CC BY
27центрациях катализатора свыше 0,4 моль/л линейность зависимости проявляется в меньшей степени.
Таким образом, порядок реакции по катализатору в диапазоне Сн =0,05-0,30 моль/л для всех исследованных реакций близок к единице. В кинетических расчетах принят первый порядок по катализатору. Следует отметить, что для реакции МеОН с ТБ на обезвоженном катионите КУ-2><8 авторами [4] был установлен второй порядок по катализатору.
Эффективные константы скорости, отнесенные к концентрации катализатора для реакции ТБ с шо-пропанолом, н-пропанолом, н-бутанолом и изо-бутанолом при температуре 347 К приведены в табл. 2.
Таблица 2
Константы скорости дегидратации трет-бутанола (Т=347 К)
Table 2. Rate constants of the tert-butanol dehydration (T=347 K)
Учитывая сильное влияние воды на скорость реакции, становится очевидной необходимость удаления ее из зоны реакции, что может
Кафедра химии
быть достигнуто путем азеотропной отгонки ее с подходящим растворителем. Нами показано, что при проведении синтеза БТБЭ в кипящем углеводородном растворителе (гексан, петролейные эфиры) за несколько часов в виде азеотропной смеси выделяется расчетное количество воды.
ЛИТЕРАТУРА
1. Шмелев И.Г. Автореф. дисс. ... канд. хим. наук. Казань. 2003. 118 с.
2. Вейганд - Хильгетаг. Методы эксперимента в органической химии. М.: Химия. 1968. 944 с.
3. Павлов С.Ю., Горшков В.А., Чуркин В.Н. // Хим. пром-ть. 1995. № 5-6. С. 256-263.
4. Рожков C.B., Бобылев Б.Н., Фарберов М.И. и др // Кинетика и катализ. 1977. T. XVIII. Вып. 6. С. 1429-1435.
5. Бобылев Б.Н., Рожков C.B., Фарберов М.И. и др. Деп. ВИНИТИ. 1978. №2383-78.
6. Рожков C.B., Бобылев Б.Н., Фарберов М.И. и др // Кинетика и катализ. 1979. T. XX. Вып. 3. С. 640-644.
7. Gates B.C., Rodriguez W. // J. Catalysis. 1973. V. 31. P. 27-31.
8. Thornton R., Gates B.C. // J. Catalysis. 1974. V. 34. P. 275-287.
9. Одабашян Г. В. Лабораторный практикум по технологии основного органического и нефтехимического синтеза. М.: Химия. 1982. 240 с.
10. Кузьмин В.З., Кутузова Г.С., Бондырева К.К). // Катализ в промышленности. 2007. № 5. С. 13 - 18.
11. Полянский Н.Г., Сапожников В.К. Успехи химии. 1977. T. XLVI. Вып. 3. С. 445-476.
k -1G3, [ я • ] л/(моль-с) Pr i-Pr Bu i-Bu
2,30 ± 0,10 1,10 ± 0,10 2,94 ± 0,07 3,2В ±0,06
УДК 541.135.5
A.B. Меринов*, A.B. Кашевский*, А.Ю. Сафронов*, С.Б. Пинский"
ОДНОВРЕМЕННОЕ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОКСИДА АЗОТА(П)
И МОЛЕКУЛЯРНОГО КИСЛОРОДА
( Иркутский государственный университет, Иркутский государственный медицинский университет) E-mail: dean@chem.isu.ru
Показана принципиальная возможность электрохимического определения оксида азота(П) и молекулярного кислорода при их совместном присутствии в модельных и биосистемах. Используя вольтамперометрические измерения на модифицированном нафионом стеклоуглеродном электроде, удалось количественно зафиксировать концентрационные зависимости исследуемых газов.
Ключевые слова: оксид азота (II), кислород, электрохимическое определение
Хорошо известно, что выполнение многих важных функций в живых организмах зависит от содержания в них оксида азота(П) [1]. Процессы, идущие в биосистемах с участием N0, весьма разнообразны: в физиологических концентрациях
N0 снижает кровяное давление, ослабляет свертывание крови, стимулирует активность макрофагов и, кроме того, выступает в качестве антиопухолевого агента. Однако действие оксида азота(П) двояко и зависит от его концентрации: при фото-
химия и химичесю\я технология 2010 том 53 вып. 3
47
вых концентрациях он оказывает противоопухолевое действие, разрушая опухолевые клетки, подавляя цикл Кребса, транспорт электронов и синтез ДНК, а при пикомолярных является промотором опухолевого роста [1-6]. Поэтому возможность осуществления мониторинга NO in vivo -чрезвычайно сложная, но очень важная задача, особенно для современной приборной медицины.
Не меньшее значение для организмов имеет другой простой неорганический субстрат - молекулярный кислород. Основное количество потребляемого человеком кислорода расходуется на выработку энергии и окислительный катаболизм субстратов, и только относительно небольшая его часть (2-5%) переходит в активированные кислородные метаболиты, которые затем частично ис-
-
ромолекул [7].
Необходимо отметить тот факт, что биохимические циклы кислорода и монооксида азота сопряжены друг с другом. В частности, синтез N0 в организме происходит с потреблением кислорода в реакции ферментативного окисления L-аргинина [4]. Известно, что кислород является ингибитором N0, окисляя его до аниона N0 '2 [7]. С другой стороны, нитрит-анион служит своеобразным «неприкосновенным запасом», благодаря которому возможно неферментативное продуцирование оксида азота при действии неспецифических восстановителей [8]. Важной особенностью последнего механизма синтеза N0 является то, что его реализация возможна при понижении содержания кислорода в ткани, когда регуляторная функция N0 должна быть задействована максимально быстро и точно локализована.
Возможность перманентного контроля изменения содержания обоих газов непосредственно в биосистеме при воздействии на нее извне (например, во время операционного вмешательства) дает не только могучий инструмент для регулирования контролируемых содержаний N0 и Ог, но и позволяет иногда предотвратить очень серьезные последствия резкого изменения концентраций этих газов, вплоть до летального исхода.
Электрохимические и электроаналитические методы определения как N0, так и Ог в биологических образцах известны давно (первые работы по знаменитому электроду Кларка появились еще в 50-е годы прошлого века [9,10]) и в
-
шенствуются. При этом общая тенденция замены металлических электродов на модифицированные углеродные материалы в полной мере реализована и для определения кислорода [11], и при измере-
ниях содержания N0 [12]. Параллельно делались успешные попытки полярографического определения кислорода в сугубо медицинских целях на немодифицированных платиновых электродах [13]. Наконец, недавно [14] реализована попытка совместного определения молекулярного кислорода и оксида азота, правда, для этого использовались два независимых сенсора.
Целью данной работы явилась попытка
-
та(П) и молекулярного кислорода электрохимиче-
-
сутствии как в модельных системах, так и на реальном биоматериале.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовались: КН2Р04 («о.с.ч.», перекристаллизованый), NaOH («х.ч.»), концентрированная НС1 («ч.д.а.»), FeS04-7H20 («х.ч.»), KN02 («х.ч.»), 5% водноспиртовой раствор нафиона фирмы Aldrich (США). В качестве фонового электролита применялся фосфатно-щелочной буферный раствор (ФЩБ) с концентрацией КН2Р04, равной ОДМ (рН 7,2).
Оксид азота (II) получали по стандартной методике [15], его очистка проводилась последовательным пропусканием газа через три склянки с крепким раствором NaOH и склянку с бидистил-лированной водой. Газообразный кислород с содержанием основного вещества 99,7% (Арника-ПромСервис, Россия) был использован в работе без дополнительной очистки.
В качестве биологического образца применялась ткань щитовидной железы человека, предоставленная кафедрой госпитальной хирургии Иркутского государственного медицинского
-
.
В работе использовалась вольтамперомет-рическая установка на базе потенциостата IPC-pro (Россия). Эксперименты проводились в трехэлек-тродных ячейках, где в качестве электрода сравнения выступал хлорсеребряный электрод BAS RE - 1В (США), вспомогательным электродом служила платиновая сетка.
Перед каждым экспериментом подготовку рабочего стеклоуглеродного электрода проводили следующим образом: рабочую поверхность полировали, затем выдерживали электрод в ультразвуковой ванне в течение 7 минут для удаления с поверхности твердых частиц и промывали биди-стиллированной водой. Ячейку и другую стеклянную посуду обрабатывали горячей смесью концентрированной серной кислоты с 30% раствором пероксида водорода, затем многократно промыва-
ли горячей проточной водой и бидистиллирован-ной водой.
Для повышения селективности и эффективности работы электродов в условиях присутствия посторонних веществ (в частности, для работы в сложных по составу модельных и биосредах), поверхность рабочего электрода (площадь поверхности 0,283 см2) модифицировали нафионом. После нанесения на поверхность электрода 10 мкл 5% водноспиртового раствора нафиона. электрод сушили при комнатной температуре в течение 40 минут, а затем в сушильном шкафу при 60°С в течение того же времени. После этого электрод выдерживали в фосфатно-щелочном буферном растворе в течение суток для набухания полимера. При этом функциональные группы нафиона де-протонируются и полимерная пленка приобретает отрицательный заряд. Толщина нафионовой пленки составляет 16 мкм [16].
Для создания инертной атмосферы через раствор в электрохимической ячейке пропускали аргон в течение 10 минут. Измерения проводились в интервале потенциалов от -0,8 до +1,0 В. Скорость развертки потенциала во всех экспериментах составляла 20 мВ/с. Значения потенциалов указаны в шкале хлорсеребряного электрода сравнения. Все измерения проводились при комнатной температуре. В этих условиях, согласно [16, 17], концентрация используемого в работе водного раствора, насыщенного N0, составляет величину 2,0 мМ, а кислородом - 1,1 мМ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для оценки принципиальной возможности совместного определения оксида азота(П) и кислорода в исследуемых условиях были предварительно измерены вольтамперограммы для каждого компонента отдельно. Для этого буферный раствор насыщали в течение 10 минут N0, после чего были произведены потенциодинамические измерения (рис. 1, кривая 2). Затем буферный раствор, насыщенный N0, продували в течение 5 минут кислородом и вновь измеряли вольтамперограммы (рис. 1, кривая 3).
Если на кривой 2 заметен пик анодного тока при потенциале 690 мВ, соответствующий окислению N0 [18], то на кривой 3 появляется пик катодного тока при потенциале -450 мВ, соответствующий восстановлению кислорода [9], при этом пик анодного тока сохранился, хотя ток в пике и стал меньше. Причина уменьшения анодного тока окисления N0 хорошо известна [7] и сводится к тому, что часть N0 в этих условиях окисляется до нитрит-иона, электрохимическому окислению которого препятствует нафионовая
пленка [12]. Таким образом, совместное определение оксида азота(П) и кислорода вольтамперо-метрическим методом в исследуемых условиях принципиально возможно.
I, мкА
Рис. 1. Вольтамперограммы, измеренные на модифицированном нафионом стеклоуглеродном электроде в 0.1 М ФЩБ (рН 7.2) при последовательном насыщении раствора оксидом азота и 02: (1) - фоновый ФЩБ; (2) - раствор после насыщения NO в течение 10 мин. (CNO = 2 мМ); (3) - тот же раствор после 5 мин. барботирования 02; (4) - вольтамперограмма, измеренная на "сухом" образце щитовидной железы Fig. 1. Voltammogramms measured on theNafion modified glassy carbon electrode in0.1M PBS (pH 7.2) at the sequential solution saturation with nitric oxide and 02: (1) - background PBS; (2) - solution after 10 min. NO saturation (CNO = 2 mM);
(3) - the same solution after 5 min. 02 bubbling; (4) -voltammogramm measured on the "dry" sample of thyroid gland
Необходимо отметить, что в исследуемых условиях некоторое количество кислорода из раствора подвергается восстановлению в области отрицательных потенциалов даже при анодной поляризации электрода (заметный катодный ток в области потенциалов -800 -300 мВ наблюдается на анодной ветви кривой 3). Поэтому при дальнейших количественных измерениях потенциал
-
ем 0 мВ, выполняя поляризацию электрода по программе 0 мВ • +1000 мВ • -800 мВ, а концентрацию кислорода оценивали по катодному току в катодном полуцикле вольтамперограммы.
В соответствии с поставленной задачей, для одновременного определения молекулярного кислорода и оксида азота in vivo необходимо проводить вольтамперометрические измерения не только в растворах простого состава, но и в комплексных средах, включающих в свой состав сложные многокомпонентные фрагменты биосред и сами биосреды, элементы которых, с одной стороны, не мешают измерениям аналитических сигналов интересующих нас газов и в изучаемых условиях электрохимической активностью не обладают, а с другой стороны, имеют достаточную
электропроводность для проведения электрохимических измерений. На рис. 1 представлена вольтамперограмма, измеренная на образце ткани щитовидной железы. Измерение вольтамперограммы, соответствующей кривой 4, проводилось следующим образом: на часовое стекло, предварительно закрепив на нем вспомогательный электрод, поместили образец ткани железы, после чего на ткань поместили рабочий электрод и электрод сравнения, добившись прямого контакта рабочих поверхностей электродов с тканью. Собранная таким образом система обозначена ниже как «сухая» ячейка. Как видно из рисунка, кривые 1 и 4 и по качественным, и по количественным токовым характеристикам (величина тока заряжения) очень похожи. Это свидетельствует об адекватности получаемых на ткани характеристик и, таким образом, о пригодности объекта для прямых вольтам-перометрических измерений.
I, мкА 6
6 5
/
-3
-6
-900
-300
0
300
900
ном на "сухом" образце железы (рис. 1, кривая 4). Таким образом, вольтамперометрическое тестирование на модифицированном нафионом стеклоуг-леродном электроде однозначно показало, что ткань щитовидной железы человека является вполне электрохимически адекватным объектом.
I, мкА
-6
-900
-300
300
900
Е, мВ
Рис. 2. Вольтамперограммы, измеренные на модифицированном нафионом стеклоуглеродном электроде в 0.1 М ФЩБ (рН 7.2) после добавления аликвот ФЩБ. насыщенного NO; CNO (мкМ): (1) - 0 (фон). (2) - 30. (3) - 95. (4) - 190. (5) - 305. (6)-430
Fig. 2. Voltammogramms measured on the Nafion modified glassy carbon electrode in0.1M PBS (pH 7.2) after additions of
the NO saturated PBS aliquots; CNO (цМ): (1) - 0 (background). (2) - 30. (3) - 95. (4) - 190. (5) - 305. (6) - 430
Другой потенциально используемой для измерений формой образца ткани стал ее гомоге-нат. Для его изготовления ткань железы измельчали, замораживали в жидком азоте, растирали в агатовой ступке и добавляли в образец буферный раствор в соотношении 0,8 г ткани железы на 2,4
мл буферного раствора. Результаты вольтамперо-
-
ной железы показали сходство, а в области положительных потенциалов - идентичность измеренных вольтамперограмм с результатом, получен-
Е, мВ
Рис. 3. Вольтамперограммы, измеренные на модифицированном нафионом стеклоуглеродном электроде в 0.1 М ФЩБ (рН 7.2) после добавления аликвот ФЩБ. насыщенного 02; с (мкМ): (1) - 0 (фон). (2) - 14. (3) - 48. (4) - 98. (5) - 159.
(6) - 225
Fig. 3. Voltammogramms measured on theNafion modified glassy carbon electrode in 0.1M PBS (pH 7.2) after additions of
the 02 saturated PBS aliquots; q (цт): (1) - 0 (background),
(2) - 14, (3) - 48, (4) - 98, (5) - 159, (6) - 225
-
трационных зависимостей изучаемых газов на модифицированном стеклоуглеродном электроде и
результаты, демонстрирующие возможность ка-
зов, приведены на рис. 2-4. Для измерения приведенных на рис. 2 и 3 вольтамперных кривых в буферный раствор добавляли либо соответствующие аликвоты раствора, насыщенного NO (рис. 2), либо аликвоты раствора, насыщенного кислородом (рис. 3). Результаты экспериментов ожидаемо показали, что с увеличением содержания в буферном растворе NO и кислорода ток в соответствующих пиках симбатно растет. По полученным
данным был построен градуировочный график
-
творенных газов (рис. 4). В соответствии с приведенными результатами, в измеряемой системе данные зависимости практически линейны, а чувствительность определения составила 4,8 hA/mkMno и 18,4 нА/мкМс>2 для оксида азота и кислорода, соответственно. Используя калибровочный график, была произведена оценка содер-
3
0
3
0
жания N0 и кислорода в системе, результаты вольтамперометрического измерения которой приведены на кривой 3 рис. 1. Согласно полученным данным, концентрация оксида азота(П) в системе составила 320 мкМ, а кислорода - 151 мкМ.
Рис. 4. Калибровка модифицированного нафионом стеклоуг-леродного рабочего электрода в 0.1 М ФЩБ по содержанию в растворах оксида азота (1) и молекулярного кислорода (2). Точки на графике соответствуют величине тока в пиках
вольтамперограмм, приведенных на рис. 2 и 3 Fig. 4. Nafion modified glassy carbon electrode calibration against nitric oxide (1) and molecular oxygen (2) in0.1M PBS. Plotted points correspond to the current values in the peaks of voltammograms shown in the fig. 2 and 3
Приведенные результаты показали, что при использовании предлагаемого модифицированного стеклоуглеродного электрода, как сенсорного, электрохимические методы могут ока-
заться весьма эффективными для одновременного контроля содержания кислорода и оксида азота как в модельных системах, так и в более сложных биосистемах и их фрагментах.
ЛИТЕРАТУРА
1. Methods in Enzymology, vol.359: Nitric Oxide, Part D/Ed. by E.Cadenas. EPacker' 2002. 465 p.
2. Лобышева II.IL, Сереженков B.A., Ванин А.Ф. // Биохимия. 1999. Т. 64. Вып. 2. С. 194-200.
3. Ванин АФ. // Вестник РАМН. 2000. №4. С. 3-5.
4. Меньшикова Е.К, Зенков Н.К., Реутов ВП. // Биохимия. 2000. Т. 65. Вып. 4. С. 485 - 503.
5. Викторов II.В. // ВестникРАМН. 2000. №4. С. 5 - 9.
6. Hofseth L.J. et al. // J. Free Radical & Medicine. 2003. V. 34. No 8. P.955-968.
7. Меньшикова Е.Б. и др. // Окислительный стресс. Про-оксиданты и антиоксиданты. М.: Слово. 2006. 559 с.
8. Lundberg J.O., Weitzberg E. // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005. V. 25. P. 915-922.
9. Clark L.C. et al. // J. Appl. Physiol. 1953. V.6. P. 189-193.
10. Clark LC. // Aim. NY Acad. Sci. 1962. V. 102. P. 29-45.
11. Тарасевич MP. Электрохимия углеродных материалов. M.: Наука. 1984. 253 с.
12. Malinski Т., Taha Z. // Nature. 1992. V. 358. P. 676-679.
13. Пинский С.Б., Калинин АП., Белобородов В.А Диагностика заболеваний щитовидной железы. М.: Медицина. 2005. С. 125-127.
14. Hurst R.D., Clark J.B // Sensors. 2003. V.3. P.321-329.
15. Карякин Ю.В., Ангелов ILII. Чистые химические вещества. М.: Химия. 1974. С. 23-24.
16. Kashevskii A.V., SafronovA.Y., Ikeda O. // J. Electroanal. Chem. 2001. V. 510. P. 86-95.
17. Lopez-Lopez G. et al. // J. Molecular Pharmacology. 2004. V. 65. N4. P. 851-859.
18. Kitajima A. et al. // Electrochemistry. 1999. V. 67. N 7. P. 784-788.
Кафедра общей и неорганической химии
