми-ях мужчин, то при отработке метода за основу взяты работы, проведенные на лейкоцитах периферической крови человека [17], клетках мышиной лимфомы [9] и на незрелых половых клетках (сперматоцитах) мыши [18]. Ферментная обработка препаратов со сперматозоидами мужчин выполнена нами после этапа лизиса и промывки от лизирующего раствора, с использованием hOGG1 производства Abcam (Cambridge, UK) в концентрации 1:1000 буферного раствора (40 mM Hepes, 0,1 M KCl, 0,5 mM Na2EDTA, 0,2 mg/ml BSA pH = 8,0) при 37 °С в течение 30 мин. Одновременно в тех же условиях проводилась инкубация аналогичных препаратов в буферном растворе без фермента. После охлаждения всех препаратов в течение 20 мин в холодильной камере и смывания буфера с hOGG1 (или без фермента) охлажденной дистиллированной водой проведена стандартная денатурация ДНК с последующим электрофорезом, фиксацией и анализом высушенных и окрашенных бромистым этидием препаратов с помощью флуоресцентного микроскопа BX51 (производства Olympus, Japan) при 400-кратном увеличении, фильтре возбуждения на 515-560 nm и барьерном фильтре на 590 nm. Каждый образец спермы проанализирован в 2-3 повтор-ностях. Оценивались средние величины как
нагруженности клеток повреждениями ДНК (уровня фрагментации ДНК в условных единицах — усл. ед.), так и количества клеток с повреждениями ДНК (индекса фрагментации — DFI, DNA fragmentation index, — выраженного в процентах от общего количества проанализированных клеток). Уровни окислительных повреждений ДНК в общем пуле фрагментированной ДНК рассчитывались как разница между результатами исследования клеток, обработанных hOGGl в буферном растворе, и результатами анализа клеток, находившихся под воздействием только буферного раствора [10].
Статистическая обработка данных проведена в пакете прикладных программ Statistica 7.0 (StatSoft, USA). Сравнительный анализ выполнен с использованием непараметрического теста Манна-Уитни (U теста). При этом все значения p <0,05 признавались за статистически значимые.
Результаты исследования
Основные результаты исследования повреждений ДНК в сперматозоидах мужчин при нор-мо- и патозооспермии с использованием двух версий метода ДНК-комет представлены в таблице 1.
Хорошо известно, что используемая нами стандартная щелочная версия метода ДНК-комет позволяет учитывать одно- и двунитевые разрывы ДНК, а также щелочно-лабильные сайты, состоящие главным образом из апури-новых-апиримидиновых сайтов (AP-сайтов) [10]. Все эти повреждения учитываются как фрагменты ДНК, отделившиеся от ядерного матрикса под действием рН >13 и электрического поля. В нашем исследовании, как и ожидалось, количество этих повреждений было существенно (p = 9,1 х 10-6) выше в группе с патозооспермией по сравнению с нормозо-оспермией (табл. 1).
Применение щелочной версии ДНК-комет в сочетании с ферментами направлено на расширение спектра исследуемых повреждений ДНК за счет дифференциального анализа модифицированных оснований ДНК [10]. Из всех оснований ДНК гуанин, обладающий низким редокс-потенциалом, наиболее часто подвергается окислению [19]. А его окисленная форма 8-оксогуанин, а также Fapy-гуанин, специфи-
Таблица 1
Обнаружение повреждений ДНК сперматозоидов мужчин с нормо- и патозооспермией при использовании обычной и модифицированной щелочной версий метода ДНК-комет
Исследуемые группы Количество пациентов Повреждения ДНК (усл. ед.) Индекс фрагментации ДНК (DFI, %)
Среднее значение ± ошибка среднего Медиана (минимальное-максимальное значение) U test, p Среднее значение ± ошибка среднего Медиана (минимальное-максимальное значение) U test, p
Щелочная версия метода ДНК-комет (обнаружение одно- и двунитевых разрывов ДНК, а также щелочно-лабильных сайтов ДНК)
Нормозооспермия 16 11,0 ± 1,6 9,0 (3,0-26,0) - 10,1 ± 1,6 9,0 (3,0-25,0) -
Патозооспермия 19 100,3 ± 18,5 93,0 (10,0-300,0) 9,1 х 10-6 69,9 ± 7,9 90,0 (10,0-100,0) 9,1 х 10-6
Модифицированная (с использованием hOGG1) щелочная версия метода ДНК-комет (обнаружение окислительных повреждений ДНК)
Нормозооспермия 16 6,8 ± 1,3 4,9 (0,7-17,5) - 5,1 ± 1,0 4,5 (0,0-12,0) -
Патозооспермия 19 20,0 ± 3,3 17,8 (2,7-47,3) 0,0018 12,3 ± 2,5 10,0 (2,0-38,0) 0,0469
чески распознающиеся ферментом hOGGl [9, 10], представляют собой наиболее частые окислительные повреждения ДНК. Появление 8-оксогуанина как компонента 8-гидрок-си-2'-дезоксигуанозина (8-OHdG) в молекуле ДНК является причиной трансверсий G:C-T:A в процессе репликации [19], что свидетельствует о его высоком мутационном потенциале. Так, известно, что 8-оксогуанин (8-OHdG) инициирует и стимулирует карциногенез. Он признан критическим биомаркером риска возникновения и прогрессирования злокачественных опухолей и дегенеративных заболеваний [20]. Вследствие высокой частоты и опасности для здоровья Европейским комитетом по стандартизации ESCODD (European Standards Committee on Oxidative DNA Damage) [21] с 2004 г. рекомендован мониторинг 8-оксогу-анина в лимфоцитах периферической крови человека. Использование 8-оксогуанина в качестве маркера окислительных повреждений ДНК в различных клетках подтверждается в обзорных работах [19, 22]. Таким образом, применение нами гликозилазы hOGG1 в эн-зим-модифицированном методе ДНК-комет
было направлено на специфическое обнаружение и вырезание (с образованием апури-новых сайтов) наиболее частых окисленных оснований ДНК — 8-оксогуанина и Fapy-гу-анина, — что позволяет увеличивать спектр исследуемых повреждений ДНК в сперматозоидах мужчин и выявлять наиболее опасные для зиготы повреждения генома с высоким мутационным потенциалом.
Анализ результатов, представленных в таблице 1, показывает, что с использованием фермента hOGG1 в каждом образце спермы обнаружены сперматозоиды с окисленными основаниями ДНК. Уровни нагруженности сперматозоидов этими повреждениями при нор-мозооспермии находились в диапазоне от 0,7 до 17,5 при среднем значении 6,8 ± 1,3 усл. ед., что приблизительно в 2 раза меньше по сравнению с общим количеством одно- и двунитевых разрывов ДНК, а также щелочно-лабильных сайтов, обнаруживаемых с помощью стандартной щелочной версии метода ДНК-комет. В группе с патозооспермией нагруженность сперматозоидов окисленными основаниями ДНК также была меньше, чем разрывами нитей ДНК
и щелочно-лабильными сайтами. Однако в этой группе уровни окисленных оснований ДНК спермиев были существенно (р = 0,0018) выше, чем при нормозооспермии, при среднем значении 20,0 ± 3,3 усл. ед. и кратности превышения 2,9 раза. Аналогичная зависимость наблюдалась для индекса фрагментации ДНК (DFI) при кратности превышения 2,4 раза (табл. 1).
Отсутствие аналогичных исследований с использованием hOGGl-модифицирован-ной версии ДНК-комет не позволило провести сравнительный анализ полученных нами результатов с другими опубликованными данными. Однако сравнение наших результатов с данными, полученными другими авторами при использовании других методов исследования, подтверждает высокую чувствительность применимого нами подхода. Так, S. Vorilhon с соавторами [23], используя проточную цито-флуориметрию в сочетании с моноклональным антителом, показали 1,5-кратное повышение 8-OHdG в сперматозоидах мужчин с астено-зооспермией по сравнению с нормозооспер-мией. Также полуторакратное увеличение 8-OHdG в сперматозоидах мужчин с бесплодием по сравнению с фертильной группой было показано в работе K. Taken с соавторами [24] при использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Существенное превышение относительного количества окисленных оснований ДНК в группе с патозооспермией по сравнению с нормозооспермией, а также широкий диапазон индивидуальных уровней окисленных оснований ДНК в исследуемых группах (табл. 1) могут свидетельствовать о возможности использования анализа окислительных повреждений ДНК в диагностике генетических причин пониженной мужской фертильности после проведения дополнительных исследований на большей выборке пациентов. Однако, по мнению авторов этой работы, требуется апробирование дополнительных подходов для адаптации энзим-модифицированной версии метода ДНК-комет на сперматозоидах с целью уменьшения дисперсии фрагментов ДНК вокруг нуклеоида, а также снижения вариабельности уровней повреждений ДНК между повторностями одного образца, которые наблюдались в этой работе. О более высокой вариабельности результатов исследований
с использованием энзим-модифицированных (hOGG1 и Fpg) версий по сравнению со стандартной щелочной версией метода ДНК-комет хорошо известно [10], что не исключает необходимости дальнейшей оптимизации методических приемов.
Необходимо также отметить, что обнаруживаемые с помощью фермента hOGG1 окисленные основания ДНК представляют собой остатки тех повреждений, которые по каким-то причинам не были подвергнуты действию системы репарации ДНК сперматозоидов. Известно, что зрелые сперматозоиды обладают ограниченными репарационными возможностями, что способствует накоплению повреждений в их геноме. Эксцизионная репарация оснований ДНК (base excision repair — BER), являясь основной системой восстановления наиболее частых повреждений ДНК (модифицированных, в т. ч. окисленных, оснований ДНК, одно- и частично двунитевых разрывов ДНК) в соматических клетках, представлена не в полном, а в сокращенном варианте в сперматозоидах. Из комплекса ферментов системы BER в сперматозоидах присутствует именно гликозилаза OGG1, аналогом которой является используемый нами фермент hOGG1. Гликозилаза OGG1 проявляет высокую активность при окислительном стрессе, вырезая 8-оксогуанин и оставляя апуриновый сайт, который далее не репарируется по причине отсутствия в сперматозоидах других ферментов BER (апурино-вой-апиримидиновой эндонуклеазы 1, лигазы III, XRCC1). Обычно завершение процесса BER, начатого в сперматозоидах, происходит с участием системы материнской репарации ооцитов после оплодотворения и до этапа первого эмбрионального деления. Однако, если повреждений ДНК в сперматозоидах много и/ или система материнской репарации имеет слабый потенциал, то высока вероятность гибели зиготы или возникновения de novo мутаций, которые могут влиять на здоровье ребенка [3, 8]. Таким образом, даже небольшое остаточное количество 8-оксогуанина в сперматозоидах может иметь негативный эффект на репродуктивную функцию и здоровье ребенка. А потому обнаруживаемые с помощью фермента hOGG1 остаточные количества окисленных оснований ДНК в сперматозоидах мужчин имеют значение для оценки возможных причин
бесплодия пациентов или негативных эффектов на здоровье их детей.
Проведенный нами корреляционный анализ по Spearman показал статистически значимую (р <0,05) прямую связь между индивидуальными данными, полученными с использованием обычной и энзим-модифицированной версиями метода ДНК-комет (рис. 1), что может быть следствием общих причин возникновения повреждений ДНК, детектируемых с помощью этих методов. Однако низкое значение коэффициента корреляции (Rs = 0,528) в дополнение к различным мутационным эффектам разных типов повреждений ДНК может указывать на
невозможность замены одного теста другим и на то, что каждый из предлагаемых методов исследований может дать дополнительную информацию о состоянии генома пациента. Похожие данные были описаны ранее A. Micillo с соавторами [25], получившими низкие значения коэффициента корреляции (Rs = 0,48, р <0,0001) между фрагментацией ДНК сперматозоидов, изученной у мужчин из субфер-тильных пар методом TUNEL (Transferase mediated dUTP Nick End Labeling), и концентрацией 8-OHdG, обнаруживаемого с помощью моноклонального антитела и проточной цитофлуориметрии.
4 и
н &
«
X -
=
5
а
-
а
а ■&
я
св
э
о
о
350
300
250
200
150
100
50
-50
о
О
........О........ о
ф о о
о О о о
-10
10 20 30 40
Окислительные повреждения ДНК, усл. ед.
50
Рис. 1. Положительная корреляция между уровнями окисленных оснований ДНК и общей фрагментацией ДНК, оцененной с использованием щелочной версии метода ДНК-комет (коэффициент корреляции по Spearman
R = 0,528, p <0,05)
Дальнейший корреляционный анализ не показал связи между выявленными окислительными повреждениями ДНК и возрастом пациентов (К = 0,150 при р >0,05). Влияние возраста мужчин на повреждения ДНК сперматозоидов широко обсуждается. В нашем пилотном исследовании использовались небольшие выборки пациентов. Поэтому можно только предположить наличие очень слабой корреляции между возрастом мужчин и окис-
лительными повреждениями ДНК в сперматозоидах и говорить о необходимости большего объема материала для ее доказательства.
Поскольку в нашей выборке с патозоо-спермией преобладали образцы спермы с дефектами подвижности сперматозоидов, а о негативном влиянии окислительного стресса на подвижность сперматозоидов известно с 1970-х гг. [3], то нами был проведен корреляционный анализ между количеством окис-
ленных оснований ДНК и общим количеством подвижных сперматозоидов (с поступательными и непоступательными движениями жгутиков). Результаты анализа представлены на рисунке 2 и демонстрируют хорошую обратную корреляцию между исследуемыми характеристиками сперматозоидов (Rs = -0,702, p <0,05), что согласуется с известными данными о влиянии окислительного стресса на подвижность сперматозоидов [3]. В то же время имеется ограниченное количество работ по изучению связи между окислительными повреждениями ДНК и подвижностью сперматозоидов, а их результаты носят не совсем убедительный характер. К примеру, в упомянутой выше работе S. Vorilhon с соавторами [23] корреляция между 8-OHdG в сперматозоидах мужчин с астенозооспермией и поступательной подвижностью сперматозоидов не была статистически значимой. А в исследовании K. Taken с соавторами [24] показана
слабая (г = -0,300, р = 0,024) корреляция между 8-OHdG и поступательной подвижностью сперматозоидов. Слабая ассоциация (К = 0,36, р <0,0001) между уровнями 8-OHdG и общей подвижностью сперматозоидов мужчин из субфертильных пар была показана также в работе А. Micillo с соавторами [25]. В отличие от перечисленных исследований, установленная нами корреляция имела среднюю силу = -0,702). Она указывает на окислительный стресс как на общую причину снижения подвижности сперматозоидов и возникновения повреждений ДНК, изученных нами с помощью hOGG1. Отсутствие высокой степени корреляции между этими параметрами свидетельствует о том, что существуют и другие причины снижения подвижности сперматозоидов, а сами окисленные повреждения ДНК должны быть изучены более детально как независимый диагностический показатель мужского бесплодия.
о4
и о
с
<3
§
а и в
о
*
2
а
4 о в о
5
О U
Т =
С
и
и и
3
о О
80
70
50
50
4-0
30
20
10
-10
О
о о
-<£<> О
о о
о
о о о
о о о °
................V.................... < > о .
-10
10
20
30
40
50
Окислительные повреждения ДНК, усл. ед.
Рис. 2. Отрицательная корреляция между уровнями окисленных оснований ДНК и общей подвижностью сперматозоидов (коэффициент корреляции по Spearman R = -0,702, p <0,05)
Заключение
В ходе проведенного пилотного исследования впервые адаптирована модифицированная щелочная версия метода ДНК-комет с приме-
нением фермента hOGG1 для оценки окислительных повреждений, а именно окисленных оснований ДНК в сперматозоидах мужчин: 8-оксогуанина и Fapy-гуанина, — представля-
ющих собой рисковые факторы для мужской фертильности. С использованием адаптированной методики описаны уровни окислительных повреждений ДНК при нормо- и патозооспер-мии. Установлено существенно (р = 0,0018) более высокое количество окислительных повреждений ДНК при патозооспермии по сравнению с нормозооспермией, что указывает на хорошую значимость этого параметра для диагностики мужской фертильности. Показана обратная корреляция между количеством окислительных повреждений ДНК и общей подвижностью сперматозоидов, что свидетельствует о том, что окислительный стресс может представлять собой общую причину возникновения анализируемых повреждений ДНК и снижения подвижности сперматозоидов. В то же время не обнаружена связь между окислительными повреждениями ДНК сперматозоидов и возрастом мужчин.
Однако небольшая выборка исследуемых образцов спермы, а также технические трудности, возникшие при использовании энзим-модифицированной версии метода ДНК-комет (большая дисперсия фрагментов ДНК и вариабельность уровней повреждений ДНК между повторностями одного образца), не позволяют авторам работы рекомендовать широкое использование данного метода в настоящее время без проведения дальнейшей оптимизации методических подходов и дополнительных исследований на большей выборке образцов спермы.
Представленная работа выполнена в рамках задания 2.2.5 «Изучение спектра повреждений ДНК спермиев при пониженной мужской фертильности» государственной программы научных исследований «Биотехнологии-2» (2021-2025 гг.). Авторы выражают благодарность сотрудникам Республиканского научно-практического центра «Мать и дитя», осуществлявших в 2012-2015 гг. сбор образцов спермы и анкетных данных пациентов; сотрудникам лаборатории молекулярных основ стабильности генома Института генетики и цитологии НАНБеларуси и Республиканского банка ДНК человека, животных, растений и микроорганизмов за оказанную услугу по депонированию и выдаче образцов спермы из хранилищ банка для проведения исследования.
Список использованных источников
1. 1 in 6 people globally affected by infertility: WHO [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.who.int/news/item/04-04-2023-1-in-6-people-globally-affected-by-infertility/. - Дата доступа: 08.08.2023.
2. Pereira, R. Morphological and molecular bases of male infertility: a closer look at sperm flagellum / R. Pereira, M. Sousa // Genes (Basel).
- 2023. - Vol. 14, № 2. - Pub. 383.
3. Male infertility and oxidative stress: A focus on the underlying mechanisms / R. J. Aitken [et al.] // Antioxidants (Basel). - 2022. - Vol. 11, № 2. - Pub. 306.
4. Temporal trends in sperm count: a systematic review and meta-regression analysis of samples collected globally in the 20th and 21st centuries / H. Levine [et al.] // Hum. Reprod. Update. - 2023.
- Vol. 29, № 2. - P. 157-176.
5. Male Oxidative Stress Infertility (MOSI): proposed terminology and clinical practice guidelines for management of idiopathic male infertility / A. Agarwal [et al.] // World J. Mens Health. - 2019. - Vol. 37, № 3. - P. 296-312.
6. Male subfertility and oxidative stress / E. P. P. Evans [et al.] // Redox Biol. - 2021. -Vol. 46. - Pub. 102071.
7. Dutta, S. The role of nitric oxide on male and female reproduction / S. Dutta, P. Sengupta // Malays. J. Med. Sci. - 2022. - Vol. 29, № 2. -P. 18-30.
8. Oxidation of sperm DNA and male infertility / L. R. Ghaleno [et al.] // Antioxidants (Basel). -2021. - Vol. 10, № 1. - Pub. 97.
9. Smith, C. C. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII / C. C. Smith, M. R. O'Donovan, E. A. Martin // Mutagenesis.
- 2006. - Vol. 21, № 3. - P. 185-190.
10. Measuring DNA modifications with the comet assay: a compendium of protocols / A. Collins [et al.] // Nat. Protoc. - 2023. - Vol. 18, № 3. - P. 929-989.
11. Oxidative damage to DNA: do we have a reliable biomarker? / A. R. Collins [et al.] // Environ. Health Perspect. - 1996. - Vol. 104, Suppl. 3. - P. 465-469.
12. Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay / A. R. Collins // Biochim. Biophys. Acta. - 2014.
- Vol. 1840, № 2. - P. 794-800.
13. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 5th ed. - Geneva, Switzerland: World Health Organization. - 2010. - 272 p.
14. Метод диагностики генетически обусловленных форм мужского бесплодия. Инструкция по применению / О. В. При-бушеня [и др.] // Министерство здравоохранения Республики Беларусь. - Рег. № 1961115 от 18.03.2016. [Электронный ресурс].
- Режим доступа: http://med.by/methods/book. php?book=2110/. - Дата доступа: 07.08.2023.
15. Двунитевые разрывы ДНК спермиев у пациентов с нормозооспермией и патозоо-спермией / И. Д. Кужель [и др.] // Доклады НАН Беларуси. - 2023. - Т. 67, № 4. - С. 307-314.
16. Collins, A. In vitro repair of oxidative and ultraviolet-induced DNA damage in supercoiled nucleotide DNA by human cell extract / A. Collins, I. Fleming, C. Gedik // Biochem. Biophys. Acta.
- 1994. - Vol. 1 219. - P. 724-727.
17. Simplified method for the collection, storage, and comet assay analysis of DNA damage in whole blood / K. Al-Salmani [et al.] // Free Radic. Biol. Med. - 2011. - Vol. 51, № 3. -P. 719-725.
18. Mouse spermatocytes express CYP2E1 and respond to acrylamide exposure / B. J. Nixon [et al.] // PLoS ONE. - 2014. - Vol. 9, № 5. -P. e94904.
19. Generation, repair and replication of guanine oxidation products / K. Kino [et al.] // Genes Environ. - 2017. - Vol. 39. - Pub. 21.
20. Valavanidis, A. 8-hydroxy-2' -deoxyguano-sine (8-OHdG): a critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis / A. Valavanidis, T. Vlachogianni, C. Fiotakis // J. Environ. Sci. Health. C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. -2009. - Vol. 27, № 2. - P. 120-139.
21. Gedik, C. M. Establishing the background level of base oxidation in human lymphocyte DNA: results of an interlaboratory validation study / C. M. Gedik, A. Collins; ESCODD (European Standards Committee on Oxidative DNA Damage) // FASEB J. - 2005. - Vol. 19, № 1. - P. 82-84.
22. Cadet, J. DNA base damage by reactive oxygen species, oxidizing agents, and UV radiation / J. Cadet, J. R. Wagner // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. - 2013. - Vol. 5, № 2. -Pub. a012559.
23. Accuracy of human sperm DNA oxidation quantification and threshold determination using an 8-OHdG immuno-detection assay / S. Vorilhon [et al.] // Hum. Reprod. - 2018. - Vol. 1, № 33. -P. 553-562.
24. Oxidative DNA damage to sperm cells and peripheral blood leukocytes in infertile men / K. Taken [et al.] // Med. Sci. Monit. - 2016. -Vol. 22. - P. 4 289-4 296.
25. Semen leukocytes and oxidative-dependent DNA damage of spermatozoa in male partners of subfertile couples with no symptoms of genital tract infection / A. Micillo [et al.] // Andrology. -2016. - Vol. 4. - P. 808-815.
N. I. Ryabokon, I. D. Kuzhal
OXIDATIVE SPERM DNA DAMAGE IN PATIENTS WITH NORMO- AND PATHOZOOSPERMIA
State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: n.ryabokon@igc.by
A pilot study of oxidative DNA damage in the spermatozoa of men of reproductive age with normozoospermia and pathozoospermia (diagnoses astheno-, asthenoteratho-, oligo-, and oligoasthenozoospermia) was carried out. For the study, an enzyme-modified alkaline version of the comet assay was adapted, which includes the treatment of spermatozoa with the glycosylase hOGG1. This enzyme specifically recognizes the most common oxidative DNA damage — oxidized forms of guanine: 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoguanine) and 2,6-diamino-4-hydroxy-5N-methylformamidopyrimidine (Fapy-Gua). A significantly increased amount of oxidative DNA damage was found in the group with pathozoospermia compared to normozoospermia. An inverse correlation was shown between the amount of oxidative DNA damage and the total sperm motility, which indicates that oxidative stress is a common cause of the DNA damage under study and of decreased sperm motility.
Keywords: normozoospermia, pathozoospermia, oxidative sperm DNA damage, 8-oxoguanine, Fapy-guanine, enzyme-modified alkaline version of the DNA comet assay, hOGG1.
Дата поступления в редакцию: 29 августа 2023 г.
