CC BY
6Ученые записки Крымского федерального университета имени В. И. Вернадского Биология. Химия. Том 6 (72). 2020. № 1. С. 81-87.
УДК 577.112.612
ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ ПРОТЕИНОВ В ЭРИТРОЦИТАХ ПРИ ИХ ХРАНЕНИИ В СОСТАВЕ ГЕМОКОНСЕРВАНТОВ РАЗНОГО ТИПА
Коношенко С. В.1, Коростелёв А. В.1, Большакова А. А.1, Мирмуминова З. М.2
1Таврическая академия (структурное подразделение) ФГАОУВО «Крымский федеральный
университет имени В. И. Вернадского», Симферополь, Крым, Россия
2ГБУЗ РК «Центр крови», Симферополь, Крым, Россия
E-mail: nataleiolkina@gmail.com
Показано, что при хранении эритроцитов практически здоровых людей в течение 2-х и 3-х недель при температуре 4 °С без гемоконсерванта усиливаются процессы окислительной модификации внутриэритроцитарных протеинов, о чём свидетельствует существенное увеличение содержания альдегидных и кетонных продуктов окислительной модификации нейтрального и основного характера. При хранении эритроцитов в составе гемоконсервантов CPD/SAGM и СРБА-1 снижается интенсивность окислительной модификации протеинов: в среднем, в 2 раза через 2 недели хранения эритроцитов и на 25 % через 3 недели хранения по сравнению с эритроцитами, которые хранились без консерванта. Ключевые слова: эритроциты, окислительная модификация протеинов, гемоконсерванты, трансфузиология.
ВВЕДЕНИЕ
Одной из проблем современной гемодинамики и трансфузиологии является поиск новых методических подходов и способов, направленных на сохранение структурно-функционального состояния эритроцитов при их длительном хранении с целью дальнейшего использования в медицинской практике [1-4]. В настоящее время трансфузиологи используют различные методы консервации цельной крови или эритроцитарной массы, в том числе методы криоконсервации. Чаще всего применяются определённые системы гемоконсервантов, позволяющие поддерживать функционально-активные состояния эритроцитов при их хранении в течение 40-45 дней при температуре 4 °С-6 °С [3, 4].
Несмотря на определенные успехи, достигнутые в этом направлении, всё же остаются недостаточно изученными те вопросы, которые касаются метаболического состояния эритроцитов и зависимой от этого кислородо-транспортной функции гемоглобина при длительном хранении эритроцитов в условиях гемоконсервации. В частности, в доступной литературе не встречаются данные о состоянии процессов окислительной модификации протеинов в эритроцитах в условиях их хранения в составе гемоконсервантов.
Окислительная модификация протеинов является одним из звеньев тех деструктивных процессов, которая, как и перекисное окисление липидов, осуществляется под действием активных форм кислорода (АФК) различного происхождения. Окислительная модификация протеинов ведёт не только к
изменениям структурных и функциональных свойств различных белков, но также может быть причиной генерирования новых «пулов» АФК и развития окислительного стресса [5-8].
В связи с этим, представляю интереса изучить процессы окислительной модификации протеинов в эритроцитах при их хранении в составе гемоконсервантов различного типа, что и составило цель настоящей работы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследований служили эритроциты практически здоровых людей (25 человек, средний возраст 38,0 лет). Кровь брали на базе ГБУЗ РК «Центр крови», г. Симферополь. Эритроциты хранили в течение 2-х и 3-х недель при температуре 4 °С в составе гемоконсервантов СРБ/БАвМ и СРБА-1. Контролем служили эритроциты, которые хранились при температуре 4 °С в течение 2-х и 3-х недель без консерванта.
Состав гемоконсервантов следующий:
1. СРБ/БАвМ включает натрия цитрата дигидрат - 2,63 г; лимонную кислоту -0,327 г; натрия дигидрофосфат моногидрат - 2,55 г; натрия хлорид - 0,577 г; аденин - 0,0169 г; декстрозы моногидрат - 0,9 г; маннитол - 0,525 г; воду без инъекций - до 100 мл [4].
2. СРБА -1 включает натрия цитрат дигидрат - 2,63 г; одноосновный моноцитрат натрия фосфат - 0,222 г; декстрозы моногидрат - 3,19 г; аденин - 0,028 г; вода без инъекций - до 100 мл [3].
Формакодинамика консервантов направлена на стабилизацию эритроцитов, предупреждение гемокоагуляции, поддержание слабощелочного значения рН, обеспечение эритроцитов энергетическим субстратом [3, 4].
Через определенные периоды хранения эритроциты гемолизировали [9], в гемолизатах определяли содержание продуктов окислительной модификации протеинов, используя биохимический метод, основанный на спектрофотометрической идентификации 2,4-динитрофенилгидразонов
аминокислотных остатков (альдегидные и кетонные производные нейтрального и основного характера) при длинах волн 356 нм, 370 нм, 430 нм и 530 нм [10].
Полученные данные обрабатывали статистически с применением ^критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Как показали результаты исследований, через 2 недели хранения эритроцитов без гемоконсервантов (контроль 1) в гемолизатах возрастало содержание альдегидных и кетонных продуктов окислительной модификации протеинов нейтрального и основного характера, в среднем, в 2,0 раза по сравнению с исходными показателями (табл. 1). При хранении эритроцитов в течение этого периода времени в составе гемоконсерванта СРБ/БАвМ интенсивность реакций окислительной модификации протеинов была ниже по сравнению с контролем 1, о чём свидетельствует более низкий уровень образования альдегидных и кетонных продуктов окислительной модификации нейтрального характера (в среднем в 1,6
раза) и основного характера: в 2,0 раза (альдегидные продукты) ив 1,9 раза (кетонные продукты).
Таблица 1
Содержание продуктов окислительной модификации протеинов (ОМП) в гемолизате эритроцитов при их хранении в гемоконсерванте СРО/8ЛСМ (М±т)
Продукты ОМП, ед. опт. пл.
Объект Нейтрального характера Основного характера
исследования Альдегиды, Кетоны, 370 Альдегиды, Кетоны, 530
356 нм нм 430 нм нм
Эритроциты в исходном 0,65 ± 0,05 0,83 ± 0,04 0,78 ± 0,06 0,30 ± 0,01
состоянии
Контроль 1
(2 недели
хранения 1,18 ± 0,08 1,30 ± 0,06 1,56 ± 0,12 0,75 ± 0,06
эритроцитов без консерванта)
2 недели
хранения эритроцитов с 0,74 ± 0,08* 0,80 ± 0,02* 0,80 ± 0,06* 0,4 ± 0,03*
консервантом СРБ/8ЛвМ
Контроль 2
(3 недели
хранения 2,50 ± 0,1 2,80 ± 0,05 3,50 ± 0,22 1,83 ± 0,08
эритроцитов без консерванта)
3 недели
хранения эритроцитов с 2,10 ± 0,05** 2,22 ± 0,09** 2,67 ± 0,28** 1,11 ± 0,11**
консервантом СРБ/8ЛвМ
Примечание:
* - достоверность различия показателя по сравнению с контролем 1 (р < 0,05); ** - достоверность различия показателя по сравнению с контролем 2 (р < 0,05).
Через 3 недели хранения эритроцитов без гемоконсерванта (контроль 2) содержание альдегидных и кетонных продуктов нейтрального характера возрастало в 3,8 и в 3,4 раза по сравнению с исходными показателями эритроцитов; содержание альдегидных и кетонных продуктов основного характера увеличивалось в 4,5 и в 6,0 раз, соответственно.
В гемлизатах эритроцитов, которые хранились в течение 3-х недель в составе гемоконсерванта СРБ/БАвМ, уровень содержания всех продуктов окислительной модификации протеинов был ниже по сравнению с контролем 2, в среднем на 25,0 %.
При хранении эритроцитов в составе гемоконсерванта СРБА-1 в течение 2-х недель также наблюдалось снижение интенсивности процессов окислительной модификации протеинов по сравнению с эритроцитами, хранившимися без консервантов (табл. 2). Так, содержание альдегидных и кетонных продуктов нейтрального характера было ниже показателей контроля 1 в 1,6 и в 1,5 раза, а содержание альдегидных и кетонных продуктов основного характера ниже в 1,5 и в 2,6 раза, соответственно.
Таблица 2
Содержание продуктов окислительной модификации протеинов (ОМП) в гемолизате эритроцитов при их хранении в гемоконсерванте СРОА-1 (М±т)
Продукты ОМП, ед. опт. пл.
Объект Нейтрального характера Основного характера
исследования Альдегиды, Кетоны, 370 Альдегиды, Кетоны, 530
356 нм нм 430 нм нм
Эритроциты в исходном 0,65 ± 0,05 0,83 ± 0,04 0,78 ± 0,06 0,30 ± 0,01
состоянии
Контроль 1
(2 недели
хранения 1,18 ± 0,08 1,30 ± 0,06 1,56 ± 0,12 0,75 ± 0,06
эритроцитов без консерванта)
2 недели
хранения эритроцитов с 0,72 ± 0,06* 0,86 ± 0,01* 1,06 ± 0,14* 0,28 ± 0,04*
консервантом СРБА-1
Контроль 2
(3 недели
хранения 2,50 ± 0,1 2,80 ± 0,05 3,50 ± 0,22 1,83 ± 0,08
эритроцитов без консерванта)
3 недели
хранения эритроцитов с 2,10 ± 0,05** 2,22 ± 0,06** 2,86 ± 0,27** 1,10 ± 0,08**
консервантом СРБА-1
Примечание:
* - достоверность различия показателя по сравнению с контролем 1 (р < 0,05); ** - достоверность различия показателя по сравнению с контролем 2 (р < 0,05).
Через 3 недели хранения эритроцитов в составе гемоконсерванта СРБА-1 уровень содержания всех продуктов окислительной модификации протеинов в гемолизатах был ниже по сравнению с контролем 2, в среднем, на 24,0 %.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что при хранении эритроцитов при температуре 4 °С в течение 2-х и 3-х недель в составе гемоконсервантов СРБ/ЗЛвМ и СРБА-1 в эритроцитах существенно снижается интенсивность процессов окислительной модификации протеинов. Наиболее выраженный эффект действия консервантов обоих типов прослеживается через 2 недели хранения эритроцитов (интенсивность процессов окислительной модификации протеинов снижалась в среднем, в 2,0 раза). Через 3 недели хранения эритроцитов в составе гемоконсервантов эффективность их действия была значительно ниже (интенсивность процессов окислительной модификации протеинов снижалась только на 25,0 %). Оба гемоконсерванта характеризуются практически одинаковым уровнем эффективности действия по защите эритроцитов от процессов окислительной модификации протеинов.
Вместе с этим, заслуживает внимания тот факт, что в условиях длительного хранения эритроцитов в составе гемоконсервантов СРБ/ЗЛвМ и СРБА-1 имеет место некоторое усиление процессов окислительной модификации протеинов по сравнению с исходным состоянием эритроцитов, несмотря на то, что уровень этих процессов существенно ниже по сравнению с тем, который отмечается в отсутствии гемоконсервантов.
Это обстоятельство позволяет прийти к выводу о необходимости дальнейшего совершенствования состава гемоконсервантов СРБ/БЛвМ и СРБА-1, обогащения их такими компонентами, которые бы сводили процессы окислительной модификации протеинов в эритроцитах в условиях их длительного хранения к гораздо меньшему уровню.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Установлено, что при хранении эритроцитов практически здоровых людей в течение 2-х и 3-х недель при температуре 4 °С без гемоконсерванта усиливаются процессы окислительной модификации эритроцитарных протеинов, о чём свидетельствует существенное увеличение содержания альдегидных и кетонных продуктов окислительной модификации нейтрального и основного характера.
2. При хранении эритроцитов в составе гемоконсервантов СРБ/БЛвМ и СРБА-1 снижается интенсивность образовани продуктов окислительной модификации протеинов: в среднем, в 2,0 раза через 2 недели хранения и на 25,0 % через 3 недели хранения по сравнению с эритроцитами, которые хранились без консерванта.
3. Гемоконсерванты СРБ/БЛвМ и СРБА-1 проявляют близкий уровень эффективности по защите эритроцитов от процессов окислительной модификации протеинов и нуждаются в дальнейшем совершенствовании.
Список литературы
1. Жирбурт Е. Б. Трансфузиология / Е. Б. Жирбурт - СПБ.: Питер, 2002. - 733 с.
2. Видиборець С. В. Новые тенденции в индустрии препаратов плазмы крови в Украине и мире / С. В. Видиборець // Новое в гематологии и трансфузиологии. - 2007. - Вып.6. - С. 69-83.
3. Гемоконсервант СРБА-1 [электронный ресурс] 2018 - Режим доступа: https://www.rlsnet.ru/tw -index_id_3999.htm.
4. Гемоконсервант CPD/SAGM [электронный ресурс] 2018 - Режим доступа: https://www.lsgeotar.ru/tsta-SAGM-12183htm.
5. Владимиров Ю. А. Активные формы кислорода и азота: значение для диагностики, профилактики и терапии / Ю. А. Владимиров // Биохимия. - 2004. - Т. 69, Вып. 1. - С. 5-7
6. Тищенко М. В. Показатели обмена активных форм кислорода в защите от вирусных инфекций / М. В. Тищенко // Укр. биохим. журн. - 2005. - Т. 71, № 2. - С. 131-135.
7. Меньшикова Е. Б. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е. Б. Меньшикова -М.: Фирма «Слово», 2006. - 556 с.
8. Азизова О. А. Взаимосвязь маркеров окислительного стресса с хроническим течением хронической ишемии мозга / О. А. Азизова // Журн. неврологии и психиатрии им. С. С. Корсакова.
- 2013. - № 9. - С. 21-27.
9. Drabkin D. A simplified technique for large scale crystallization of myoglobin and hemoglobin in the crystalline / D. Drabkin // Arch. Biochem. - 1959. - V. 21. - P. 224-226.
10. Дубинина Е. Е. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод её определения / Е. Е. Дубинина, С. О. Бурмистров, Д. А. Ходов и др. // Вопросы мед. химии. - 1996.
- Т. 41, № 1. - С. 24-26.
OXIDATIVE MODIFICATION OF PROTEINS IN ERYTHROCYTES DURING
THEIR STORAGE WITH BLOOD PROTECTORS OF VARIOUS TYPES
Konoshenko S. V.1, Korostelev A. V.1, Bolshakova A. A.1, Mirmuminova Z. M.2
1V. I. Vernadsky Crimean Federal University, Simferopol, Crimea, Russian Federation
2GBUZ RK "Blood Center", Simferopol, Crimea, Russia Federation
E-mail: nataleiolkina @gmail. com
One of the problems of modern hematology and transfusiology is the search for new methods that promote to the supporting of the structural and functional state of erythrocytes during their long-term storage with a view to further using in medical practice [1-8]. The metabolic state of erythrocytes and, in particular, the oxidative modification of proteins, which reflect the destructive processes in the cells, during long-term storage of red blood cells under conditions of hemoconservation have not been sufficiently studied.
In this regard, the aim of this work was to study the processes of oxidative modification of proteins in erythrocytes during their storage with blood protectors of various types.
The material for the study was the erythrocytes of practically healthy people (donors of GBUZ RK "Blood Center", Simferopol, Crimea). The red blood cells were keeping for 2 and 3 weeks at a temperature of 4 X with blood protectors CPDA - 1 and CPD /
SAGM. Pharmacodynamics of protectors is bound for stabilizing erythrocytes, preventing hemocoagulation, supporting slightly alkaline pH value and providing red blood cells with an energy substrate.
The control was erythrocytes, which were keeped without blood protectors. Erythrocytes were hemolysated by distilled water [9], in hemolysates the proteins modification products (aldehyde and ketone derivatives of the amino acid residues of the neutral and basic character) were determined by spectrophotometrically at 356 nm, 370 nm, 430 nm and 530 nm [10].
It has been shown that after two weeks of storage of erythrocytes without a blood protector (control 1) the content of proteins modification products in hemolysates was raised at 2,0 times, an average as compared with base line values (native erythrocytes before storage).
After 3 weeks of storage of erythrocytes without protectors (control 2), the content of proteins modification products of neutral character was raised an average at 3,6 times and the content of proteins modification products of a basic character was raised an average at 5,3 times as compared with baseline indexes.
In hemolysates of erythrocytes which were keeped in the blood protectors CPD/SAGM and CPDA-1 during 2 weeks the level of all products of proteins modification products was lower than level of control 1, an average, at 1,8 times. After 3 weeks of storage of erythrocytes in the blood protectors CPD/SAGM and CPDA-1 the content of protein modification products was lower than level of control 2, an average, by 25 percentages.
At the same time, the levels of proteins modification products in hemolysates of erythrocytes, that were keeped with protectors CPD/SAGM and CPDA-1 during 2 and 3 weeks were higher as compare with the native erythrocytes (before keeping and without protectors).
Keywords: erythrocytes, proteins modification products, blood protectors, transfusiology.
References
1. Zshiburt E. B. Transfusiology (SPB., Piter, 2002).
2. Vidiborets S. V. New tendencies in industry of plasma blood preparates in Ukraine and world, New in hematology and transfusiology, 6, 69 (2007).
3. Hemoconservant CPDA-1 [electronic research] - 2018. - https://www.rlsnet.ru/tw - index_id_3999.htm.
4. Hemoconservant CPD/SAGM [electronic research] - 2018. - https://www.lsgeotar.ru/tsta-SAGM-12183htm.
5. Vladimirov Y. A. The active forms of oxygen and nitrogen: their importance for diagnoses, prophylactic and therapeutics, Biochemistry, 69, 1, 5 (2004).
6. Tischenko M. V. The indexes of active oxygen forms activity at virus infection protection, Ukr. biochem. J., 77, 2, 131 (2005).
7. Menschikova E. B. Oxidative stress. Prooxidants and antioxidants, 556 р. (Moscow, Firm "Word", 2006).
8. Azizova O. A., Korsakov S. S. Connection of oxidative stress markers with clinical properties of chronic ischemic of brain, J. of neurology and psychiatry, 9, 21 (2013).
9. Drabkin D. A. simplified technique for large scale crystallization of myoglobin and hemoglobin in the crystalline, Arch. Biochem, 21, 226 (1959).
10. Dubinina E. E., Burmistrov S. O., Hodov D. A. et al. Oxidative modification of proteins in human serum of blood, method of determination, Vopr. Med. Chem., 41, 1, 24 (1996).
