CC BY
39
УДК 577.15:615.832.9:57.084.1
О.В. Шило, В.В. Ломако, Л.М. Самохіна*
ОБМЕЖЕНИЙ ПРОТЕОЛІЗ В УМОВАХ ШТУЧНОГО ГІПОМЕТАБОЛІЧНОГО СТАНУ У ХОМ’ЯКІВ
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини нАн України (м. Харків) *дУ «Інститут терапії ім. Л.т.Малої АМн України» (м. Харків)
Роботу виконано в рамках планової теми «Вивчення реакцій функціональних систем організму при різних видах холодових впливів в нормі, вікових періодах та патологічних станах» ДР № 0100и003477.
Вступ. Протеоліз, зокрема обмежений, є особливою формою біологічного контролю, яка служить пусковим механізмом багатьох біологічних процесів і забезпечує швидку фізіологічну відповідь організму на умови, що змінюються, або на сигнал, що поступає зовні. Це найбільш швидкий, простий, не потребуючий енергетичних витрат шлях утворення активних пептидів або білків з різними фізіологічними функціями, що дозволяє досягти швидкої генералізованої відповіді організму на вплив зовнішніх факторів. Важливим способом контролю протеолізу є присутність в організмі специфічних білків-інгібіторів, що можуть зв’язувати протеолітичні ферменти ендо- і екзогенного походження, зокрема, а-1-інгібітора протеїназ (а-1-ІП) та а-2-макроглобуліна (а-1-МГ) [1]. Узгоджене функціонування всіх механізмів регуляції активності протеїназ дає можливість здійснювати щільний, чіткий часовий і просторовий контроль фізіологічних процесів та їх швидку реалізацію.
Раніше нами було показано [7], що в динаміці розвитку і виходу із штучного гіпометаболичного стану (ШГМС) за методом Анджуса-Бахмет’єва-Джайя у щурів (негібернаторів) спостерігаються різноспрямовані зміни показників протеолітичної активності. Особливу чутливість до факторів, що індукують ШГМС (низька температура, гіпоксія і гіперкапнія), виявили нетрипсиноподібні протеїнази (НТПП) і а-2-МГ.
Поширеність гіпометаболічних станів у природі, унікальна стійкість до охолодження, гіпоксії і гіперкапнії тварин, що володіють генетично детермінованою стратегією гібернації, а також потреба створення безпечних, оборотних ШГМС роблять актуальними дослідження молекулярних механізмів, що лежать в основі розвитку таких станів і відновлення після них. Тому вивчення особли-
востей реакції системи протеїназа-інгібітор протеїназ організму тварин, здатних до гібер-нації, на вплив фізичних факторів-тригерів природного ГМС (гіперкапнія, гіпоксія, низька температура середовища, затемнення та інш.) є важливим загальнобіологічним завданням. Відомо, що хом’яки є факультативними гібернаторами і за сприятливих умов можуть впадати у торпідний стан [8].
Тому метою роботи було вивчення особливостей реакцій обмеженого протеолізу в системі протеїназа-інгібітор протеїназ у хом’яків при ШГМС і на етапах відновлення.
Об'єкт і методи дослідження. Експерименти проведені на 5-6-місячних золотавих хом’яках самцях (Mesocricetus auratus) (масою 85-95 г) у зимовий період. Тварин утримували в умовах віварію на стандартному раціоні з додаванням зерен пшениці і на-сінння соняшника. Дослідження проведені відповідно до біоетичних вимог до роботи з експериментальними хребетними тваринами і схвалених комітетом з біоетики при ІПКіК НАНУ. ШГМС викликали за методом Анджуса-Бахмет’єва-Джайя [3, 7]: тварин у герметично закритій судині (2 дм3) поміщали на 3 год у темну холодову камеру (3-5 0С). Температуру тіла (Тт) реєстрували за допомогою мідь-константанової термопари, приєднаної до вольтметра В7-21А. Тварин поділили на 4 групи (п=6): 1 - контроль, 2 - шГмС, 3 - ранній етап відновлення (через 2 год після ШГМС), 4 - відстрочений етап відновлення (через 24 год після ШГМС).
Тварин виводили з експерименту шляхом декапітації. У сироватці крові, без’ядерних фракціях тканин гіпоталамуса (ГТ), кори мозку (КМ), стовбура мозку (СМ), мозочка, легень, серця, печінки і нирок визначали загальну активність протеїназ (ЗАП), активність нетрипсиноподібних протеїназ (НТПП), рівень а-1-ІП і а-2-МГ високочутливим (10-9-10-10 г) ферментативним методом, розробленим у ДУ «Інститут терапії ім. Л.Т.Малої АМН України» (м. Харків) [4]. Рівень досліджуваних показників оцінювали за зміною активності маркерного ферменту (пероксидаза хрону) і роз-
раховували в мікроеквівалентах задіяних хімічних зв’язків [2] за 1 хв. При проведенні досліджень використовували полістиролові стріпові планшети (Росія) і одноканальний мікроспектрофотометр Stat Fax (США).
Статистичну обробку даних проводили методом однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA).
Результати досліджень та їх обговорення.
Поступове наростання гіпоксії, гіперкапнії, на фоні низької температури (3-5 0С) і темряви сприяли розвитку у тварин ШГМС [2], що супроводжувалося зниженням температури тіла (Тт) до 16+1 0С.
Комбінована дія факторів гібернації не приводила до достовірних змін загальної протеолітичної активності (рис. 1), активності НТПП (рис. 2), а1-ІП (рис. 3), та а2-МГ (рис. 4), тоді як у негібернаторів (щурів) за даними попередніх досліджень [7] було виявлено тенденцію до активації протеолізу (був підвищений в усіх вивчених зразках) на тлі незмінної активності одного з основних інгібіторів-а-1-ІП, достовірного пригнічення активності НТПП у тканинах, крім легень, нирок, мозочка і СМ та збільшення активність іншого інгібітору-а-2-МГ.
Тут та на рис. 2-4.
Ось ординат - мл/л хв Ось абсцис: 1 - кора мозку, 2 - гіпоталамус, 3 - мозочок, 4 - стовбур мозку, 5 - сироватка крові, 6 - легені, 7 - серце, 8 - печінка, 9 -нирки.
Рис. 2. Активність нетрипсиноподібних протеїназ.
12 Контроль
Н Через 2 год після ШГМС □ Через 24 год після ШГМС J
Рис. 3. Активність a-1-інгібітора протеїназ.
Рис. 4. Активність a-2-макроглобуліну.
Через 2 год після переводу тварин в умови з нормальним газовим складом і кімнатною температурою відбувалися самостійне
відігрівання, поступове відновлення
рухової і пошукової активності, грумінга, Тт підвищувалась до 33, 5±0, 5 0С. При цьому зміни активності вивчених протеїназ та їх інгібіторів в порівнянні з показниками при ШГМС виявилися недостовірними.
Через 24 год після виходу з ШГМС показники протеолітичної активності також не відрізнялись від контрольного рівня.
Таким чином, достовірних змін в реакціях обмеженого протеолізу у відповідь на ШГМС не виявлено, тому можна припустити що система протеїназа-інігібітор протеїназ хом'яків виявилася стійкою до комбінованої дії наростаючої гіпоксії, гіперкапнії та охолодження на відміну від негібернаторів (щурів), у яких за нашими попередніми даними [7] були виявлені значні зміни в активності вивченої системи. Це також, ймовірно, може свідчити про збереження балансу між активністю протеолітичних ферментів і їх інгібіторів у тварин, здатних до гібернації.
Відомо, що ШГМС супроводжується рядом змін в організмі, характерних для розвитку природних гипометаболических станів [3, 6]. Для досягнення ШГМС застосовують різні фізичні фактори, суміші біоактивних речовин, газів та їх комбінації [3, 9], більшість з яких є потенційно небезпечними для організму, не здатного до гібернації. Так, гіпоксія, що розвивається, сама по собі й у сполученні з холодовим впливом та гіперкапнією, приводить до зсуву set point температурного гомеостазу [11, 13], і значного зниження Тт [5, 8], що може викликати адаптивні модифікації білкових молекул [15], зміну активності різних ферментативних систем [8], сприяти синтезу гіпоксія-індукуючого фактора (HIF-1a) та білків теплового шоку (БТШ) [14].
Гіпоксія вважається одним з провідних чинників, що сприяють зануренню як в ШГМС [3], так і у зимову сплячку. Хоча занурення гібернаторів у зимову сплячку в лабораторних умовах відбувається без зміни газового складу повітря, в експериментах на золотавих хом’яках в польових умовах показано, що в норі при першому зануренні в сплячку концентрація О2 падає до 10 %, а СО2 зростає до 10, 8 % [12]. Надалі газовий склад повітря у норі нормалізується і залишається стабільним на протязі всього періоду зимової сплячки. При розвиненні ШГМС концентрації О2 и СО2 сягають подібних значень [3]. Тим не менш, однократне занурення у ШГМС в наших експериментах не призводило до прояву гібернаційного фенотипу на рівні системи протеїназа-інгібітор протеїназ, що може свідчити про недостатню тривалість або кратність використаного нами впливу.
Крім того, слід зазначити, що в популяції факультативних гібернаторів (хом’яки, бурундуки та інш.) виявляються від 20 до 30 % особин [10, 16], що не за яких умов не занурюються у зимову сплячку. Отже, відсутність
вірогідних змін в активності системи протеїназа-інгібітор протеїназ, відзначена в наших експериментах, може бути пов’язана з індивідуальною чутливістю різних за фенотипом особин до комбінації факторів, що сприяють зануренню у ШГМС. Цю особливість слід врахувати і в подальших експериментах на хом'яках Mesocricetus auratus.
Висновки. Система протеїназа-інгібітор протеїназ хом’яків виявилась стійкою
до однократного впливу комбінації факторів, що сприяють розвитку штучного гіпометаболізму за методом Анджуса-Бахмет’єва-Джайя. В ранній (через 2 год) та відстрочений (через 24 год) етапи після ШГМС в коливанні активності протеїназ та їх інгібіторів вірогідних змін не виявлено.
Перспективи подальших розробок у даному напрямку. Планується дослідити стан системи протеїназа-інгібітор протеїназ у хом’яків при природному гіпометаболічному стані - зимовій сплячці, а також з урахуванням фенотипічних особливостей факультативних гібернаторів та після кількох занурень у ШГМС.
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. Веремеенко К.Н. Протеолиз в норме и при патологии / Веремеенко К.Н., Голобородько О.П., Кизим А.И. - К.: Здоров'я, 1988. - 200 с.
2. Віноградова Р.П. Одиниці вимірювання активності ферментів // Український біохімічний журнал. - 1999. - Т. 71, № 2. - С. 96-99.
3. Мельничук С.Д. Гіпобіоз тварин (молекулярні механізмі та практичне значення для сільського господарства і медицини) /Мельничук С.Д., Мельничук Д.О. - К., 2007.
- 220 с.
4. Самохина Л.М. Активность протеиназ и а-1-ингибитора при холодовом стрессе /Самохина Л.М., Стародуб Н.Ф.// Украинский биохимический журнал.-1993. - Т. 65, № 5.
- С. 41-46.
5. Слоним А.Д. Гетеротермия и физиологический гомеостаз. Эволюционные аспекты гипобиоза и зимней спячки [ред. Е.М. Кребса] - Л.: Наука, 1986.-С. 44-48.
6. Тимофеев Н.Н. Нейрохимия гипобиоза и пределы криорезистентности организма /Тимофеев Н.Н., Прокопьева Л.П. - М.: Медицина, 1997.-208 с.
7. Шило А.В. Активность протеиназ и их ингибиторов при искусственном гипометаболическом состоянии у крыс / Шило А.В., Ломако В.В., Самохина Л.М., Бабийчук Г.А. // Проблемы криобиологии.- 2004.-№ 2.-С. 17-27.
8. Эволюционная физиология [ред. акад. Е.М. Кребса]. -Л.: Наука, 1979. - Ч. 1. - 603 с.
9. Andrews M. T. Advances in molecular biology of hibernation in mammals // BioEssays. - 2007. - Vol. 29.-Р. 431-440.
10. Gautier H. Neuromodulators and hypoxic hypothermia in the rat /Gautier H., Murariu C. // Respiration Physiology. - 1998.
- Vol. 112.-315-324.
11. Kondo N. Circannual Control of Hibernation by HP Complex in the Brain / Kondo N., Sekijima T., Kondo J., Takamatsu N., Tohya K., Ohtsu T. // Cell.-2006. - Vol. 125, № 4. - P. 161-172
12. Kuhnen G. O2 and CO2 concentrations in burrows of euthermic and hibernating golden hamsters // Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. - 1986.-Vol. 84, №. 3.-P. 517-522.
13. Kuhnen G. Effects of acute hypoxia and/or hypercapnia on body temperatures and cold induced thermogenesis in the golden hamster /Kuhnen G., Wloch B., Wünnenberg W. //
Journal of Thermal Biology. - 1987.-Vol. 12, Issue 2.-P. 103- 15. Storey K.B. Gene Expression and Protein Adaptations in
107. Mammalian Hibernation / Storey K.B., Storey J.M. / Life
14. Rissanen E. Temperature regulates hypoxia-inducible in the Cold [Ed. by G.Heldmier, M.Klingenspor].-Austria,
factor-1 (HIF-1) in a poikilothermic vertebrate, crucian carp Jungholz, 2000.-P. 303-313.
(Carassius carassius) / Rissanen E., Tranberg H. K., Sollid 16. Tamura Y. Phase-specific central regulatory systems of
J., Nilsson G. E., Nikinmaa M. // The Journal of Experimental hibernation in Syrian hamsters /Tamura Y., Shintani M.,
Biology. - 2009.-P. 994-1003. Nakamura A., Monden M., Shiomi H. // Brain Research. -
2005.-Vol. 1045. - P. 88 - 96
УДК 577.15:615.832.9
ОГРАНИЧЕННЫЙ ПРОТЕОЛИЗ ПРИ ИСКУССТВЕННОМ ГИПОМЕТАБОАИЧЕСКОМ СОСТОЯНИИ У
хомяков
Шило А.В., Ломако В.В., Самохина Л.М.
Резюме. Изучено влияние искусственного гипометаболического состояния (ИГМС), вызываемого методом Анджуса-Бахметьева-Джайя, на систему протеиназа-ингибитор протеиназ у факультативних гибернаторов хомяков. Система оказалась устойчивой к однократному комплексному действию факторов, способствующих погружению в ИГМС. На этапах восстановления (через 2 и 24 ч) достоверных изменений также не отмечено.
Ключевые слова: система протеиназа ингибитор протеиназ, искусственное гипометаболи-ческое состояние, хомяки.
UDC 577.15:615.832.9
LIMITED PROTEOLYSIS IN HAMSTERS AT ARTIFICIAL HYPOMETABOLIC STATE
Shilo A.V., Lomako V.V., Samokhina L.M.
Summary. The effect of artificial hypometabolic state (AHMS) attained by Andjus-Bakhmetiev-Giaja methods on proteinase-inhibitor proteinase system of golden hamsters have been studied. It was found that the single effect of combined action of hypoxia, hypercapnia and cold that promote immersion to AHMS had no effect on proteinase-inhibitor proteinase system. No reliable changes on the activity of proteinase-inhibitor proteinase system were fond at the recovery stages (in 2 and 24 hours).
Key words: proteinase-inhibitor proteinase system, artificial hypometabolic state, hamster.
Стаття надійшла 18.11.2009 р.
