CC BY
33
УДК 575.224.22
Ключевые слова: MyoD1, северокавказская порода, мутация, мясная продуктивность, секвенирование, SNP
Key words: MyoDl, North Caucasus breed, mutation, meat efficiency, sequencing, SNP
Телегина Е. Ю., Криворучко А. Ю., Скрипкин В. С., Яцык О. А.
ОДНОНУКЛЕОТИДНЫЕ ЗАМЕНЫ В ГЕНЕ MYOD1 У ОВЕЦ СЕВЕРОКАВКАЗСКОЙ ПОРОДЫ
SINGLE-NUCLEOTIDE SUBSTITUTIONS IN MYOD1 GENE OF NORTH CAUCASUS
BREED SHEEPS
ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный аграрный университет» Адрес: 355017, Россия, г. Ставрополь, Зоотехнический пер., д.12
Stavropol State Agrarian University, Federal State Educational Institution of Higher Education Address: 355017, Russia, Stavropol, Zootechnicheskiy ln., 12
Телегина Елена Юрьевна, аспирант каф. частной зоотехнии, селекции и разведения животных. E-mail: telegina.helen@yandex.ru. Тел. (903) 409-24-72
Telegina Elena Y., Post-Graduate Student of the Dept. of Private Animal Husbandry, Selection and Breeding. E-mail: telegina.helen@yandex.ru. Tel. +7 (903) 409-24-72
Криворучко Александр Юрьевич, д. б. н., профессор каф. физиологии, хирургии и акушерства. E-mail: rcvm@yandex.ru. Тел. (8652) 28-67-38
Krivoruchko Alexander Y., Doctor of Biological Sciences, Professor of the Dept. of Physiology, Surgery and Obstetrics.
E-mail: rcvm@yandex.ru. Tel. +7 (8652) 28-67-38 Скрипкин Валентин Сергеевич,к. в. н., доцент каф. физиологии, хирургии и акушерства. E-mail: skripkinvs@mail.ru. Тел.(8652) 28-67-38 Skripkin Valentin S., PhD in Veterinary Sciences, Associate Professor of the Dept. of Physiology, Surgery and Obstetrics. E-mail: skripkinvs@mail.ru. Tel. +7 (8652) 28-67-38 Яцык Олеся Андреевна, аспирант каф. физиологии, хирургии и акушерства. E-mail: malteze@mail.ru. Тел. (918) 757-14-58 Yatsyk Olesya A., Post-Graduate Student of the Dept. of Physiology, Surgery and Obstetrics. E-mail: malteze@mail.ru. Tel. +7 (918) 757-14-58
Аннотация. Целью данной работы явилось исследование структуры гена MyoD1 у овец северокавказской породы. Объектом исследования служили баранчики в возрасте одного года (n=30). Секвенирование осуществляли с использованием геномного секвенатора GS Junior (Roche, USA). Полученные в результате секвенирования фрагменты картировали на референсный геном Ovis aries сборки oviAri3 (National Center for Biotechnology Information. Genome. (2012) Ovisaries (sheep), 2015) с помощью программного обеспечения GS Reference Mapper v2.9 (Roche, USA).
В ходе работы выявлено 29 однонуклеотидных замен (SNP), 18 из них обнаружены впервые. Ранее описанные полиморфизмы в основном находятся в 5' фланкирующей области, и только одна замена c.325T>C - во втором экзоне. SNP c.325T>C и c.483C>T являются синонимичными и не приводят к аминокислотной замене. Частота встречаемости SNP у северокавказской породы оказалась близкой к иранским и марокканским породам овец. Необходимо проводить дальнейшее исследованиеструктуры гена MyoD1, структуры белка, влияние SNP на прижизненные показатели мясной продуктивности.
Summary.The aim of this work was to study the structure of the MyoDl gene among sheep breed of North Caucasus. We has investigated 30thsheep male (n=30) at the age of one year. A sequencing was performed with using a genomic sequencer GS Junior (Roche, USA). The resulting sequencedfragments mapped at the reference genome assembly Ovis Aries oviAri3 (The National Center for Biotechnology Information. Genome. (2012) Ovis Aries (sheep), 2015) by software GS Reference Mapper v2.9 (Roche, USA).
During the work were identified 26 single nucleotide substitutions (SNP), 16 replacements were found firstly. The previously described polymorphisms mainly locate into 5' flanking region and only one replacement c.325T> C locate into second exon. SNP c.325T> C and C.483C> T are synonymous and do not lead to amino acid replacement. The frequency of occurrence of SNP among North Caucasus breed sheeps is close to Iranian and Moroccan sheeps. It is necessary to continue further study of the structure of the gene MyoD1, protein structure and effect of SNP at the in vivo characteristics of meat productivity.
Введение
Актуальным направлением в генетике является изучение генетического полиморфизма у сельскохозяйственных животных, связанного с показателями мясной продуктивности. Благодаря маркер-ассоциирован-ной селекции - высокопродуктивному методу улучшения отбора и прогнозирования продуктивных качеств сельскохозяйственных животных, возможно ускорить селекционную работу и уменьшить связанные с ней затраты [8].
В настоящее время активно ведутся поиски SNP (single nucleotide polymorphism) -однонуклеотидных замен у разных видов продуктивных животных. Особенности последовательности четырех нуклеотидов отражают различия между отдельными животными, породами, популяциями. Это генетические маркеры, часть которых может быть связана с количественными и качественными признаками животных [3].
Северокавказская порода - одна из наиболее распространенных и высокопродуктивных полутонкорунных пород овец [1]. Вывели ее путем скрещивания ставропольских овцематок с баранами Ромни-марш и Линкольн. Овцы этой породы удачно сочетают в себе высокую доходность шерсти со скороспелостью и убойными качествами. Характеризуются хорошей шерстной и мясной продуктивностью. Разводят северокавказских овец преимущественно в Северо-Кавказском федеральном округе, а также в некоторых центральных регионах России [2].
Ген MyoDl является одним из генов-кандидатов для определения полиморфизмов, ассоциированных с интенсивностью роста и развития, и, как следствие, с показателями мясной продуктивности у овец [5].Он играет ключевую роль в миогенезе и связан с развитием мышц у млекопитающих. Влияет на дифференцировку мышечных клеток [10].
Было изучено влияние полиморфизма гена MyoDl у крупного рогатого скота на качество и нежность мяса, на показатели живого и убойного веса [9].
У свиней доказано существенное воздействие замен в гене MyoDl на мышечные волокна и мясные качества, также выявлена
взаимосвязь SNP гена MyoDl с мраморно-стью мяса [7].
У уток было исследовано влияние гена MyoDl на рост мышц и развитие организма в целом [4].У овец позитивная корреляция обнаружена между уровнем экспрессии гена MyoDl и весом охлажденной туши [6].
В связи с этим, целью нашего исследования явилось изучение структуры гена MyoDl у овец северокавказской породы.
Материалы и методы
Исследование было проведено на базе ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный аграрный университет». Объектом исследования служили баранчикив возрасте одного года северокавказской породы (n=30).
Геномная ДНК выделялась из образцов крови, полученных из яремной вены в асептических условиях. Пробы крови отбирали в пробирки Vacutainer® со стабилизатором ЭДТА. ДНК выделяли из 0,2 мл крови c использованием набора Pure Link Genomic DNA MiniKit (Invitrogen, USA). С целью выявления мутаций в генах проводили целевое обогащение и последующее секвенирование исследуемых фрагментов ДНК. Для обогащения целевых регионов использовали технологию Nimble Gen (Roche, USA). Зонды для целевых регионов были разработаны в сотрудничестве с фирмой Roche Nimble Gen (USA). Библиотеки фрагментов ДНК исследуемых животных, подготовленные в соответствии с протоколом Rapid Library Preparation Method Manual, подвергали процедуре обогащения с использованием зондов Nimble GenSeqCapEZ Developer Libraries в соответствии с протоколом производителя (Roche, USA).
Процедуру моноклональной амплификации готовых обогащенных целевых регионов ДНК проводили по стандартному протоколу PCR Amplification Method Manual, Lib-L (Roche, USA).
Секвенирование осуществляли с использованием геномного секвенатора GS Junior (Roche, USA). Полученные в результате сек-венирования фрагменты картировали на ре-ференсный геном Ovis aries сборкиoviAri3 (National Center for Biotechnology Information.
Genome. (2012) Ovisaries (sheep), 2015) с помощью программного обеспечения GS Reference Mapper v2.9 (Roche, USA). Для описания обнаруженных однонуклеотидных замен (SNP) использовалась номенклатура HGVS (Human Genome Variation Society).
Результаты исследований
В результате проведенной работы нами было обнаружено 29 однонуклеотидных замен (SNP) в кодирующих и регуляторных участках гена MyoD1 северокавказской породы овец (табл. 1). Из них 18 SNP были выявлены впервые, остальные 11 внесены в базу данных National Center for Biotechnology Information.
Ранее описанные полиморфизмы в основном находятся в 5' фланкирующей области, и только одна замена c.325T>C - во втором эк-зоне. Четыре из обнаруженных нами SNPc-1608C>T, c.-1603G> T, c.-1578G> A, c.-932G> T расположены в 5' фланкирующей области, и 14 SNP (c.243C>A, c.244C>T, c.246G>T, c.253G>T, c.259G>C, c.261C>T, c.269C>G, c.274C>A, c.276C>G, c.277C>A, c.279C>T, c.281C>A, c.287C>A, c.483C>T) - в области второго экзона.
Из 15-ти замен, находящихся в области второго экзона, две(c.325T>C и c.483C>T) являются синонимичными, 13 SNP приводят к аминокислотной замене. Некоторые несинонимичные SNP расположены в паре внутри одного триплета. В гене MyoD1 мы обнаружили четыре триплета модифицированных таким образом: c.244C>T и c.246G>T; c.259G>C и c.261C>T; c.274C>A и c.276C>G; c.277C>A и c.279C>T.
Среди выявленных у северокавказской породы мутаций 48 % составляют транзиции и 52 % - трансверсии. У большинства животных чаще встречаются замены в области второго экзона в гомозиготном мутантном варианте. Замены c. -1807C>T, c.-1447C>T встречаются у трех животных в гетерозиготном мутантном варианте. Редкими мутациями являются c.-1607C>A, c.-932G>T, c.243C>A. Замены c.-1578G> A, c.-880G>A, c.-637C>T, c.325T>C встречаются у овец северокавказской породы только совместно и только в гетерозиготном варианте.
Обсуждение результатов
Изучена структура гена MyoD1 у северокавказской породы овец. В российских и зарубежных источниках отсутствует информация о влиянии структуры гена MyoD1 на мясную продуктивность овец.
Согласно нашим исследованиям, ген MyoD1 имеет множество вариаций. Наибольшее количество SNP расположены в области второго экзона в гетерозиготном му-тантном варианте и в основном обнаружены впервые. Подобная структура гена у северокавказской породы подтверждает то, что в ходе селекционной работы дикая форма гена MyoD1 была практически полностью исключена из популяции. Закрепление мутаций в гомозиготной форме может быть следствием отбора пар для скрещивания, где носители мутантных аллелей отличались наилучшими качествами.
У овец северокавказской породы мы обнаружили две группы замен (c.-1578G> А, c.-880G> А, с.-637С> Т, с.325Т> С) и (с. -1807С>Т, с.-1447С>Т) присутствующие в гетерозиготном варианте и только совместно. У марокканских пород замены (с.-1807С>Т,с.-1447С>Т)также присутствуют сцепленно и только совместно, что позволяет предположить их сцепленное наследование. SNP c.-932G>T, с.-1607С>А, с.243С>А обнаружена у небольшого количества животных. Поэтому конкретных выводов, связанных с этой мутацией, сделать невозможно.
Частота встречаемости однонуклеотид-ных замен в гене MyoD1 северокавказской породы овец оказалась близкой к иранским и марокканским породам овец ^ЬЕшетЫ). В области экзона расположена SNP с.325Т>С, которая имеет частоту встречаемости 7 %. Это меньше, чем у иранских овец, на 13 %, а у марокканских - на 8 %. Частота встречаемости замены с.-637С>Т северокавказской породы одинаковая с марокканскими породами овец, но меньше на 5 %, чем у иранских овец. Также одинаковую частоту встречаемости (13 %) с марокканскими породами овец имеют такие замены, как с.-1447С>Т, с. -1807С>Т. Процент распространения мутации c.-2112C>G северокавказской породы овец - 7 %, что меньше, чем у марокканских (19 %) и иранских (10 %). SNP c.-880G>A, c.-1235G>A северокавказской
Таблица 1.
Мутации в гене MyoD1 у овец Северокавказской породы
Наименование Идентифи- Позиция Амино-
№ SNP по номен- катор в базе на хро- кислотная Аллель Генотип
клатуре HGVS №СВ1 мосоме замена
1 c.-2112C>G rs404884444 34373234 G C GG GC CC
0,93 0,07 0,87 0,13 0,00
2 c.-1807C>T ге597385459 34372929 G A GG GA AA
0,9 0,1 0,8 0,2 0,00
3 c.-1806A>G rs424553252 34372928 T C TT TC CC
0,17 0,83 0,00 0,33 0,67
4 c.-1687T>C rs406278149 34372809 A G AA AG GG
0,37 0,63 0,2 0,33 0,47
5 c.-1608C>T нет в базе 34372730 G A GG GA AA
0.00 1,00 0,00 0,00 1,00
6 c.-1607C>A rs596561479 34372729 G T GG GT TT
0,97 0,03 0,93 0,07 0,00
7 c.-1603G>T нет в базе 34372725 C A CC CA AA
0,00 1,00 0,00 0,00 1,00
8 c.-1578G>A нет в базе 34372700 C T CC CT TT
0,93 0,07 0,87 0,13 0,00
9 c.-1447C>T rs425767816 34372569 G A GG GA AA
0,9 0,1 0,8 0,2 0,00
10 c.-1235G>A ге412308724 34372357 C T CC CT TT
0,63 0,37 0,47 0,33 0,2
11 c.-932G> T нет в базе 34372054 C A CC CA AA
0,97 0,03 0,93 0,07 0,00
12 c.-880G> A rs412662330 34372002 C T CC CT TT
0,93 0,07 0,87 0,13 0,00
13 c.-637C> T rs409662616 34371759 G A GG GA AA
0,93 0,07 0,87 0,13 0,00
14 c.-412G> T rs420129038 34371534 C A CC CA AA
0,9 0,1 0,8 0,2 0,00
15 c.243C> A нет в базе 34370879 F/L G T GG GT TT
0,93 0,07 0,93 0,00 0,07
16 c.244C> T нет в базе 34370878 G A GG GA AA
Ш/С 0,07 0,93 0,07 0,00 0,93
17 c.246G> T нет в базе 34370876 C A CC CA AA
0,07 0,93 0,07 0,00 0,93
18 c.253G> T нет в базе 34370869 О/С C A CC CA AA
0,00 1,00 0,00 0,00 1,00
19 c.259G> C нет в базе 34370863 C G CC CG GG
О/Ш 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00
20 c.261C> T нет в базе 34370861 G A GG GA AA
0,00 1,00 0,00 0,00 1,00
21 c.269C> G нет в базе 34370853 Р/Ш G C GG GC CC
0,00 1,00 0,00 0,00 1,00
22 c.274C> A нет в базе 34370848 Р/Т G T GG GT TT
0,00 1,00 0,00 0,00 1,00
Наименование Идентифи- Позиция Амино-
№ SNP по номен- катор в базе на хромо- кислотная Аллель Генотип
клатуре HGVS ЖВ1 соме замена
23 c.276C> G нет в базе 34370846 P/T G C GG GC CC
0,00 1,00 0,00 0,00 1,00
24 c.277C> A нет в базе 34370845 G T GG GT TT
P/T 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00
25 c.279C> T нет в базе 34370843 G A GG GA AA
0,00 1,00 0,00 0,00 1,00
26 c.281C> A нет в базе 34370841 T/N G T GG GT TT
0,00 1,00 0,00 0,00 1,00
27 c.287C> A нет в базе 34370835 A/D G T GG GT TT
0,00 1,00 0,00 0,00 1,00
28 c.325T> C ге599663516 34370797 L A G AA AG GG
0,93 0,07 0,87 0,13 0,00
29 c.483C> T нет в базе 34370639 A G A GG GA AA
0,00 1,00 0,00 0,00 1,00
породы овец имеют близкий процент распространения мутаций с иранскими и марокканскими породами овец. Частота встречаемости мутации с.-1607С>А у северокавказской породы овец является близкой (4 %) к иранским и марокканским овцам, однако мутантной у северокавказской породы является аллель Т, а у иранских и марокканских овец - аллель А. Это свидетельствует о том, что в одной позиции может встречаться три различных аллеля.
Заключение
Исследование показало вариабельность гена MyoD1. Из 29-ти выявленных полиморфизмов 18 обнаружены впервые. Пятнадцать однонуклеотидных замен расположены в области экзона, следовательно, могут влиять на структуру кодируемого пептида. В области экзона расположены замены в гомозиготном мутантном варианте, кроме SNP с.325Т>С, которая обнаружена в гетерозиготном варианте. Исследования должны быть направлены на изучение влияния обнаруженных SNP на структуру и активность кодируемой аминокислоты, а также на мясную продуктивность северокавказских пород овец.
Список литературы
1. Квитко, Ю. Д. Мясная продуктивность северокавказской мясошерстной породы овец и её помесей [Текст] / Ю. Д. Квитко, И. И. Черкасова // Сборник науч. трудов Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства. - 2007. -№ 1-1. - С. 77-79.
2. Отраднов, В. А. Продуктивность овец северокавказской породы [Текст] / В. А. Отраднов, Ю. Н. Фролов // Овцы, козы, шерстяное дело. - 2005. -№ 1. - С.40.
3. Яковлев, А. Ф. ДНК-технологии в селекции сельскохозяйственных животных [Текст] / А. Ф. Яковлев, М. Г. Смарагдов, В. С. Матюков // Достижения науки и техники АПК. - 2011. - № 8. - С. 49-50.
4. Bhuiyan, M., Kim, N., Cho, Y. Identification of SNPs in MYOD gene family and their associations with carcass traits in cattle [Текст] / M. Bhuiyan, N. Kim, Y. Cho [et al.] // Livestock Science. - 2009. - Vol. 26. -P. 292-297.
5. Gerber, A. N., Klesert, T. R., Bergstrom, D. A. Two domains of MyoD mediate transcriptional activation of genes in repressive chromatin: A mechanism for lineage determination in myogenesis [Текст] / A. N. Gerber, T. R. Klesert, D. A. Bergstrom [et al.] // Genes & Development. -1997. - Vol. 11. - № 4. - P. 436-450.
6. Knoll, A., Nebola, M., Dvorak, J. Detection of a DdelPCRRFLP within intron 1 of the porcine MYOD1 (MYF3) locus [Текст] / A. Knoll, M. Nebola, J. Dvorak [et al.] // Animal Genetics. - 1997. - Vol. 28. - P. 321.
7. Lоbo, A. M. B. O., Guimaraes, S. E. F., Paiva, S. R. Differentially transcribed genes in skeletal muscle of lambs [Текст] / A. M. B. O. Lоbo, S. E. F. Guimaraes, S. R. Paiva [et al.] // Livestock Science. - 2012. - № 3. -P.31-41.
8. Lee, E. A., Kim, J.M., Lim, K.S. Effects of variation in porcine MYOD1 gene on muscle fiber characteristics, lean meat production, and meat quality traits [Текст] / E. A. Lee, J. M. Kim, K. S. Lim [et al.] // Meat Science. -2012. - Vol. 92. - P. 36-43.
9. Wu, Y., Pi, J. S., Pan, A. L. An SNP in the MyoD1 gene intron 2 associated with growth and carcass traits in three duck populations [Текст] / Y. Wu, J. S. Pi, A. L. Pan [et al.] // Biochemical Genetics. - 2012. - Vol. 50. - № 12. - P. 898-907.
10. Yang, Z. Q., Qing, Y., Zhu, Q. Genetic effects of polymorphisms in myogenic regulatory factors on chicken muscle fiber traits [Текст] / Z.Q. Yang, Y. Qing, Q. Zhu [et al.] // Journal of Animal Sciences. - 2015. - Vol. 28. -№ 6. - P. 782-787.
