CC BY
32
© И. И. Евсюкова1,
О. В. Ковальчук-Ковалевская 1,
А. В. Вьюшина 2, Н. Э. Ордян 2
1 НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН
2 Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН, Санкт-Петербург
ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ У ЗДОРОВЫХ ДОНОШЕННЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ И ИХ МАТЕРЕЙ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБАХ РОДОРАЗРЕШЕНИЯ
УДК: 618.5-089.888.61:616-053.3-07
■ Изучены окислительная модификация белков (ОМБ) и состояние анти-оксидантной защиты (АОЗ) у здоровых доношенных новорожденных детей и их матерей после операции кесарева сечения и спонтанных родов. Установлена высокая прямая корреляционная связь между показателями ОМБ у детей и их матерей. ОМБ не зависит от способа родоразре-шения. Выявлено снижение содержания восстановленных тиолов в сыворотке крови матери и ребенка после операции кесарева сечения, что указывает на необходимость своевременного применения средств АОЗ для профилактики возможных осложнений.
■ Ключевые слова: окислительная модификация белков; тиолы; кесарево сечение; новорожденные; родильницы.
В последние годы увеличилась частота кесарева сечения и, как следствие, число детей с нарушениями ранней неонаталь-ной адаптации и последующим развитием патологических состояний [7, 9]. Известно, что формирование адаптивных реакций, определяющих оптимальный переход к самообеспечению жизнедеятельности в новых условиях окружающей среды зависит как от длительности и интенсивности неблагоприятных воздействий на плод в антенатальном периоде развития, так и от способа его рождения [3, 14, 15]. Показано, что в патогенезе соматических заболеваний и осложнений беременности, являющихся часто показаниями к оперативному родоразрешению, ведущую роль играет окислительный стресс (ОС) [1, 18, 20]. К активации свободнорадикального окисления ведет и психический стресс, который имеет место у беременных как перед операцией кесарева сечения, так и при спонтанных родах с проявлениями выраженной эмоционально-болевой реакции [10]. Увеличение при окислительном стрессе образования активных форм кислорода (АФК) и недостаточность антиокси-дантной защиты, ее специфических и неспецифических компонентов, ведут к окислительной деструкции белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот. Окислительная модификация белков (ОМБ) является одним из ранних и наиболее надежных индикаторов окислительного стресса и поражений тканей при свободнорадикальной патологии [8]. Окислительное повреждение белков, связанное с образованием радикальных центров, является причиной инактивации большой группы ферментов [21, 22], а окислительная модификация гемсодер-жащих белков ведет к изменению функциональных свойств эритроцитов и миоцитов [17, 19]. Чтобы использовать этот важный объективный показатель для прогноза адаптационных возможностей ребенка при перинатальной патологии, необходимо прежде всего знать его особенности у здоровых доношенных детей, внутриутробное развитие которых протекало без осложнений.
Цель исследования
Выяснить особенности окислительной модификации белков и состояния антиоксидантной системы у здоровых доношенных новорожденных детей и их матерей после операции кесарева сечения и спонтанных родов.
Материал и методы исследований
Обследовано 39 новорожденных детей и 39 их здоровых матерей, беременность у которых протекала без осложнений. Группу сравнения составили 33 здоровых добровольцев мужского пола в возрасте 18-20 лет.
Масса тела детей — 3365,4 ± 47,3 г, рост — 50,8 ± 0,3 см. Оценка по шкале Апгар 7-8 баллов. Ранний неонатальный период у всех детей протекал без осложнений. Максимальная убыль массы тела на 3-4-й дни жизни составила 6,8 ± 0,3 %, ее восстановление произошло у большинства к 5-6-му дням жизни. В зависимости от способа рождения ребенка были сформированы две группы. Первую составили дети (18 человек) и их матери (18 человек) после нормальных срочных родов, средняя продолжительность которых составила 6,1 ± 0,6 часов. Согласно протоколам ведения родов всем беременным в родах внутривенно вводили растворы глюкозы 10 %, аскорбиновой кислоты и унитиола. Во вторую группу вошли дети [21] и их матери [21], беременность которых завершилась плановой операцией кесарева сечения без родовой деятельности по показаниям: несостоятельность рубца на матке, миопия высокой степени, ножное предлежание плода.
Забор крови (2,0 мл) проводили сразу после рождения у ребенка из вены пуповины, а у матери — из кубитальной вены. У здоровых добровольцев также забирали кровь из кубитальной вены в утренние часы.
Для количественного определения продуктов окислительной модификации белков применяли метод, основанный на реакции взаимодействия карбонильных производных окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов, которые регистрировали спектрофотометрически [16]. Перед исследованием сыворотку разводили физиологическим раствором в 10 раз (1 : 10). Содержание белка в сыворотке крови измеряли по методу Лоури. Для исследования уровня спонтанной ОМБ к 50 мкл разведенной сыворотки приливали 0,95 мл 0,01М №-К-фосфатного буфера. Для определения стимулированной ОМБ количество буфера уменьшали до 0,75 мл. В качестве стимулирующей системы Фентона в пробу добавляли 0,1 мл смеси 10мМ Fe2+ и ЭДТА 10 Мм (1 : 1) и 0,1 мл 0,1М H2O2. Ставили две параллельные пробы, одна из которых служила контролем. Конечный объем проб составлял 1 мл. Контрольные и опытные пробы инкубировали в течение 15 минут при 37 °С. После инкубации в пробы добавляли 1 мл холодной 20 %-й ТХУ для осаждения белка, затем в опытные пробы добавляли 1 мл 0,1М 2,4-динитрофенилгидразина для окрашивания продуктов ОМБ, а в контрольные добавляли 1 мл 2М HCL. Окрашивание проводили в течение одного часа при комнатной температуре. Затем пробы центрифугировали при 200g в течение 10 минут в центрифуге К-26. Осадок
дважды промывали 2-3 мл смеси этанол: этила-цетат (1 : 1), высушивали и растворяли в 3 мл 8М мочевины с добавлением 1 капли 2М HCL.
Продукты реакции — карбонильные производные белков, образовавшиеся на стадии инициации процесса, регистрировали при длине волны 270 нм, а на стадии элонгации — при 363 нм и 370 нм. Количество продуктов ОМБ выражали в единицах оптической плотности, рассчитанной на 1 мг белка (Е/мг белка). Для оценки стимулированной ОМБ использовали величину приращения ОМБ, вычитая из значений, полученных в пробе после индукции реактивом Фентона, значения спонтанной ОМБ. Измерения проводили на спектрофотометре СФ 26.
Спонтанная (СП) ОМБ является показателем, характеризующим базальный уровень окисленных белков. Индуцированная (ИНД) ОМБ указывает на наличие субстрата для свободно-радикальных процессов, то есть как показатель устойчивости системы к переокислению
Количество восстановленных тиолов определяли по методу Соколовского В. В. и соавт. [13]. Результаты выражали в мкМ в расчете на 1 мл. Уровень восстановленных тиолов является показателем, характеризующим работу многих компонентов АОС. Во-перых они сами являются низкомолекулярными антиоксидантами, так называемыми «тушителями» АФК. Во-вторых, от их концентрации зависит активность ферментов глютатионпе-роксидазы и глютатионредуктазы, участвующих в антиоксидантной защите организма.
Статистическую обработку материала проводили с помощью стандартного приложения прикладных программ «Statistica» для персонального компьютера IP 166 MMX. Достоверность различий между средними величинами параметров определяли с помощью t-критерия Стьюдента, а для независимых выборок использовали критерий U — непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводили с использованием непараметрического критерия Спирмана.
Результаты исследований и обсуждение
Результаты исследований установили отсутствие различий и высокую прямую корреляционную связь между показателями спонтанной и индуцированной окислительной модификации белков у здоровых доношенных новорожденных детей и их матерей на стадии инициации и элонгации процесса (табл. 1). Показатели ОМБ у детей и матерей не отличаются от таковых у здоровых доноров. Можно лишь отметить более низкие значения индуцированной ОМБ на стадии элонгации процесса (363 нм) у матерей по сравнению
Таблица 1
Показатели ОМБ и уровень восстановленных тиолов сразу после рождения у детей, их матерей и у здоровых добровольцев
Показатели Группы ОМБ (Е/мг белка) Тиолы мкМ/л
270 нм 363 нм 370 нм
СП ИНД СП ИНД СП ИНД
Новорожденные дети 0,025 ± 0,005 n = 39 0,106 ± 0,008 n = 39 0,026 ± 0,004 n = 39 0,137 ± 0,015 n = 39 0,025 ± 0,005 n=24 0,143 ± 0,013 n=24 0,433 ± 0,025 n=26
Матери детей 0,028 ± 0,005 n = 39 0,117 ± 0,012 n = 39 0,027 ± 0,003 n = 39 0,129 ± 0,008 n = 39 0,027 ± 0,003 n=24 0,145 ± 0,014 n=24 0,363 ± 0,024 n=27
Здоровые добровольцы 0,034 ± 0,008 n = 33 0,119 ± 0,010 n = 33 0,029 ± 0,004 n = 33 0,163 ± 0,011 n=33 0,528 ± 0,012 n=29
Р1 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05
Р2 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,01
Р3 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,001
R 0,563 < 0,05 0,501 < 0,05 0,654 < 0,05 0,583 < 0,05 0,650 < 0,01 0,711 < 0,001 0,535 < 0,05
Примечание: достоверность различий показателей ОМБ новорожденных детей и их матерей — Р новорожденных детей и здоровых доноров — Р2, матерей и здоровых доноров — Р3. R — величина коэффициента корреляции между показателями у новорожденных детей и их матерей.
Таблица 2
Показатели ОМБ и уровень восстановленных тиолов у детей при различных способах рождения
Показатели Группы ^^ ОМБ (Е/мг белка) Тиолы мкМ/л
270 нм 363 нм 370 нм
СП ИНД СП ИНД СП ИНД
Спонтанные роды 0,025 ± 0,008 n = 18 0,109 ± 0,010 n = 18 0,025 ± 0,006 n = 18 0,117 ± 0,011 n = 18 0,025 ± 0,006 n = 14 0,133 ± 0,018 n = 14 0,397 ± 0,045 n = 9
Кесарево сечение 0,025 ± 0,007 n=21 0,104 ± 0,012 n=21 0,027 ± 0,005 n=21 0,154 ± 0,027 n=21 0,025 ± 0,007 n = 10 0,158 ± 0,017 n = 10 0,451 ± 0,029 n = 17
Р > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05
Таблица 3
Показатели ОМБ и уровень восстановленных тиолов у матерей при различных способах родоразрешения
Показатели Группы ОМБ (Е/мг белка) Тиолы мкМ/л
270 нм 363 нм 370 нм
СП ИНД СП ИНД СП ИНД
Спонтанные роды 0,027 ± 0,008 n = 18 0,102 ± 0,011 n = 18 0,026 ± 0,005 n = 18 0,124 ± 0,009 n = 18 0,023 ± 0,005 n = 14 0,132 ± 0,020 n = 14 0,301 ± 0,047 n = 10
Кесарево сечение 0,029 ± 0,007 n=21 0,130 ± 0,020 n=21 0,028 ± 0,004 n=21 0,133 ± 0,013 n=21 0,033 ± 0,005 n = 10 0,163 ± 0,018 n = 10 0,399 ± 0,023 n = 17
Р > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05
с показателями у здоровых добровольцев, что может указывать на более интенсивное участие в окислительных процессах белков, которые в силу особенностей их строения являются одному из основных ловушек активных форм кислорода.
При нормальном базальном уровне ОМБ количество восстановленных тиолов у детей и особенно у матерей оказывается значительно ниже, чем у здоровых добровольцев. Показатели у матерей более низкие, чем у их детей, при этом существует прямая корреляционная связь между уровнем восстановленных тиолов у матери и ребенка.
Спонтанная и индуцированная окислительная модификация белков на стадии инициации и элонгации процесса у здоровых доношенных новорожденных детей и их матерей не зависит от способа родоразрешения (табл. 2, 3).
Таким образом, у здоровых доношенных детей при рождении имеется такой же, как у матерей и здоровых взрослых людей внутриклеточный уровень окисленных белков, свидетельствующий о балансе между прооксидантной (ПОС) и антиоксидантной системами, между скоростью окисления и скоростью деградации окислен-
ных белков. Наши предыдущие исследования интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) и активности ферментов антиоксидант-ной защиты (супероксиддисмутазы, каталазы, глютатионпероксидазы) показали, что для здоровых доношенных детей характерен широкий диапазон значений показателей свободноради-кального окисления, причем его интенсивность коррелирует с активностью ферментов антиок-сидантной защиты (АОЗ) [8, 11]. Следовательно, система СРО/АОЗ у доношенных детей обладает достаточным совершенством и запасом прочности. Наши выводы согласуются с мнением исследователей, которые исходя из анализа содержания в сыворотке пуповинной крови различных продуктов ПОЛ и перекисного окисления белков считают, что увеличение образования АФК при окислительном стрессе в родах стимулирует начальные процессы ПОЛ новорожденных, но надежное функционирование антиокислительных механизмов не позволяет накапливаться конечным продуктам ПОЛ, а также препятствует процессу перекисного окисления белков [6].
Наши данные свидетельствуют также о том, что баланс системы СРО/АОЗ у новорожденных детей имеет место при наличии такового в единой системе мать-плацента-плод. При физиологической беременности система СРО/АОЗ у матерей достаточно эффективно реагирует на родовой стресс как при спонтанных родах, так и при кесаревом сечении. Этому, вероятно, способствует эндогенное повышение в третьем триместре беременности активности антиокислительных ферментов, в том числе и плацентарного происхождения [4].
Выявленное нами снижение содержания восстановленных тиолов в сыворотке крови после родов, более выраженное у матерей, может указывать на важную роль восстановленного глута-тиона, ферментов глютатионпероксидазы и глю-татионредуктазы в механизмах антиоксидантной защиты на ранних этапах окислительного стресса. В литературе имеются указания на снижение активности этих ферментов в эритроцитах и некоторых тканях у новорожденных детей в первые дни жизни, что считают одной из причин гипер-билирубинемии новорожденных [6]. Известно, что тиолы занимают особое место среди тканевых антиоксидантов благодаря их способности проявлять как антирадикальное, так и антиперекисное действие [1]. Являясь водорастворимыми соединениями они осуществляют свое протекторное действие в цитоплазме клетки и в плазме крови [8], которая будучи внутренней средой организма, «играет решающую роль в неспецифических и специфических реакциях защиты организма, влияя на его резистентность и реактивность».
Поэтому снижение уровня восстановленных тиолов у детей и их матерей независимо от способа родоразрешения можно рассматривать как свидетельство нормальной реактивности их организма на окислительный стресс. Однако следует учитывать тот факт, что у новорожденных уже в первые часы и дни жизни в процессе адаптации к новым условиям окружающей среды процессы СРО значительно возрастают, и у извлеченных с помощью операции кесарева сечения без родовой деятельности, возможно быстрое истощение резервов АОЗ со всеми вытекающими последствиями. Известно, что для них характерен «запаздывающий» тип адаптации [14]. В частности, отсутствует мобилизации гипофиз-адреналовой и симпатоадреналовой систем с реализацией кратковременного и длительного анти-оксидантного эффекта гуморальных продуктов (адреналина, глюкокортикоидных, половых стероидных гормонов), существенно увеличивающих ан-тиоксидантный потенциал [2, 14]. Кроме того, у них значительно снижено содержание в крови серотони-на — мощного поглотителя активных форм кислорода [5]. Поэтому низкий уровень восстановленных тиолов при рождении у этой группы детей можно рассматривать как неблагоприятный в отношении резервных возможностей их антиоксидантной системы. В равной мере это касается и матерей, у которых вследствие хирургической травмы значительно активируются процессы СРО, что может играть существенную роль в развитии ДВС-синдрома, анемии, инфекционных и других осложнений. Своевременное адекватное применение средств ан-тиоксидантной защиты с учетом ее состояния как у новорожденного ребенка, так и у его матери после операции кесарева сечения является необходимым условием профилактики возможных осложнений.
Литература
1. Абрамченко В. В., Костюшов Е. В., Щербина Л. А. Анти-оксиданты и антигипоксанты в акушерстве. — СПб: Logos,1995. — 117 с.
2. Антиоксидантные свойства некоторых гормонов / Галкина О. В. [и др.] // Биоантиоксидант: VI Международная конференция: тез. докл. — М., 2002. — С. 96-97.
3. Антонов А. Г. Исходы абдоминального родоразрешения для плода и новорожденного // Кесарево сечение. — М.: Триада-Х, 2004. — С. 190-218.
4. Биохимические механизмы формирования плаценты при физиологической и осложненной беременности / Арутюнян А. В. [и др.]; ред. Э. К. Айламазян. — СПб., 2010. — 189 с.
5. Блохина Н. А., Милютина Ю. П., Кореневский А. В. Содержание серотонина в тромбоцитах здоровых новорожденных детей // Журнал акушерства и женских болезней. — 2010. — Т. их, вып. 4. — С. 35-38.
6. Бурмистров С. О., Дубинина Е. Е., Арутюнян А. В. Состояние перекисных процессов липидов, белков и активности анти-
оксидантной системы сыворотки крови новорожденных и взрослых // Акушерство и гинекология. — 1997. — № 6. — С. 36-40.
7. Гайдуков С. Н., Атласов В. О. Кесарево сечение: прошлое и настоящее. — СПб: Изд-во Европейский дом, 2007. — 80 с.
8. Дубинина Е. Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологические и биохимические аспекты. — СПб.: Изд-во Медицинская пресса, 2006. — 400 с.
9. Кулаков В. И., Чернуха Е. А., Комисарова Л. М. Кесарево сечение. — М.: Триада-Х, 2004. — 320 с.
10. Родовой стресс и постнатальная адаптация новорожденных при кесаревом сечении / Паллади Г. А. [и др.] // Акушерство и гинекология. — 1992. — № 3-7. — С. 27.
11. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная система у здоровых доношенных новорожденных детей / Ко-сов М. Н. [и др.] // Физиология человека. — 2001. — № 3. — С. 133-136.
12. Свободнорадикальное окисление у доношенных новорожденных детей с различной патологией / Евсюко-ва И. И. [и др.] // Педиатрия. — 1996. — № 2. — С. 13-16.
13. Спектрометрическое определение тиолов в сыворотке крови / Соколовский В. В. [и др.] // Клин. лаб. диагностика. — 1997. — № 11. — С. 20-21.
14. Цибульская И. С. Клинико-физиологические основы адаптации новорожденных детей: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. — М.,1984. — 49 с.
15. Clinical characteristics, diagnosis and management of respiratory distress syndrome in full-term neonates / Liu J. [et al.] // Clin. Med. J. — 2010. — Vol. 123, N 19. — P. 2640-2644.
16. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins / Levine R. L. [et al.] // Metods Enzymol. — 1990. — Vol. 186. — P. 464-478.
17. KingN. K, WinfieldM. E. The mechanism of metmyoglobin oxidation // J. Biol. Chem. — 1963. — Vol. 238, N 4. — P. 1520-1528.
■ Адреса авторов для переписки-
Евсюкова Инна Ивановна — д. м. н., профессор, руководитель отделения физиологии и патологии новорожденных детей.
НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН.
199034, Санкт-Петербург, Менделеевская л., д. 3.
E-mail: eevs@yandex.ru.
Ковальчук-Ковалевская Ольга Владимировна — к. м. н., с. н. с. отделения физиологии и патологии новорожденных детей.
НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН.
199034, Санкт-Петербург, Менделеевская л., д. 3.
E-mail: kovkolga@yandex.ru.
Вьюшина Анна Вадимовна — к. б. н. научный сотрудник лаборатории нейроэндокринологии.
Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН.
199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6.
E-mail: sts@infran.ru.
Ордян Наталья Эдуардовна — д. б. н. зав. лаб. нейроэндокринологии.
Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН.
199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6.
E-mail: sts@infran.ru.
18. Oxidized transthyretin in amniotic fluid as an early marker of preeclampsia / Vascotto C. [et al.] // J. Proteome Res. — 2007. — Vol. 6, N 1. — P. 160-170.
19. Pedersen J. Z., Finazzi-Agro A. Protein-radical enzymes // FEBS Lett. — 1993. — Vol. 325, N 1/2. — P. 53-58.
20. Pre-eclampsia and oxygenated free radicals / Lefevre G. [et al.] // Ann. Biol. Clin. — 1977. — Vol. 55, N 5. — P. 443-450.
21. Singh H., Singh A. Effect of gamma radiation E.coli ribosomes. IIEfficiencies of inactivation by free radicals // Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. — 1983. — Vol.44, N 6. — P. 607-613.
22. Stubbe J., vanDerDonk W. A. Protein radicals in enzyme catalysis // Chem. Rev. — 1998. — Vol. 98, N 2. — P. 705-762.
Статья представлена Э. К. Айламазяном, НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН,
Санкт-Петербург
THE OXIDIZING MODIFICATION OF PROTEINS IN HEALTHY FULL TERM NEWBORNS AND THEIR MOTHERS AFTER CAESAREAN SECTION AND VAGINAL BIRTH
I. I. Evsyukova, O. V. Kovalchuk-Kovalevskaya, A. V. Vyushina, N. E. Ordyan
■ Summary: The oxidizing modification of proteins (OMP) and the state of antioxidant system has been studied in healthy full term newborns and their mothers after Caesarean section and vaginal birth. The high positive correlation between newborn's and maternal OMP is established. OMP did not depend on the way of delivery. The lowering of reductions thiols in mother and her child after Caesarean section was found, that point the way to prophylaxis of complications.
■ Key words: oxidizing modification of proteins; antioxidant system; tiols; Caesarean section; newborns; woman recently confined.
Evsyukova Inna Ivanovna — MD, professor, head of the Department of Neonatology.
D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS. 3 Mendeleyevskaya Line, 199034, St. Petersburg, Russia. E-mail: eevs@yandex.ru.
Kovalchuk-Kovalevskaya Olga Vladimirovna — PhD, Department of Neonatology.
D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS. 3 Mendeleyevskaya Line, 199034, St. Petersburg, Russia. E-mail: kovkolga@yandex.ru.
Vyushina Anna Vadimovna — PhD, Laboratory of Neuroendocrinology. Pavlov Institute of Physiology RAS. Russia, St.-Petersburg, Nab. Makarova, 6. E-mail: sts@infran.ru.
Ordyan Nataliya Eduardovna — Doctor of the biological sciences Managing laboratory of neuroendocrinology. Russia, St.-Petersburg, Nab. Makarova, 6. E-mail: sts@infran.ru.
