Окислительно-восстановительный потенциал среды, содержащей культуру СРБ, как показатель ее активности Текст научной статьи по специальности «Математика»

УДК 620.193

ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ СРЕДЫ, СОДЕРЖАЩЕЙ КУЛЬТУРУ СРБ, КАК ПОКАЗАТЕЛЬ ЕЕ АКТИВНОСТИ

© Aft 3aBC|)iiiiiMCi<:iiM, B.H. BnrgopoBHH

Zavershinsky A.N., Vigdorovitch V.I. Redox potential of medium, containing SRB culture as its activity index. The possibility of using redox potential as one of indexes of depression of Desulfovibrio Desulfuricans culture is considered. The alteration of the redox potential dependence within the presence of some O,O’-dihidroxyazocompounds is traced.

В настоящее время одной из основных причин выхода из строя оборудования, эксплуатируемого в контакте с потенциально агрессивными природными средами, является деятельность микроорганизмов. Принимая во внимание заключение экспертов 80-х годов о том, что 90 % отказов магистральных трубопроводов вызваны деятельностью сульфатредуци-рующих бактерий (СРБ), становится очевидной роль микробиологического фактора в коррозии подземных сооружений [1]. Большая доля материальных потерь нефтедобывающей и нефтеперерабатывающей промышленности также обусловливается деятельностью указанной группы микроорганизмов [2]. Этим и вызван интенсивный поиск мер по предупреждению и подавлению микробиологической коррозии.

Бактерии, относимые к СРБ, являются строгими анаэробами. В связи с этим, неоднократно отмечалось, что для снижения опасности коррозии с участием СРБ следует избегать анаэробных условий, а в качестве самого действенного защитного средства указывалась аэрация [3]. Гибель таких строгих анаэробов при доступе кислорода объясняют протеканием нефизиологической реакции окисления, либо как результат создания неподходящих окислительно-восстановительных условий. Отмечалось, что СРБ способны в присутствии кислорода воздуха, не развиваясь, длительно сохранять свою жизнеспособность. Это подтверждается наблюдением выживания СРБ не только в условиях жидких культур, но и в микрокаплях среды, распыленной в воздухе. В природных условиях, где СРБ находятся под защитой естественных спутников, потребляющих кислород продуктов коррозии металла, а в почве - почвенных коллоидов, СРБ способны сохранять жизнеспособность более 2-х лет [4].

Экспериментальное подтверждение нашла точка зрения, согласно которой кислород оказывает не прямое, а опосредованное действие, - как основной фактор, определяющий окислительно-восстановительный потенциал (ОВП) среды.

В растворах сравнительно несложного и определенного состава, содержащих обратимые системы, окислительно-восстановительный потенциал является термодинамической характеристикой, которая зависит от химического состава и соотношения концентраций окисленной и восстановленной форм вещества. В средах сложного, химически недостаточно определенного состава, а также в средах, содержащих малообратимые системы, ОВП имеет

значение физико-химического или технологического параметра, величина которого в значительной степени определяет течение и направление процессов, протекающих в среде.

В открытых системах OВП наряду с термодинамической приобретает функцию кинетического фактора среды. К таким относятся все биологические системы, в которых протекают, как правило, необратимые химические реакции, связанные с непрерывным поступлением исходных веществ и удалением продуктов реакции. В каталитических окислительно-восстановительных реакциях, протекающих в открытых биологических системах, максимальная скорость процессов связана с определенной величиной OВП и его изменение, например, посредством бактериальной культуры, может вызвать изменение направления биохимических реакций. «Включение» или «выключение» той или иной ферментативной системы вследствие изменения OВП может привести к преимущественному протеканию какой-либо одной реакции из множества реализуемых параллельно [5].

Возможность функционирования фермента в качестве катализаторов окислительно-восстановительной реакции требует определенного оптимума величины OВП среды. Его изменение может активировать или дезактивировать как окислительные ферменты (т. е. ферменты, содержащие активные группы, которые способны к окислительно-восстановительным реакциям: сульфгидрильные, карбоксильные, аминогруппы и т. д. [5]), так и ряд других функциональных групп ферментов (гидролаза, трансфераза и т. п.).

Смещение OВП даже на незначительную величину приводит к перестройке большинства биохимических процессов, происходящих в микробной клетке. Значительное его изменение обычно приводит к гибели микроорганизмов.

В природных водах, почвах и нефтях СРБ распространены повсеместно, несмотря на широкое варьирование OВП [4]. По данным [б], чистые культуры начинают развиваться при значениях OВП -100 ... -80 мВ. Наивысшей скорости роста культура Desulfovibrio vulgaris достигает при OВП = -150 мВ и pH б,95. При этом наблюдается минимальное образование сульфидов [4].

В [З] приводятся данные о зависимости опасности микробиологической коррозии, вызываемой СРБ, от окислительно-восстановительного потенциала почвы:

ОВП почвы, мВ Опасность

(приведенный микробиологической

по отношению к н. в. э.) коррозии

до 100 сильная

100-200 средняя

200-400 небольшая

свыше 400 весьма малая

Несмотря на широкое распространение СРБ, коррозионное повреждение металлических сооружений с их участием наблюдается, в основном, во влажных почти нейтральных (слабо кислых pH = 5-6) грунтах. При этом увлажненность является одним из определяющих факторов, обуславливающих развитие СРБ в почве. В аэрируемых, хорошо дренируемых почвах процессы окисления и восстановления сбалансированы так, что не происходит накопления восстановленных соединений серы и других продуктов анаэробного обмена. В тоже время господство восстановительных процессов и область активного выделения сероводорода бактериями приурочены к зонам постоянного переувлажнения [7]. Связано это с ограничением поступления кислорода в почву и созданием анаэробных условий. При этом большее значение имеет не отсутствие в почве (или бактериальной среде) кислорода, а уровень установившегося ОВП.

В условиях бактериальных лабораторных культур его величина во многом определяется фазой развития СРБ. Колонии проходят шесть фаз, длительность которых зависит от свойств микроорганизмов и материала, на котором происходит их рост, и условий среды. После периода некоторой задержки (лаг-фазы см. рис. 1) наблюдается ускорение роста (экспоненциальный рост), затем происходит замедление роста из-за дефицита питания, накопления ингибирующих продуктов или изменения условий среды. По достижении максимума прироста наступает стационарная фаза (4), которая характеризуется постоянством биомассы, затем наступает заключительная стадия (5), связанная с уменьшением биомассы в результате метаболических процессов и отмирания микроорганизмов.

Для биоповреждений наибольшее значение с точки зрения развития коррозионного процесса играют первые две фазы (рис. 1), а с точки зрения накопления биомассы и продуктов метаболизма, стимулирующих другие процессы, в том числе и коррозии металлов, - две последующие.

Кинетические характеристики могут быть выражены следующими моделями [3]: дифференциальной в общем виде

2 3 4 5

/(т) = т ldm(dт) 1; в виде функции Дг) = Ь(1 - еь(ат>-1)-1; в интегральном выражении т = та (1 +ае',1ту1,

(1)

(2)

(3)

где т - текущее значение биомассы; та - максимально возможная на данном материале в данных условиях биомасса данного микроорганизма; Ь -удельная скорость роста биомассы; а - коэффициент, характеризующий эффективность питательной среды.

Длительность лаг-фазы (т. е. наименьшего периода прироста биомассы) для культуры СРБ определяется начальным уровнем ОВП питательной среды. Значение ОВП выше 150 мВ (относительно хлорсе-ребряного электрода) увеличивает ее продолжительность, а при дальнейшем его повышении, даже если в наличии есть все прочие необходимые условия для развития микроорганизмов, культура может впасть в неактивное состояние. Обратная картина наблюдается в случае снижения ОВП до -50 ... -80 мВ, когда длительность лаг-фазы сокращается до минимума, и культура фактически сразу переходит к экспоненциальному росту. В микробиологической практике традиционным является введение в среду стали для создания благоприятного для роста анаэробных бактерий ОВП [8]. Другой путь связан с введением в среду большого количества посевного материала, что также приводит к сокращению лаг-фазы. Это связано с накоплением восстановителей при развитии анаэробов в культуральной жидкости, которые снижают ОВП среды [9].

Большое влияние на скорость развития микроорганизмов оказывает величина pH. Экспериментально показано [4], что величины ОВП и pH связаны друг с другом линейно, с наклоном Лу/Л pH, равным 59 мВ (при 25° С), в аэрируемых почвах эта производная равна -0,05 ... 0,10 мВ на единицу pH. На рис. 2 приведена диаграмма pH - ОВП области обитания СРБ, из которой видно, что расчетные границы обитания сульфатредуцирующих бактерий близки к найденным в природе. В условиях лабораторной культуры СРБ способны развиваться в области pH 6,0-9,0. В природе этот интервал значительно шире (4,2 .10,5) [4].

Рис. 1. Фазы роста микроорганизмов: 1 - лаг-фаза; 2 - экспоненциальный рост; 3 - замедленный рост; 4 - стационарная фаза; 5 - отмирание микроорганизмов; 6 - фаза выживания [3]

Рис. 2. Диаграмма рН-ОВП. Заштрихована область обитания СРБ [4]

1

6

т

т

Рис. 3. Зависимость ОВП бактериальной культуры от времени. 1 - контроль; 2 - при введении в среду стали; 3 - в присутствии препарата (1) 100 мг/л; 4 - в присутствии препарата (1) 5 мг/л

Рис. 4. Зависимость ОВП бактериальной среды от концентрации Н28. 1 - расчетные данные (рН = 6); 2 - расчетные данные (рН = 8); 3 - экспериментально полученные данные

Сообщения о кислотоустойчивых формах, выдерживающих значение pH = 1,5-2,0, не подтвердились [7].

По [4], снижение предела выживания СРБ (по pH) в условиях почвы, т. е. способность адсорбированных на глинистых частицах бактерий пережить большее подкисление среды, нежели у клеток в растворе, объясняется тем, что в коллоидных системах на поверхности коллоидных частиц, эффективное значение pH ниже, чем в растворе.

В общем случае для каждого вида микроорганизмов изменение значения ОВП в ходе развития культуры является достаточно постоянным и зависит от особенностей метаболизма. Наличие бактериостатическо-го действия, определяемого по различию в росте культур, обычно не может быть установлено ранее, чем через 18 часов, как в случае стерильных разведений, так и при чашечном методе. Изменение величины ОВП позволяет определить наличие бактериостатического эффекта в первые часы роста культуры. По данным [10], также наблюдается наличие параллелизма между изменением числа бактериальных клеток и величины ОВП как для аэробов, так и для анаэробов. Однако количественной зависимости между числом клеток и величиной ОВП не установлено.

При выращивании культуры Везы/отЬпо Безы/Ыпеат на вторые сутки культивирования наблюдается резкое падение величины ОВП бактериальной жидкости от начального значения в питательной среде, равного +370 мВ, достигающее 80 мВ за сутки (рис. 3). При этом в первые сутки изменение величины ОВП незначительно и редко превышает 20 мВ. Связано это с тем, что колония СРБ в данный момент находится в лаг-фазе, а потому не вызывает

сильного изменения окислительного потенциала среды. Скачок ОВП, приходящийся на вторые сутки культивирования и сопровождающийся резким увеличением числа микроорганизмов, свидетельствует о переходе к фазе экспоненциального роста и появлению в среде большого числа молодых бактериальных клеток, за счет действия ферментативных систем которых происходит изменение потенциала среды. Проследить изменение ферментативных систем СРБ в ходе наших исследований не удалось, однако сопоставление данных о концентрации сероводорода в среде с экспериментальными значениями ОВП позволяет предположить, что скачок потенциала в среде связан именно с действием этих систем.

Накопление восстановленных соединений серы осуществляется в ходе специфического анаэробного процесса - так называемой диссимиляторной суль-фатредукции [8, 11], при которой в качестве доноров электронов используются органические вещества или молекулярный водород, а акцепторами электронов служат сульфат-ионы.

4Н2 + 8042--0 Н28 + 2Н20 + 20Н"

А00 = -152,4 кДж/моль [4].

(4)

Резкое падение ОВП среды сопровождается накоплением в культуре биогенного сероводорода по реакции (1), концентрация которого на 4-е сутки культивирования достигала по нашим данным 50 мг/л. В такой концентрации он, несомненно, угнетает СРБ, что приводит к замедлению роста и переходу культуры в третью фазу (рис. 1). ОВП в данный момент достигает величины +200 мВ. Дальнейшее накопление сероводорода приводит к еще большему угнетению культуры, которое сопровождается падением численности бактерий. Максимальная концентрация Н^ в наших исследованиях обычно не превышала 200 мг/л. Расчет с учетом реакции (1), проведенный по уравнению Нернста,

Е = Ео + — ■ 1п

пР’ СКе<1

(5)

показывает, что основное влияние на ОВП бактериальной культуры оказывает концентрация сероводорода.

Оценка стандартного ОВП проведена по уравнению (2):

Е0 = -АО0/п¥

(6)

Полученные данные приведены в таблице 1.

На рисунке 4 показана зависимость ОВП бактериальной культуры от концентрации сероводорода в бактериальной среде.

Таблица 1

Величина ОВП, В

Сн28, мг/л Экспериментальные Расчетные данные

данные рН = 6 8 II X р

50 0,202 0,322 0,292

100 0,122 0,319 0,289

200 0,062 0,315 0,286

Обращает на себя внимание линейный характер зависимости «ОВП - 1% Сн^», как полученной на практике, так и расчетной. В ходе проводимых исследований выяснить причину несоответствия угла наклона экспериментально полученной кривой расчетной величине не удалось, но наличие прямолинейной зависимости ОВП от логарифма концентрации сероводорода в среде позволяет предположить, что определяющее влияние на величину окислительновосстановительного потенциала оказывает Н2Б. Несоответствие угла наклона кривых можно объяснить протеканием в бактериальной культуре какой-либо другой реакции, отличной от (1), или возможностью одновременной реализации сразу нескольких параллельных процессов.

По [4], восстановление сульфатов до сульфидов

происходит в три стадии:

3Б042- + 6Н2 ^ Б3062- + 6Н20 (7)

8з062- + 2е ^ Б2032- + Б032- (8)

Б2032- + 2е ^ Б2- + Б032-. (9)

Вероятность протекания нескольких параллельных реакций затрудняет расчет величины ОВП. Более отрицательное значение экспериментальной величины ОВП, по сравнению с расчетными данными, вызвано сложностью состава среды и наличием дополнительных восстановителей. В их роли выступают некоторые бактериальные метаболиты, концентрация которых в расчетах не учитывалась. Известно, что помимо сероводорода в результате жизнедеятельности СРБ в среде появляются продукты неполного (ацетат-ионы, формиат-ионы) и полного (СО2) окисления органического вещества, которые могут образовываться, например, по следующим реакциям:

2СН3СН0НС00-+8042-+2Н+ ^

^ 2СН3С00^+Н2Б+2С02+2Н20 (10)

4СН3С0С00^+Б042-+2Н+ ^

^ 4СН3С00^+Н2Б+4С02 . (11)

Количественно оценить долю выхода подобных продуктов метаболизма СРБ нам не удалось, т. к. она зависит от целого ряда факторов (возраст культуры, концентрация субстрата, наличия или отсутствия микроэлементов и витаминов и т. д.), трудно поддающихся математическому описанию. Концентрацию данных соединений в силу ряда методологических трудностей определить не удалось. По этой причине их наличие в проведенных расчетах не учитывалось. Накоплением большого числа неучтенных восстановителей объясняются более отрицательные экспериментальные значения ОВП. Поэтому проведенные расчеты носят лишь ориентировочный характер и не могут выражать количественных зависимостей в виду сложности состава компонентов бактериальной культуры.

По мере снижения продуцирования сероводорода бактериями замедляется и изменение ОВП среды. При этом, если исключить потери сероводорода в ходе культивирования СРБ, то потенциал, достигнув величины +120 мВ, далее изменяется слабо, и его

дальнейшее варьирование после завершения жизненного цикла СРБ объясняется снижением концентрации сероводорода.

Ход кривой ОВП = /(т) может измениться, если при выращивании бактерий в бактериальную среду вводится сталь, которая стимулирует развитие культуры. Однако при наличии в среде достаточного количества ионов железа, это влияние невелико. Образующийся при контакте железа с сероводородом сульфид затрудняет определение числа бактериальных клеток и концентрации вводимых в культуру ингибиторов. Кроме того, железо, связывая выделяемый бактериями биогенный сероводород, не позволяет оперативно контролировать активность сульфидо-образования. За счет связывания сероводорода, ОВП среды на 4-е сутки культивирования (в присутствии стали) начнет повышаться из-за падения концентрации свободного в растворе.

Ее ^ Ее2+ + 2е (12)

Ее2+ + Б2~ ^ ЕеБ . (13)

Помимо этого на ход кривой зависимости ОВП от времени оказывает влияние появление в растворе ионов железа.

Определение ОВП проводили непосредственно в бактериальной культуре с использованием рабочего платинового электрода ЭТПЛ-01М. В качестве электрода сравнения применяли хлорид-серебряный электрод типа ЭВЛ-1М1. Измерение величины потенциала проводили на универсальном иономере ЭВ-74, с относительной ошибкой не более 5 %.

Другою целью наших исследований являлось изучение влияния ряда органических соединений на СРБ. Интерес к используемым веществам вызван необходимостью поиска эффективных биоцидов, подавляющих развитие микроорганизмов, вызывающих микробную коррозию стали, которая наносит наибольший ущерб в нефтедобывающей и нефтеперерабатывающей промышленности [2]. Данные вещества относятся к о,о'-дигидроксиазосоединениям, являющимся перспективными полифункциональны-ми присадками к дизельному топливу. Ранее выяснено, что они обладают ингибирующими свойствами при коррозии углеродистой стали [12, 13]. Помимо этого они проявляют и свойства присадок - деактиваторов металлов, являются стабилизаторами топлива при хранении [14] и обладают бактериостатическим действием [15, 16]. При введении в бактериальную культуру исследованные препараты оказывают слабое бактериостатическое действие, не вызывая полной гибели микроорганизмов, а лишь приостанавливая их развитие [16]. Наибольшим эффектом обладают вещества, имеющие в своем строении азот пиро-зольного кольца. Так, препарат (2) (строение см. [15]) в концентрации 100 мг/л вызывает гибель 90 % клеток СРБ. ОВП, равный +240 мВ, достигается на 5-е сутки, после чего он стабилизируется. Сопоставление этого показателя с численностью бактерий в среде позволяет утверждать о том, что препарат препятствует переходу культуры в фазу экспоненциального роста. Подобные изменения величины окислительно-восстановительного потенциала четко совпадают с сильным угнетением бактериальной культуры. При понижении концентрации препарата (1) до 5 мг/л

выживает 90 % бактерий. При этом незначительно затягивается продолжительность лаг-фазы, что совпадает с характером изменения ОВП. Однако в дальнейшем развитие культуры идет типично, и ОВП на 7-е сутки эксперимента незначительно отличается от контроля, что, несомненно, свидетельствует о слабом угнетении бактерий.

Вещества (3) и (4) подвергаются микробиологическому окислению, в результате чего в ходе эксперимента их концентрация в растворе уменьшается. Это приводило к снижению их эффективности, а в ряде случаев даже к стимуляции роста бактериальной культуры. При этом величина ОВП вначале меняется незначительно, а затем происходит скачок потенциала с достижением значений, характерных для контроля.

ВЫВОДЫ

ОВП бактериальной среды является важным показателем жизнедеятельности микроорганизмов, определяющим развитие микробиологической культуры.

Характер изменения ОВП в ходе развития бактериальной культуры может являться видовой особенностью отдельных видов, а часто и отдельных штаммов микроорганизмов.

Отклонение ОВП от контроля при введении в культуру различных препаратов позволяет судить о наличии или отсутствии бактериостатического эффекта.

Сопоставление данных о числе бактериальных клеток с величиной ОВП среды помогает выявить стадию развития культуры, на которую исследуемые препараты оказывают наибольшее влияние.

Сопоставление изменения ОВП ингибируемой культуры с контролем позволяет судить о численности микроорганизмов, однако четкое соответствие между характером изменения ОВП и численностью бактерий наблюдается не всегда.

ЛИТЕРАТУРА

1. Козлова И.А., Коптева Ж.П., Пуриш Л.М., Андреюк Е.И., Погребова И.С., Туовинен О.Х.. Микробная коррозия и защита под-

земных металлических сооружений // Практика противокоррозионной защиты. 1999. № 3 (13) С. 21-27.

2. Литвиненко С.Н. Защита нефтепродуктов от действия микроорганизмов. М.: Химия, 1977. 143 с.

3. Герасименко В.П. Защита машин от биоповреждений. М.: Машиностроение, 1984. 198 с.

4. Камаева С.С. Биокоррозионная активность грунта как фактор стресс-коррозии магистральных трубопроводов. М.: ИРЦ Газпром, 1996. 72 с.

5. ЗахарьевскийМ.С. Оксредметрия. Л.: Химия, 1967. 120 с.

6. Розанова Е.П., Мехтиева Н.А., Алиева Н.Ш. Микробиологические процессы и коррозия металлического оборудования в заводняемом нефтяном пласте // Микробиология. 1969. Т 38. № 5. 860 с.

7. Бабаева И.П., ЗеноваГ.М. Биология почв. М.: Изд-во МГУ,1989. 336 с.

8. Стейнер Р., Эдельберг Э., Ингрем Дж. Мир микробов. М.: Мир, 1979. Т. 3. 133 с.

9. Пименова М.Н., Гречишкина Н.Н., Азова Л.Г. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М.: Изд-во МГУ, 1971. 220 с.

10. Работнова И.Л. Роль физико-химических условий (pH и ГН2) в жизнедеятельности микроорганизмов. М.: Изд-во АН СССР, 1957. 120 с.

11. Иванов М.В. Роль микроорганизмов в образовании сероводорода // Роль микроорганизмов в кругообороте газов в природе. М.: Наука, 1980. С. 114.

12. Вигдорович В.И., Романцова С.В., Нагорнов С.А. Использование ряда соединений для ингибирования коррозии углеродистой стали в подтоварной воде нефтепродуктов // Вестн. ТГУ. Сер. Естеств. и технич. науки. Тамбов, 1999. Т. 4. Вып. 2. С. 180-181.

13. Вигдорович В.И., Романцова С.В., Нагорнов С.А. Ингибирование коррозии стали в подтоварной воде при хранении нефтепродуктов // Вестн. ТГУ. Сер. Естеств. и технич. науки. Тамбов, 1999. Т. 4. Вып. 3. С. 316-319.

14. Вигдорович В.И., Нагорнов С.А., Романцова С.В. Стабилизация дизельных топлив в условиях длительного хранения // Вестн. ТГУ. Сер. Естеств. и технич. науки. Тамбов, 1999. Т. 4. Вып. 3. С. 312-315.

15. Завершинский А.Н., Вигдорович В.И., Спицын И.П. Влияние некоторых о, о'-дигидроксиазосоединений потенциальных ингибиторов коррозии металлов на ОезиІ/оуіЬгіо (іезиЦигісат // Вестн. ТГУ. Сер. Естеств. и технич. науки. Тамбов, 1999. Т. 4. Вып. 3. С. 320-323.

16. Завершинский А.Н., Вигдорович В.И. О,о'-дигидроксиазо-соединения как потенциальные биоциды - ингибиторы коррозии в присутствии ОезиІ/оуіЬгіо йезиЩпсат // Вестн. ТГУ. Сер. Ес-теств. и технич. науки. Тамбов, 2000. Т. 5. Вып. 1. С. 25-28.

Поступила в редакцию 15 января 2000 г.