CC BY
40
УДК 579.6
Окисление нефти в морской среде бактериями -эпифитами бурых водорослей
А.М. Семенов1*, А.В. Оленин1, Н.С. Хохлачев2
1 МГУ имени М.В. Ломоносова, Российская Федерация, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12
2 ООО «Газпром ВНИИГАЗ», Российская Федерация, 142717, Московская обл., Ленинский р-н, с.п. Развилковское, пос. Развилка, Проектируемый пр-д № 5537, вл. 15, стр. 1
* E-mail: [email protected]
Тезисы. В статье кратко рассматриваются фундаментальные теоретические обобщения и экспериментальные результаты новых подходов, которые могут послужить основами новых технологий удаления углеводородных загрязнений как из северных почв, так и из водных, особенно солено-водных, низкотемпературных морских экосистем.
Несмотря на развитие транспортных и добывающих углеводороды (УВ) технологий, загрязнение углеводородами и их продуктами, к сожалению, не уменьшается, а защита окружающей среды, особенно экстремально уязвимых северных почвенных и, конечно, северных морских акваторий, остается актуальной. Так, по разным оценкам ежегодно только в воды Мирового океана попадает 1,1-16,0 млн т сырой нефти.
Удаление УВ нефти и ее продуктов из почвенных, особенно морских, экосистем, пусть и при активном участии в этом процессе человека, в существенной степени происходит за счет обитающих в таких природных комплексах углеводородокисляю-щих (УВО) микроорганизмов, т.е. путем самоочищения.
Хорошо известно, что в процессах самоочищения водных экосистем от нефтяных загрязнений основную роль играют планктонные микроорганизмы [1, 2]. Однако в последние годы появилось мнение о том, в процессах удаления нефти и ее продуктов в местах обильного произрастания макроскопических водорослей определенную роль могут играть эти макрофиты, в том числе фукусовые, или, как их традиционно называют, бурые водоросли [3-6]. Основанием для этого послужили факты обнаружения в талломах морских макрофитов следовых количеств углеводородов, а также теоретические умозаключения о возможном участии талломов таких водорослей в механической адсорбции и даже ограждении (абонировании») разливов нефти [7]. Подобного рода предположения привлекательны, но их экспериментальное подтверждение далеко не всегда соответствует глубине и основательности требуемых в таких случаях исследований.
В настоящей статье рассмотрены основные положения для последующей разработки технологий удаления УВ-загрязнений как из северных почв, так и из водных, особенно солено-водных, низкотемпературных морских экосистем.
Углеводородокисляющие микроорганизмы
Способность микроорганизмов потреблять углеводородные субстраты, находящиеся не только в жидком состоянии, но и в газообразном, известна давно. Последние получили даже оригинальное название - метанотрофы [8, 9].
Здесь следует отметить следующее: 1) микроорганизмы потребляют субстраты только из растворенного в воде состояния, т.е. все они являются осмотрофами; 2) поглощаемые УВ-субстраты метаболизируются окислением, т.е. им необходим кислород (альтернативные пути метаболизма ничтожны); 3) все микроорганизмы более или менее чувствительны к влиянию температуры, а способность некоторых из них функционировать при крайне высоких или низких температурах расценивается как уникальность и обозначается экстремофилией.
Ключевые слова:
окисление углеводородов, бактерии-эпифиты, бурые водоросли.
Некоторые микроорганизмы (бактерии) способны продуцировать и выделять в окружающую среду газообразные УВ, и такие бактерии также получили свое наименование - ме-таногены. Некоторые бактерии демонстрируют способность вырабатывать и более длинно-цепочечные, нелетучие углеводороды, хотя эти факты интересны только для академических познаний. Эти замечания демонстрируют большой диапазон метаболических способностей микроорганизмов и особенно бактерий.
Упомянем, что и некоторые грибы, например Cladosporium resinae (Lindau) deVries, но в основном в виде одноклеточных организмов - дрожжей, например Candida lipolitica (Harrison), также способны активно потреблять УВ-субстраты.
Итак, микроорганизмов, потребляющих углеводороды, много, они активны в широком диапазоне примерных условий, а спектр поглощаемых УВ-субстратов разнообразен. Все перечисленные способности и особенности послужили основанием для различного использования микроорганизмов (как бактерий, так и грибов) в практических целях, например для удаления углеводородов из тех мест, где они не нужны, или выращивания в значимых количествах для каких-либо полезных целей [10, 11].
Технологии удаления углеводородов из окружающей среды
Технологии удаления УВ-загрязнений в экосистемах определяются многими факторами: физико-химическими, природно-экологи-ческими и др., например концентрацией и составом УВ, типом экосистемы, временным интервалом между временем УВ-загрязнения и временем удаления загрязнений и т.д. По способу удаления загрязнений технологии подразделяются на физические (механические, т.е. сбор УВ и т.д.) и физико-химические (адсорбция, связывание поглотителями, испарение, смыв, разбавление и др.). Однако заключающей, неизбежной стадией являются биологическая и микробиологическая очистка экосистемы.
Микробиологическая стадия действительно позволяет произвести очистку экосистемы от УВ, превратив их если не в СО2 и Н2О, то хотя бы в нетоксичные, довольно инертные, безопасные для животных и человека вещества.
Биологические и микробиологические технологии удаления УВ-загрязнений из экосистем, с одной стороны, различны
и многообразны, зависят от вышеупомянутых факторов и условий, а с другой - основываются на активности бактериального и грибного сообщества, т.е. микробных сообществ (МС). Это или активация аборигенного УВ-окисляющего МС, или/и внесение (интродукция) высокоактивного УВ-окисляющего МС. Последний способ как наиболее эффективный получил широкое применение в практике удаления УВ-загрязнений в экосистемах.
Материалы и методы
Образцы бурых водорослей были собраны в зоне литорали Белого моря в районе биологической станции МГУ имени М.В. Ломоносова (Кандалакшская губа Белого моря) при температуре морской воды 12-13 °С в летний период года в ретроспективе 2000-2015 гг.
Для выявления микробного пейзажа поверхностей бурых водорослей готовили препараты-отпечатки с разных участков таллома. Кусочки таллома размером около 1-2 см2 прикладывали к стерильному предметному стеклу и выдерживали во влажной камере в течение двух суток. После этого отпечатки окрашивали акридином оранжевым (разведение 1:104) и микроскопировали под люминесцентным микроскопом (Микмед-2 (Люмам РПО-11)).
Накопительную культуру УВО микроорганизмов получали на минеральной среде (г/л): KNO3 - 4,0; KH2PO4 - 0,6; Na2HPO4 - 1,4; MgSO4 - 0,8; NaCl - 20; рН - 7,0; нефть бакинская - 2 %. Посевным материалом служили фрагменты таллома фукусовых водорослей ((Fucus sp.), использованные ранее для получения препаратов-отпечатков. Накопительную культуру УВО микроорганизмов инкубировали на качалке (280-300 об/мин) при температуре 22-28 °С. За ее развитием наблюдали визуально и микроскопически. Через семь суток накопительную культуру помещали в холодильник при 10-12 °С. Далее ее подвергали длительной, в течение нескольких месяцев, селекции путем долговременной инкубации на среде с нефтью с регулярными пересевами 1 мл накопительной культуры в новую порцию среды с нефтью, с тем чтобы получить устойчивое углеводородокисляющее микробное сообщество (УВОМС).
Отобранный образец УВОМС рассеяли на агаризованную среду с нефтью и выделили 10 штаммов чистых культур УВО микроорганизмов.
Кроме отдельных чистых культур была получена ассоциация микроорганизмов путем смыва всех колоний, выросших на чашках Петри. Эту ассоциацию использовали в качестве посевного материала для получения биомассы, которая затем была использована в ми-крокосмном эксперименте на Белом море.
Ассоциацию микроорганизмов выращивали на той же минеральной среде с нефтью. Биомассу концентрировали центрифугированием, и густую пастообразную массу хранили в замороженном виде. Перед началом эксперимента биомассу размораживали и разводили в стерильной морской воде до титра 11010. Суспензию микроорганизмов иммобилизовали на нитроцеллюлозных фильтрах диаметром 47 мм, размер пор - 0,45 мкм.
Микрокосмный эксперимент проводили в пластиковых аквариумах с протоком морской воды и имитацией физико-химических и биологических условий акватории Белого моря. Скорость протока регулировалась таким образом, чтобы соответствовать скорости колебания воды в прибойной зоне.
Фильтры с иммобилизованной на них биомассой пропитывали нефтью в разной концентрации. Использовали 100%-ную нефть и ее разведения (с помощью дизельного топлива) в 10 и 100 раз. В одну часть аквариума вносили экспериментальные фильтры с иммобилизованными бактериями и пропитанные разными концентрациями нефти, в другую -контрольные фильтры, пропитанные только разными концентрациями нефти без биомассы. Эксперимент проводили в двух повторностях.
Микроскопирование отпечатков таллома выявило его обильное заселение
Рис. 1. Микробный пейзаж отпечатка поверхности таллома фукуса
микроорганизмами (рис. 1). Микробное сообщество поверхностных участков таллома представлено главным образом бактериями. С глубиной бактериальное обилие снижается при сохранении морфологического разнообразия, а количество микроскопических водорослей увеличивается. Эпифитное микробное сообщество представлено как одиночными клетками, так и многочисленными микроколониями, что указывает на активный рост микроорганизмов на поверхности фукуса. Морфологически бактериальное разнообразие представлено коками в виде одиночных клеток и цепочек, разными по размерам - от мелких до крупных, палочками и многочисленными полумесяцем изогнутыми клетками (рис. 1 и 2). Хорошо различимы бактерии с коринеформной морфологией. Множество бактериальных клеток представлено толстыми яйцеподобными клетками. Многие палочки содержат светящиеся включения, расположенные по концам клетки или в середине.
Встречаются микроскопические водоросли, а также клетки по размерам, соответствующие дрожжам. В связи с тем что прокрашивание клеток акридином оранжевым на одном и том же препарате происходило неодинаково, можно полагать, что клетки находились в разном физиологическом состоянии, и часть из них, по-видимому, была представлена мертвыми организмами. Таким образом, выявлены обильные и разнообразные эпифиты Fucus sp.
В микрокосмном эксперименте было установлено, что эпифитные микроорганизмы обладают значительной УВО способностью. Первое изменение в цветности фильтров было
Рис. 2. Морфологическое разнообразие микроорганизмов - эпифитов фукуса
обнаружено уже через двое суток. Через четверо суток фильтры с иммобилизованной биомассой УВ-окисляющих бактерий и пропитанные нефтью с концентрацией 10 и 1 % практически обесцветились. Процент деструкции составил 82 и 98 % соответственно. Фильтр с адсорбированной на нем биомассой УВ-окисляющих бактерий и пропитанный 100%-ной нефтью на шестой день эксперимента значительно посветлел по краям, однако в целом сохранял свою ярко коричневую окраску. Процент деструкции нефти составил 14,8 %.
Таким образом, исследования показали, что поверхность фукусовых водорослей покрыта обильным и морфологически разнообразным микробным сообществом. При использовании таллома бурых водорослей в качестве посевного материала на минеральной среде с нефтью была получена активная накопительная культура УВ-окисляющих микроорганизмов. Обилие микроорганизмов на поверхности фукусов существенно превосходит плотность, которую можно обнаружить в морской воде. В связи с этим можно предположить, что морские макроскопические водоросли служат носителем, а может быть и источником или даже инкубатором микроорганизмов, в том числе и УВ-окисляющих. Однако окисление углеводородами нефти осуществляют микроорганизмы, а не водоросли, ими колонизированные.
Метод определения деградации нефти по динамике обесцвечивания пропитанных нефтью фильтров, на которых ранее было иммобилизовано УВОМС, после его калибрования позволяет получать устойчивые количественные результаты. Вместе с тем следует отметить, что скорость деградации нефти зависит не только от ее концентрации, но и соотношения концентрации нефти и биомассы микроорганизмов, ее окисляющих. Если при использовании неразведенной нефти соотношение с иммобилизованной на фильтре биомассой микроорганизмов принять равным 1:1, то при разведении нефти соотношение с биомассой становилось 1:0,1 и 1: 0,01, что, конечно же, ускоряло процесс окисления.
***
Макрофиты Fucus sp. имеют обильное и разнообразное эпифитное микробное сообщество, при этом среди эпифитов имеются УВ-окисляющие микроорганизмы.
На основе эпифитов бурых водорослей от-селектировано микробное сообщество, способное к активному окислению нефти в условиях, имитирующих экосистему Белого моря.
Метод определения УВ-окисляющей активности микроорганизмов с использованием фильтров после его технологической модификации может быть применен в промышленных масштабах.
Список литературы
1. Белоусова Н.И. Деструкция нефтепродуктов различной степени конденсации микроорганизмами при пониженных температурах / Н.И. Белоусова,
A.Н. Шкидченко // Прикладная биохимия и микробиология. - 2004. - Т. 40. - № 3. -С. 312-316.
2. Перетрухина И.В. Определение скоростей биодеградации нефтяных углеводородов в воде литорали Кольского залива / И.В. Перетрухина,
B.В. Ильинский, М.Ю. Литвинова // Вестник Мурманского государственного технического университета. - 2006. - № 5. - С. 828-832.
3. Binark N. Oil pollution of marine algae /
N. Binark, K.C. Guven, T. Gezgin et al. // Bull. Environ. Contam. Toxicol. - 2000. - V.64. -P. 866-872.
4. Bokn T. Effects of diesel oil and subsequent recovery of commercial benthic algae / T. Bokn // Hydrobiol. - 1987. - V. 51. - P. 277-284.
5. Gamila H.A. Algal bioassay for evaluating the role of algae in bioremediation of crude oil: I-isolated strains / H.A. Gamila, M.B.M. Ibrahim // Bull. Environ. Contam. Toxicol. - 2004. - V. 73. -
P. 883-889.
6. Ibrahim M.B.M. Algal bioassay for evaluating the role of algae in bioremediation of crude oil: freshwater phytoplankton assemblages. / M.B.M. Ibrahim, H.A. Gamila // Bull. Environ. Contam. Toxicol. - 2004. - V. 73. - P. 971-978.
7. Воскобойников Г.М. Исследования макрофитов Баренцева моря: история и направления // Материалы международной научной конференции и VII Школы по морской биологии. - Ростов н/Д., 2008. - С. 73-75.
8. Практикум по микробиологии /под
ред. А.И. Нетрусова. - М.: Академия, 2005. -608 с.
9. Шлегель Г. Общая микробиология / Г. Шлегель. - М.: Мир, 1987. - 568 с.
10. Кураков А.В. Биоиндикация и реабилитация экосистем при нефтяных загрязнениях / А.В. Кураков, В.В. Ильинский, С.В. Котелевцев и др. - М.: Графикон, 2006. - 336 с.
11. Мурзаков Б.Г. Экологическая биотехнология для нефтегазового комплекса (теория и практика) / Б.Г. Мурзаков. - М.: Изд-во МГУ, 2005. - 200 с.
Marine oxidation of oil by the bacteria being the epiphytes of brown algae
A.M. Semenov1*, A.V. Olenin1, N.S. Khokhlachev2
1 Lomonosov Moscow State University, Bld. 1, Est. 12, Leninskiye gory, Moscow, 119234, Russian Federation
2 Gazprom VNIIGAZ LLC, Bld. 1, Estate 15, Proyektiruemyy proezd # 5537, Razvilka village, Leninsky district,
Moscow Region, 142717, Russian Federation
* E-mail: [email protected]
Keywords: oxidation of hydrocarbons, epiphyte bacteria, brown algae.
Abstract. The paper briefly discusses the basic theoretical generalizations and experimental results of new
technologies for removing hydrocarbon contaminants from both northern soils and water low-temperature marine
ecosystems, especially the saline-water ones.
References
1. BELOUSOVA, N.I. and A.N. SHKIDCHENKO. Destruction of differently condensed oil products by germs in conditions of lower temperatures [Destruktsiya nefteproduktov razlichnoy stepeni kondensatsii mikroorganizmami pri ponizhennykh temperaturakh]. Prikladnaya biokhimiya i mikribiologiya. 2004, vol. 40, no. 3, pp. 312-316. ISSN 0555-1099. (Russ.).
2. PETRUKHINA, I.V., V.V. ILINSKIY and M.Yu. LITVINOVA. Determining velocities ofbiological degradation for oil hydrocarbons in waters of Kola Bay littoral [Opredeleniye skorostey biodegradatsii neftyanykh uglevodorodov v vode litorali Kolskogo zaliva]. Vestnik of Murmansk State Technical University. 2006, no. 5, pp. 828-832. ISSN 1560-9278. (Russ.).
3. BINARK, N., K.C. GUVEN, T. GEZGIN et al. Oil pollution of marine algae. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 2000, vol. 64, pp. 866-872. ISSN 0007-4861.
4. BOKN, T. Effects of diesel oil and subsequent recovery of commercial benthic algae. In: Developments in Hydrobiology. 1987, vol. 51, pp. 277-284.
5. GAMILA, H.A. and M.B.M. IBRAHIM. Algal bioassay for evaluating the role of algae in bioremediation of crude oil: I-isolated strains. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 2004, vol. 73, pp. 883-889. ISSN 0007-4861.
6. IBRAHIM, M.B.M. and H.A. GAMILA. Algal bioassay for evaluating the role of algae in bioremediation of crude oil: freshwater phytoplankton assemblages. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 2004, vol. 73, pp. 971978. ISSN 0007-4861.
7. VOSKOBOYNIKOV, G.M. Exploration of macrophytes in the Barents Sea: history and trends [Issledovaniya makrofitov Barentseva morya: istoriya i napravleniya]. In: Proc. of the international sci. conf. and VII School on Marine Biology. Rostov-na-Dony, 2008, pp. 73-75. (Russ.).
8. NETRUSOV, A.I. (ed.). Practicum on microbiology [Praktikum po mikrobiologii]. Moscow: Akademiya, 2005. (Russ.).
9. SCHLEGEL, H. General microbiology [Obshchaya mikrobiologiya]. Translated from the Geraman. Moscow: Mir, 1987. (Russ.).
10. KURAKOV, A.V., V.V. ILINSKIY, S.V. KOTELEVTSEV et al. Biological benchmarking and rehabilitation of ecosystems in case of oil pollutions [Bioindikatsiya i reabilitatsiya ekosistem pri neftyanykh zagryazneniyakh]. Moscow: Grafikon, 2006. (Russ.).
11. MURZAKOV, B.G. Environmental biotechnology for oil-gas industry (theory and practice) [Ekologicheskaya biotekhnologiya dlya neftegazovogo kompleksa (teoriya i praktika)]. Moscow: Moscow State University Publishers, 2005. (Russ.).
