CC BY
9
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2020
УДК 616.353.1-006:612.014.24 (574)
Д. Б. Бабенко, Е. А. Колесникова, С. И. Колесниченко, И. А. Кадырова, И. В. Коршуков, В. Б. Сирота, Л. Л. Ахмалтдинова, А. А. Тур муха мбетова
ОДНОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПОЛИМОРФИЗМЫ 12 ХРОМОСОМЫ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ РАКОМ, У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ПОПУЛЯЦИИ ЦЕНТРАЛЬНОГО КАЗАХСТАНА
Медицинский университет Караганды (Караганда, Казахстан)
Колоректальный рак (КРР) является одной из наиболее часто диагностируемых злокачественных опухолей в мире и Республике Казахстан. В настоящее время к этиологии КРР относят изучаемые генетические вариации и факторы риска окружающей среды. Данное исследование проводилось с целью поиска полиморфизмов, связанных с развитием колоректальной аденокарциномы у представителей популяции Центрального Казахстана. Значительное количество полиморфизмов, связанных с колоректальным раком, было локализовано в 12 хромосоме.
Материалы и методы: исследование включало в себя 441 участника. В качестве исследуемого материала использовалась венозная кровь, из которой выделялась ДНК. Далее проводили генотипирование с помощью QuantStudio 12К Flex PCR. Статистическая обработка включала в себя такие параметры, как критерий х2 Пирсона, определение отношения шансов и 95% доверительные интервалы. Связь «генотип - фенотип» определялась с использованием general linear model с вариантами множественного наследования.
Результаты и обсуждение: все полиморфизмы отвечали правилу равновесия Харди - Вайнберга. Четыре значимых полиморфизма в соответствии с тестом х2 имели MAF, ассоциированные с риском развития колорек-тального рака. Для них был проведен анализ моделей наследования на основе лог-аддитивной модели. Полученные данные позволили говорить о повышении риска развития колоректального рака для rs3217810 и уменьшение риска развития для rs 7315438, rs2238126, rsll064437.
Выводы: определены полиморфизмы, которые связаны с риском развития колоректального рака в Казахстанской популяции согласно лог-аддитивной модели наследования и распределению частот минорных аллелей.
Ключевые слова: полиморфизм, SNP, колоректальный рак, генотип, аллель
Колоректальный рак (КРР) ежегодно поражает более 2 млн. пациентов, и более 600 тыс. умирают от этого заболевания [1]. Несмотря на значительные наследственные факторы, большинство случаев КРР носят спорадический характер и незаметно развиваются в течение нескольких лет. В настоящее время к этиологии КРР относят изучаемые генетические вариации и факторы риска окружающей среды [5]. Б1МР могут варьироваться в зависимости от этнической группы и увеличивать вероятность развития патологии.
Исследование проведено с целью поиска полиморфизмов, связанных с развитием колоректальной аденокарциномы у представителей популяции Центрального Казахстана. Значительное количество полиморфизмов, связанных с колоректальным раком, было локализовано в 12 хромосоме.
Цель работы - определение связи между Б1МР в 12 хромосоме и риском развития колоректального рака в популяции Центрального Казахстана.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В исследовании приняли участие 282 пациента с КРР и 159 условно здоровых участников исследования, составивших контрольную
группу. Каждый участник исследования подписал письменное информированное согласие, после чего у них был осуществлен забор 3-5 мл венозной крови. Все участники в рамках национального скрининга прошли через общеклиническое обследование, фиброколоноскопию, также был проведен экспресс-тест кала на скрытую кровь. Клинический диагноз пациентам с КРР устанавливали согласно МКБ-10. Протокол исследования утвержден Комитетом по биоэтике КГМУ №305 от 19 мая 2017 г.
Критерии включения: возраст 18-80 лет, колоректальная аденокарцинома. Критерии исключения-, наследственная форма КРР, соматические заболевания в стадии декомпенсации, наличие генетических заболеваний.
Для проведения генетических исследований периферическую кровь пациентов забирали в вакуумные пробирки с этилендиамин-тетрауксусной кислотой (ЭДТА). Геномную ДНК выделяли из цельной крови с использованием коммерческих наборов GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific, Вильнюс, Литва) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли с помощью NanoPhotometer (Implen, Германия). Выделенную ДНК хранили при -20 С°.
Анализ и отбор SNP осуществляли с помощью Ensembl (https://www.ensembl.org/). Было отобрано 9 SNP для панели генотипиро-вания, которые ранее упоминались в публикациях и ассоциировались с риском КРР. Геноти-пирование проводили с помощью Quantstudio 12К Flex PCR. Кривые амплификации анализировали с помощью официального приложения ThermoFisher (https://apps.thermofisher.com). Генотипы определяли в двухмерном пространстве - кластер гомозиготных генотипов по первому аллелю располагался на оси X, а гомозиготные генотипы по второму аллелю на оси Y. Между ними располагался кластер гетерозиготных генотипов.
Статистический анализ проводился с использованием онлайн-ресурса SNPstats (https://www.snpstats.net/) и статистики R (V 3.6.3). По результатам генотипирования для каждого полиморфизма в двух группах рассчитывались такие параметры, как процентное соотношение основных и минорных аллелей, значение частоты минорных аллелей (MAF -минорная частота аллелей) и относительные значения для генотипов. Каждое частотное распределение SNP оценивали с использованием правила равновесия Харди - Вайнберга (HWE) в контрольной группе. Сравнение гено-типического распределения и частот аллелей между группами проводилось с использованием критерия х2 (критерий хи-квадрат Пирсона). Чтобы оценить связь между SNP 12 хромосомы и риска возникновения КРР, проведено определение отношения шансов (ОШ) и 95% доверительных интервалов (ДИ). Различия
между выборками считали статистически значимыми при р<0,05. Связь «генотип - фенотип» определялась с использованием general linear model (GLM) с вариантами множественного наследования (лог-аддитивная модель). Для значения р рассчитывался критерий FDR -поправка на множественность исследований.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В исследование были включены 441 участник, в том числе 282 пациента с КРР (149 мужчин, 133 женщины; средний возраст -64,97 ±10,77 лет) и 159 условно здоровых участников (83 мужчины, 76 женщин; средний возраст-46,59±13,58) (табл. 1).
В общей сложности у всех участников было успешно генотипировано 9 SNP, все протестированные SNP соответствовали равновесию Харди - Вайнберга (HWE) в контрольной группе. Таким образом, все SNP достигли критического значения р>0,05 для HWE в контроле и были включены в дальнейший анализ.
Проанализирован список изученных полиморфизмов, их расположение и положение на хромосоме, возможные функции в генах и достигнутый уровень значимости точного теста на HWE в контрольной группе (табл. 2).
Для представленных ассоциаций «SNP -КРР» был рассчитан критерий у2 и ОШ. Поскольку осуществлялось множество сравнений, то было применена поправка FDR для значений p-value.
Обнаружено, что с КРР связаны следующие SNP: rs3217810 (0ш=2.1380; 95% ДИ: от 1.1932 до 3.8307; р=0,045), rsll064437 (С)Ш=0.3071; 95% ДИ: от 0.1428 до 0.6604;
Таблица 1 - Общие характеристики участников исследования
Показатель Исследуемая группа Контрольная группа
абс. % абс. %
Мужчины Женщины 149 133 53% 47% 83 76 52% 48%
Средний возраст ± стандартное отклонение 64,97± 10,77 46,59± 13,58
Таблица 2 - Основная информация о SNP, представленных в этом исследовании
SNPID Band Позиция Ген Возможная функция HWE
rsl2309274 12pl3.33 866782 WNK1 intronic 0,68
rs4572213 12pl3.32 4256383 CCND2-AS1 non-coding intronic 0,38
rsl0774214 12pl3.32 4259186 CCND2-AS1 non-coding intronic 0,17
rs3217810 12pl3.32 4279105 CCND2 non-coding intronic 1
rsl0849432 12pl3.31 6276561 1
rs11064437 12pl3.31 6872998 TPI1/RPL13P5/ LRRC23/SPSB2 intronic 1
rs2238126 12pl3.2 11856807 ETV6 intronic 0,07
rs7315438 12q24.21 115453598 0,71
rs73208120 12q24.22 117309785 NOS1 intronic 1
Таблица 3 - Частота минорных аллелей (МАР), наличие взаимосвязи между БМР и риском КРР (р х2)
БМРГО Аллели МАР ОШ 95% ДИ Р(Х2) Р01*
контроль пациенты с КРР
ГБ12309274 т/с 0.15 0.16 1.0833 0.6518 - 1.8006 0.758 0.758
ГБ4572213 АД 0.24 0.19 0.7303 0.4766- 1.1193 0.149 0.2682
ГБ10774214 С Я 0.43 0.38 0.8059 0.5521 - 1.1764 0.264 0.339
ГБ3217810 С Я 0.07 0.13 2.1380 1.1932-3.8307 0.010 0.045*
гб10849432 т/с 0.14 0.18 1.3364 0.6923 - 2.5797 0.387 0.435
гб11064437 С Я 0.07 0.02 0.3071 0.1428-0.6604 0.002 0.018*
ГБ2238126 А/в 0.33 0.22 0.5607 0.3428 - 0.9171 0.021 0.04725*
ГБ73 15438 т/с 0.54 0.45 0.6795 0.5014-0.9210 0.013 0.039*
ГБ73208120 т/с 0.05 0.07 1.5272 0.7864 - 2.9659 0.209 0.3135
Таблица 4 - Лог-аддитивные модели наследования для значимых БИР
БМР Генотип ОШ 95% ДИ Р
ге3217810 0,1,2 (СС/СТЯП 2.17 1.20-3.92 0,061
ГБ7315438 0,1,2 (ТТ/СТ/СС) 0.68 0.50-0.93 0,013
ге2238126 0,1,2 (АА/Ав/вО 0.58 0.36-0.94 0,028
гб1 1064437 0,1,2 (СС/СТДТ) 0.29 0.13-0.64 0,02
р=0,018), ге2238126 (0ш=0.5607; 95% ДИ: от 0.3428ДО 0.9171; р=0,047), ге7315438 (0ш=0.6795, 95% ДИ: от 0.5014 до 0.9210; р=0,039) (табл. 3).
Результаты согласуются с данными других исследователей. гз3217810 находится на хромосоме 12р13 в гене циклина 02 (ССШ2). Циклины регулируют экспрессию и деградацию циклинзависимых киназ и способствуют кратковременной координации митоза. Согласно литературным источникам, гз3217810 способствовал увеличению риска развития КРР (ОШ 1,20 на аллель риска; р=5,9х10"8). Хотя и указывается, что частота минорного аллеля гз3217810 у представителей европейского происхождения составляла в среднем 0,16, и этот БЫР очень редко встречается в азиатских популяциях (0,03 у японцев в Токио, Япония и 0,01 у китайцев хань из Пекина, Китай) [3].
Также ге7315438 показал статистически значимую ассоциацию с риском развития КРР в комбинированном метаанализе С\А/А5. БЫР расположен на хромосоме 12ц24 выше белка Т-Ьох 3 (ТХВЗ). гз7315438 расположен ниже МЕ0131_, который кодирует субъединицу медиаторного комплекса - большого комплекса белков, который функционирует как транскрипционный коактиватор для большинства генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II. Однако этот БЫР также находится во взаимодействии генов, кодирующих регуляторы транскрипции, включая супрессор киназы кАБ2
(КБР2). В проведенном исследовании ОШ для гз7315438 указывают на уменьшение риска КРР. Это объясняется тем, что в данном случае минорный аллель не является рисковым алле-лем и соответственно приводит к уменьшению риска развития КРР. При рассмотрении аллеля Т в качестве эффектного рискового аллеля ОШ будет указывать на увеличение риска развития КРР, что согласуется с литературными данными [4].
Аналогичная ситуация складывается для ^2238126 и гэ11064437. С\А/А5 указывает на увеличение риска КРР при наличии данных полиморфизмов, объясняя это изменением процесса сплайсинга и формированием транскрипционной изоформы с укороченной не-транслируемой областью в экзоне [2, 6].
Таким образом, определены полиморфизмы, которые связаны с риском развития КРР в Казахстанской популяции согласно лог-аддитивной модели наследования и распределению частот минорных аллелей. Проведенное исследование представляет собой экспериментальную работу, а результаты обладают научной новизной. Однако необходимы дальнейшие исследования аллелей, связанных с риском развития КРР, для предоставления клинически значимой информации.
Информация о финансировании. Работа выполнена в рамках НТП 0.0821 «Персонифицированный подход в управлении ряда значимых заболеваний», финансируемой МОН РК.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА
1 Brenner Н. Colorectal cancer /Н. Brenner, М. Kloor, С. P. Pox //Lancet. - 2014. - V. 383. - Р. 1490-1502.
2 Common genetic variation in ETV6 is associated with colorectal cancer susceptibility / M. Wang, D. Gu, M. Du et al. //Nat. Commun. -2016. -V. 7. - P. 11478.
3 Identification of Genetic Susceptibility Loci for Colorectal Tumors in a Genome-Wide Metaanalysis /U. Peters, S. Jiao, F. R. Schumacher et al. //Gastroenterology. - 2013. - V. 144 (4). - P. 799-807.
4 Meta-analysis of new genome-wide association studies of colorectal cancer risk /U. Peters, С. M. Hutter, L. Hsu et al. //Hum Genet. -2012. - V. 131(2). - P. 217-234.
5 Single Nucleotide Polymorphism in SMAD7 and CHI3L1 and Colorectal Cancer Risk / E. F. Abd, A. Amal, N. Sadik et al. //Mediators of Inflammation. - 2018, 9853192
6 Zeng C. Identification of Susceptibility Loci and Genes for Colorectal Cancer Risk /С. Zeng, K. Matsuda, W. H. Jia //Gastroenterology. -2016. - V. 150 (7). - P. 1633-1645.
Поступила 08.07.2020 г.
D. B. Babenko, Ye. A. Kolesnikova, S. I. Kolesnichenko, I. A. Kadyrova, I. V. Korshukov, V. B. Sirota, L. L. Akhmaltdinova, A. A. Turmukhambetova
ASSOCIA HON OF SINGLE-NUCLEOHDE POL YMORPHISMS OF THE 12™ CHROMOSOME WITH COLORECTAL CANCER IN REPRESENTA TIVES OF THE POPULA TTON OF CENTRAL KAZAKHSTAN Karaganda medical university (Karaganda, Kazakhstan)
Colorectal cancer is one of the most frequently diagnosed malignant tumors in the world and the Republic of Kazakhstan. Currently, the studied genetic variations and environmental risk factors are attributed to the etiology of colorectal cancer. This study was aimed to search for polymorphisms associated with the development of colorectal adenocarcinoma in representatives of the population of Central Kazakhstan. A significant number of polymorphisms associated with colorectal cancer were localized on chromosome 12.
Materials and methods: the study involved 441 participants. The test material was venous blood, from which DNA was isolated. Next, genotyping was performed using a QuantStudio 12K Flex PCR. Statistical processing included the following parameters, Pearson x2 test, determination of the odds ratio and 95% confidence intervals. The genotype -phenotype relationship was determined using the general linear model with multiple inheritance options.
Results and discussion: all polymorphisms met the Hardy - Weinberg equilibrium. Four significant polymorphisms according to the x2 test had MAF associated with colorectal cancer risk. For them, an analysis of inheritance models was carried out on the basis of a log-additive model. The data obtained allowed us to speak of an increased risk of colorectal cancer for rs3217810 and a decrease in the risk for: rs7315438, rs2238126, rsll064437.
Conclusion: we identified polymorphisms that are associated with the risk of colorectal cancer in the Kazakhstan population according to the log-additive model of inheritance and the distribution of minor allele frequencies. The research is experimental work, and the results are of scientific novelty.
Key words: polymorphism, SNP, colorectal cancer, genotype, allele
Д. В. Вабенко, E. А. Колесникова, С. И. Колесниченко, И. А. Кадырова, И. В. Коршуков, В. Б. Сирота, Л. Л. Ахмалтдинова, А. А. Турмухамбетова
12-ХРОМОСОМАНЫН BIP НУКЛЕОТИДЛ ПОЛИМОРФИЗМ1, ОРТАЛЫК, КАЗАХСТАН ПОПУЛЯЦИЯСЫ вЮПДЕРШЩ КОЛОРЕКТАЛЬДЫ ШКПЕН ВАЙЛАНЫСТЫ
Караганды медицина университет,i (Караганды, Казахстан Республикасы)
Колоректальды ícík элемде жэне Казакстан Республикасында >kh¡ диагностикаланатын катерл1 юктердщ 6ipi болып табылады. Ka3ipri уакытта, колоректальды ícík этиологиясына зерттеле™ генетикалык вариациялар мен коршаран ортара Kayin факторлары Kipefli. Бул зерттеу Орталык Казакстан популяциясынын еюлдер1нде колоректальды аденокарциноманын дамуына байланысты полиморфизмдерд1 ¡здеу максатында журпзтдк Колоректальды катерл1 ¡акпен байланысты полиморфизмдердщ едэу1р мелшер1 12 хромосомада локализацияланран.
Материалдар мен эдютер: зерттеуге 441 адам катысты. Зерттеле™ материал рет1нде ДНК шырарылран веноздык кан колданылды. 6pi карай, QuantStudio 12k Flex PCR кемепмен генотиптеу журпзшдг Статистикалык ендеуге осындай параметрлер, Пирсон критерий!, мумюндк катынасын аныктау жэне 95% сеымдтк интервал-дары Kipfli. «Генотип - фенотип» байланысы general linear model кемепмен 61рнеше мурагерлк нускаларымен аныкталды.
Нэтижелер жэне талцылау: барлык полиморфизмдер Харди - Вайнберг тепе-тендк ережеане сэйкес келдг X2 сынарына сэйкес терт манызды полиморфизм колоректальды ícík тэуекелйен байланысты MAF болды.
Олар уш1н мурагерлк модельдерге лог-аддитивт1 модель негЫнде талдау жасалды. Алынран мэл1меттер гб3217810 уш1н, колоректальды ¡ак тэуекел^Н жогарылауы жэне 7315438, гб2238126, Г511064437 уш1н тэуе-келдщ темендеу1 туралы айтура мумюндк берд1.
К,орытынды: К,азакстан популяциясындары колоректальды ¡ак тэуекел1мен байланысты полиморфизмдер мурагерл1ктщ лог-аддитивт1 модел1не жэне минорлык аллельдердщ жит1ктер1н белуге сэйкес аныкталды. Зерт-теу-бул эксперимент™ жумыс, ал нэтижелер1 гылыми жацалыкка ие.
Юлтсвздер: полиморфизм, БИР, колоректальный рак, генотип, аллель
