CC BY
63
Галина Грушевская,
ведущий научный сотрудник кафедры компьтерного моделирования физического факультета БГУ, кандидат физико-математических наук
Андрей Бабенко,
доцент кафедры биоорганической химии медицинского факультета иностранных учащихся БГМУ, кандидат химических наук
Нина Крылова,
старший научный сотрудник кафедры компьтерного моделирования физического факультета БГУ, кандидат физико-математических наук
Игорь Липневич,
научный сотрудник
кафедры
компьтерного
моделирования
физического
факультета БГУ
Валентина Егорова,
доцент кафедры химии факультета естествознания БГПУ им. М. Танка, кандидат
биологических наук
Одномолекулярное EIS-секвенирование ДНК
на композитах нанопористых структур
Аннотация. В статье анализируются перспективы использования прямой ДНК-нанодиагностики в медицине, сравниваются различные способы ДНК-секвенирования и предлагается высокочувствительный метод секвенирования индивидуальных молекул ДНК на электрохимических импедансных (EIS) ДНК-наносенсорах.
Ключевые слова: прямая ДНК-диагностика, однонуклеотидный полиморфизм, электрохимический ДНК-наносенсор.
Методы определения первичной последовательности нуклеиновых кислот (секвенирования) активно развиваются в нескольких направлениях. Технологии секвенирования геномов про-и эукариот de novo, а также мета-геномные исследования используются не только в научном мире, но и в рутинной клинической
диагностике. Заметно растет спрос и на секвенирование небольших геномов или их участков, включая полиморфизм генов и определение мутационных профилей.
Практически все указанные приложения метода требуют обогащения первичной мишени, например конкретных целевых областей молекулы ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), что вносит дополнительные переменные в и без того
:194) | Апрель 2019 | НАУКА И ИННОВАЦИИ 23
непростое уравнение молекулярной диагностики патологий инфекционной и неинфекционной природы. В связи с этим за последние 10 лет значительно развились методы секвенирования на наносенсорах [1-4].
Прямая ПЦР-основанная ДНК-диагностика в медицине
В клинико-диагностических лабораториях с помощью методов, использующих ПЦР (классическая, в режиме реального времени, цифровая), выявляют инфекционные и наследственные болезни, генетические факторы риска сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний, осуществляют неинвазивный пренаталь-ный скрининг аномалий развития плода и др. Особую важность в некоторых случаях имеют профили мутаций или полиморфных состояний определенных участков генома человека, которые включают ключевые точки, связанные с теми или иными фенотипическими (на уровне белков или регулятор-ных некодирующих форм РНК) проявлениями патологического
или иного характера в организме человека [5].
Несмотря на развитие технологий и широкое распространение ПЦР, использующие ее приложения все еще остаются достаточно трудоемкими и затратными с точки зрения рутинных клинических анализов. В настоящее время из-за дороговизны основными потребителями услуг генетических исследований являются исследовательские лаборатории и диагностические центры системы страховой медицины [6].
Генетический анализ полиморфизма и мутаций в отличие от определения последовательностей вирусных и бактериальных нуклеиновых кислот часто оказывается более сложным и дорогостоящим. Во многом это связано с необходимостью работы всего с одним или несколькими нуклео-тидами. Характерный пример таких приложений - определение мутаций в образцах опухолевой ткани, в частности в гене, кодирующем один из ключевых белков, участвующих в передаче сигнала внутрь клетки - ККЛ8.
Более 90% всех особенностей в первичной последовательности
Профиль
Определяемые мутации
Gly12Asp(GGT>GAT)
Gly12Ala(GGT>GCT)
KRAS 7 мутаций
Gly12Val(GGT>GTT) KRAS (Кодоны 12,13) Gly12Ser(GGT>AGT)
Gly12Arg (GGT>CGT) Gly12Cys(GGT>TGT) Gly13Asp(GGC>GAC)
KRAS 12 мутаций
KRAS (Кодон 13)
Gly13Ser(GGC>AGC) Gly13Arg(GGC>CGC) Gly13Val(GGC>GTC) Gly13Cys(GGC>TGC) Gly13Ala(GGC>GCC)
Таблица 1. Соматические SNP-мутации гена KRAS (кодоны 12, 13)
ДНК гена KRAS представляют собой точечные замены одного ну-клеотида на другой во втором эк-зоне гена, в последовательностях, кодирующих 12-ю и 13-ю аминокислоты (табл. 1). В норме в обеих позициях располагается глицин - единственная аминокислота, не имеющая боковой цепи. Любое изменение этой последовательности приводит к его замене на аминокислоты с разветвленным углеводородным радикалом, что ведет к нарушению пространственной конфигурации белка, в результате чего блокируется способность специальных белков инактивировать KRAS, соединенный с молекулой гуанозинтри-фосфата (ГТФ), путем гидролиза ГТФ. Так как ГТФ служит источником энергии для химической реакции, катализируемой ферментом KRAS, то гидролиз ГТФ прерывает цепочку, обеспечивая при этом нормальное функционирование клетки [7, 8].
Согласно табл. 1, молекуляр-но-генетический анализ однону-клеотидного полиморфизма (SNP) только в кодонах 12 и 13 требует постановки более 10 ПЦР в режиме реального времени, для которых нужны дорогостоящие наборы реагентов (Therascreen KRAS RGQ PCR Kit, Qiagen, США). Частично эту проблему можно решить с помощью секвенирования по Сенгеру, конечная стоимость которого значительно ниже, однако этот метод не обладает достаточной чувствительностью для определения менее 20-30% мутантной ДНК в образце, что нередко наблюдается в гетерогенных опухолях.
На данный момент для рутинных клинических исследований не предложено метода анализа последовательностей ДНК,
http://innosfera.by 1
Инфекционные заболевания Идиопатические заболевания Онкология
Пренатальная диагностика Генотипирование HLA
2,0
_ Ш ■ щ
■н _
2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020 2021 2022 г. Рис. 1. Динамика объема спроса на услуги Ю-секвенирования в 2012-2022 г., млрд долл.
обладающего всеми преимуществами секвенирования и ПЦР, одновременно недорогого и простого в исполнении, надежного и воспроизводимого.
Современные методы секвенирования
При определенных условиях секвенирование может обходиться без обогащения исследуемой последовательности с помощью ПЦР или иных подходов. Благодаря этому снижается вероятность перекрестной контаминации образцов и получения лож-ноположительных результатов. Тем не менее в большинстве случаев количество целевых участков ДНК на старте не может обеспечить достаточное число амплико-нов для корректной детекции, так как TaqMan-полимераза ингиби-руется через 40 циклов [9]. Из-за существования верхнего ограничения ПЦР-продукта по массе, например, мультиплексный молеку-лярно-генетический анализ на вирулентность проводится при концентрации ДНК более 2-103 МЕ/мл (8-103 геномных копий/мл) в исходном образце с вирусной ДНК (ПЦР с набором реагентов «Рибо-сорб» и «Рибо-преп») [10].
Решение обогатить целевые участки ДНК с помощью ПЦР или альтернативных подходов зачастую сопровождается незаметной на первый взгляд проблемой -потерей чувствительности к минорным последовательностям. Это связано в первую очередь с необходимостью проведения мультиплексной ПЦР вне зависимости от наличия специфических оли-гонуклеотидов или случайных последовательностей. Наконец, сборка коротких прочтений (ридов) в готовую последовательность
также приводит к ошибкам распознавания. При этом для таких направлений, как диагностика хронических и вялотекущих вирусных инфекций, мониторинг состояния пациентов с использованием жидкой биопсии, определение молекулярного профиля опухолей, роль минорных последовательностей чрезвычайно важна.
Современные методы гено-типирования называют секве-нированием следующих поколений - NGS (Next Generation Sequensing) и TGS (Third Generation Sequensing). TGS не использует ПЦР-обогащение [11]. NGS-и TGS-методы - это ДНК-нано-сенсорные технологии секвени-рования, когда одновременно применяются несколько собранных вместе ДНК-сенсоров или ячеек, специализированных на различные целевые ДНК-последовательности и называемых ДНК-микрочипом [11, 12]. На каждом микрочипе может располагаться от 30-50 до нескольких десятков и даже сотен тысяч упоря-доченно нанесенных микротестов или проб [13]. NGS- и оптическое
ТС8-секвенирование - коротко-ридовые. Преимущество последнего с электрохимическим транс-дьюсером - возможность длинно-ридового секвенирования целых нативных молекул ДНК [14].
Эффективность высокопроизводительных систем N08 и Т08 поколений приведет к экспоненциальному росту спроса на услуги молекулярно-генетическо-го анализа (рис. 1) [15]. Особенно они будут востребованы в онкологии из-за важной роли минорных последовательностей ДНК. При этом, согласно данным многочисленных обзоров клинических исследований, классическое секвенирование по Сенгеру, равно как и приложения N08, позволяют достоверно выявлять 10-20% ДНК в общем пуле [16, 17]. С другой стороны, мультиплексные ПЦР в режиме реального времени и цифровая ПЦР гарантируют 5% [18], однако производительность этих методов недостаточна. На ранних стадиях развития опухоли с содержанием 0,01-1% числа копий мутантного гена результаты детектирования практически непредсказуемы [19].
Длинноридовое EIS-детектирование SNP на квантовых материалах и нанокомпозитах
Электрохимические или электронные методы, в отличие от оптических, не требуют обязательного использования меченых ДНК и основываются на регистрации изменения электрофизических свойств (проводимости и диэлектрической проницаемости) ДНК-образца. Полупроводниковый ионный МС8-секвенатор функционирует на ионно-селек-тивных полевых транзисторах. При проведении синтеза вблизи поверхности их затворов положительно заряженные ионы водорода, образуемые при гидролизе нуклеотидов с последующим включением нуклеозидмонофос-фатов в растущую ДНК-цепочку, вызывают перераспределение электрического заряда. Соответственно меняется электрическое поле, действующее на электрический ток между стоком и истоком транзистора.
Перспективная альтернатива стандартным методам - развитие
Рис. 2. Нанопоровое секвенирование ssДНК с регистацией туннельного тока через 0,7-нанометровый разрыв электрода (электрод показан желтым цветом)
электрохимических методов длин-норидового секвенирования ДНК на нанопористых поверхностях и квантовых материалах ввиду высокой чувствительности, низкой стоимости и возможности миниатюризации электрохимических ДНК-сенсоров. Электрохимическая импедансная спектроскопия с использованием современных EIS ДНК-сенсоров с электродами Si/SiO2 wafer/SWCNT/AuNP, в покрытие которых включены одно-стенные углеродные нанотрубки (SWCNT, одностенные УНТ) и золотые наночастицы (AuNP), имеет
Рис. 3. Система электрохимического импедансного ДНК-анализа (в центре) с регистрацией частотных зависимостей изменения электрической емкости АС ДНК-сенсора (справа и внизу) после гибридизации денатурированной dsДНК (слева)
предельную чувствительность 10 зептоМ (зМ, 10-21 М) (для олигону-клеотидов из 10 азотистых оснований) [20]. Модификация электродов графеном позволяет детектировать немеченые генные последовательности без ПЦР при предельной чувствительности 7,1 зМ [21]. EIS ДНК-сенсор с электродами из стеклоуглерода(ал-лотропной формы углерода типа фуллерена, GCE), модифицированными оксидированным графеном rGO и наночастицами золота для детектирования мутаций в гене BRCA1 также имеет очень низкий предел, порядка 10 зМ [22]. EIS ДНК-сенсор с электродами из GCE/rGO имеет чувствитель-нось 3,2 зМ [23]. Наименьший предел чувствительности - 0,39 зМ достигнут для электрохимических сенсоров с электродами вида GCE/N-допированный муль-тиграфеновый аэрогель / золотые нанозвездочки [24]. Такие высокочувствительные сенсоры могут быть использованы для свободно циркулирующей ДНК в сыворотке крови человека с концентрациями 3 нг/мкл [25] или в 40 пг (10 копий геномной ДНК), необходимых для одного анализа [26].
Для углеродных наноструктур характерен топологический транспорт носителей электрического заряда. Их уникальные свойства можно применять для разработки метода детектирования одиночных молекул ДНК на эффектах поверхностного плазмонного резонанса и поверхностно-усиленного рассеяния света, эффектах экранирования в квантовых материалах: графене с металлическими наночастицами, углеродных нанотрубках, графеноподоб-ных монослоях на нанопористом анодном оксиде алюминия (АОА) [1, 27-31].
26
НАУКА И ИННОВАЦИИ
№4 (194) | Апрель 2019
http://innosfer
Рис. 4. А - одномолекулярное секвенирование на МУНТ, декорированных расположенными на нанопорах АОА органометаллическими ЛБ-комплексами.
Б - принципы функционирования сенсора нефарадеевского типа для детектирования поляризационных процессов в электрически заряженном двойном слое Гельмгольца. I, II - области поляризации объемного и поверхностного электрического заряда соответственно. Поверхностная зарядовая плотность йп (7) осциллирует в резонансе с колебаниями дипольного момента д гидратного комплекса
Нанопоры с диаметром порядка 1 нм могут играть роль молекулярного сита, которое отбирает одноцепочечные ДНК, комплементарные ДНК-зонду, с последующей генерацией отклика электрохимического трансдьюсе-ра и не пропускает несвязавшую-ся йзДНК 2-нанометровой толщины [14]. Принцип действия одно-молекулярного бионанопорово-го секвенирования заключается в определении одной молекулы ДНК на протеиновой нанопоре с диаметром отверстия 1,2-1,4 нм с регистрацией ионных токов через поры [14]. Нанобиопоры расположены в липидной мембране. Основная проблема данного метода - точность сборки гена не более 97% из-за числа прочтений не более 2 раз.
Использование не биологических, а более стабильных твердотельных нанопор, легко интегрируемых в электронные МОП-структуры, позволило бы разработать высокоточные системы длинноридового нанопорового секвенирования. Однако все синтезированные твердотельные на-нопористые материалы имеют поры большего размера: графенопо-добный мономолекулярный слой (монослой) MoS2 с порами 2,8 нм; нанопористые SnO2, АОА и Si3N4 с диаметром пор 10 нм. Было предложено закрывать твердотельные нанопоры электродами с нанораз-рывами шириной 0,7 нм (рис. 2). При комплементарном связывании с 88ДНК-зондом йзДНК-ми-шень расплетается и поцепочечно может диффундировать в нано-пору через 0,7-нанометровый зазор [32]. Гибридизация регистрируется по изменению квантового туннельного тока.
Преимущество EIS ДНК-сенсоров нефарадеевского типа
заключается в возможности детектирования гибридизации ДНК без меток [2-4]. Это делает их дешевыми, простыми в использовании и перспективными для миниатюризации. Изменения в сопротивлении или емкости двойного при-электродного слоя индуцируются гибридизацией ДНК-мишени с од-ноцепочечной зондовой ДНК, ад-гезированной на углеродную на-нотрубку (УНТ) и расположенной в приэлектродной области. Система наносеквенирования на нефа-радеевских наносенсорах представлена на рис. 3. Наносенсор-ный БК-преобразователь сигнала связывания олигонуклеотидного 88ДНК-зонда с dsДНК-мишенью является емкостным сенсором открытого типа и представляет собой встречно-штыревую систему алюминиевых электродов, которые напылены на плоскую си-талловую подложку и покрыты диэлектрическим тонким слоем нанопористого АОА и монослоями наноциклических комплексов высокоспинового октаэдрического
железа Бе(11) с дитионил-пирроло-выми лигандами (Бе(П)БТР), получаемых технологией Ленгмю-ра-Блоджетт (ЛБ). Последующее нанесение многостенных УНТ (МУНТ) дает декорированные ме-таллоорганическими ЛБ-комплек-сами Бе(П)ЭТР МУНТ. МУНТ, предварительно функционализи-рованные молекулами ДНК-зонда, являются трансдьюсером сигнала гибридизации.
Гибридизация комплементарной ДНК-мишени с ДНК-зондом в чувствительном слое приводит к проникновению высвободившейся ssДНК через нанополо-сти Бе(П)ЭТР-монослоя в нано-пористый АОА с последующим ее связыванием торцов МУНТ, как показано на рис. 4А. Детектирование целевой последовательности основывается на эффекте экранирования приэлектрод-ного двойного слоя Гельмгольца, приводящего к уменьшению электрической емкости Сл двойного слоя. Экранирующий эффект обусловлен резонансным
Концентрация ДНК-мишени, мкг/мл Изменение емкости (-ДС), пФ
Тип ДНК-мишени ДНК-зонд дикого типа ДНК-зонд с SNP-последовательностью
Очищенная геномная 10 2,0 0,1
ДНК из плаценты
здоровых доноров 56 4,6 -0,5
Геномная ДНК из тканей КРР 20 -2,0 1,5
40 -1,2 4,7
40 3,0 3,0
кДНК. КРР 67 1,2 4,0
700 0,2 10,0
ПЦР ампликоны с кДНК. КРР 2 0,1 1,1
Таблица2. Изменение электрической емкости EIS ДНК-наносенсоров при секвенировании различных типов ДНК-мишеней
распадом гидратных комплексов ионов и гидратированных нуклеиновых кислот на собственных частотах ионных осцилляций шге8. Графически принципы функционирования электрохимического ДНК-наносенсора представлены на рис. 4Б. Резонансный распад гидратированных ионов усиливается осцилляциями свободного электрического заряда в МУНТ, декорированных адгезированны-ми атомами Бе(П) в высокоспиновом состоянии. Поверхностные состояния приэлектродного МУНТ-содержащего слоя резонируют опосредованно с ионными рекомбинационными процессами на частоте шге8 следующим образом. Поверхностные состояния возбуждаются квантами электромагнитного поля, испускаемыми в рекомбинационном процессе ион - противоион, так что колебательные моды поверхностной зарядовой плотности Ли (г) резонансно возбуждаются (рис. 4Б).
С помощью системы, представленной на рис. 3, исследовали образцы опухолевой ткани кишечника (колоректальный рак, КРР), которые содержат мутации в гене КРАБ, выявленные с помощью ПЦР в режиме реального времени и подтвержденные
методом секвенирования по Сен-геру. В табл. 2 представлены результаты распознавания мутации КРАБ в различных типах ДНК-мишеней с использованием разработанного нами нового ДНК-наносенсорного Е1Б-ком-плекса. Комплементарное связывание плацентарной ДНК, не имеющей мутации гена КРАБ, происходит на сенсорах с пробной ДНК дикого типа (ДНК-зонд типа оНдо^), что приводит к уменьшению емкости сенсоров о^о^. Напротив, электрическая емкость ДНК-сенсора, содержащего ДНК-зонд с однонуклеотид-ной заменой (ДНК-зонд с БОТ-последовательностью, ДНК-зонд оНдо-М), практически не изменяется после гибридизации с плацентарной ДНК (отрицательный контроль). Для геномной ДНК, выделенной из опухолевой ткани, снижение емкости регистрируется для оНдо-М сенсоров, в то время как емкость сенсоров с ДНК-зондом дикого типа, наоборот, повышается, вероятно, за счет контаминации ДНК-образца. Для образцов комплементарной ДНК (кДНК), полученных с помощью обратной транскрипции с РНК опухолевых клеток, регистрируется понижение емкости сенсоров
обоих типов, в то же время с ростом концентрации ДНК-мишени наблюдается меньшее изменение емкости для сенсора с ДНК-зондом дикого типа. Для образцов кДНК, полученных ПЦР-ампли-фикацией, зарегистрировано снижение емкости сенсора с олигону-клеотидом мутантного типа при низких концентрациях ДНК-мишени (2 мкг/мл).
Предлагаемый нами способ ДНК-идентификации не требует дорогостоящего оборудования и практически не чувствителен к контаминации; результат EIS-анализа различных образцов ДНК может быть получен в течение 30 мин.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Abdul Rasheed P., Sandhyarani N. // Biosensors and Bioelectronics.
2017. Vol. 97. P. 226.
2. Babenka A. S., Grushevskaya H. V., Krylova N.// Int. J. Mol. Medicine.
2018. Vol. 42. P. 16.
3. Xuanying Li et al. // Biosensors and Bioelectronics. 2019. Vol. 126. P. 596.
4. Grushevskaya H. V., Krylova N. G., Lipnevich I. V. et al. // Semiconductors. 2018. Vol. 52, P. 1836.
5. WHO. Genomics and world health // Report of a WHO scientific group. 2002. №HLB: QZ 50.
6. Shaikh S., Sumant O. DNA sequencing market: global opportunity analysis and industry forecast, 2017-2025 // Allied Market Research, Diagnostics and Biotech. 2018. №LI_17163. https://www. alliedmarketresearch.com/dna-sequencing-market.
7. Ghosh A., Praefcke G. J.K., Renault L. et al. // Nat. Cell Biol. 2006. Vol. 440. P. 101.
8. Stolze B., Reinhart S., Bulllinger L. et al. // Sci. Rep. 2015. Vol. 5. P. 8535.
9. Heid C. A., Stevens J., Livak K. J. et al. // Genome Res. 1996. Vol. 6. P. 986.
10. Методические рекомендации по применению набора реагентов для определения и дифференциации генотипов вируса гепатита C (HCV) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенсHCV-генотип-FL» - М., 2017.
11. Liu L., Li Y., Li S. et al. // J. Biomed. Biotech. 2012. Vol. 2012. Article ID251364.
12. NGS: высокопроизводительное секвенирование / под ред. Д. В. Ребрикова. - М., 2014.
13. Наволоцкий Д. В., Крисько А. В., Арнаутов В. А. и др. // Научное приборостроение.2010.T. 20. С. 10.
14. Rang F. J., Kloosterman W. P., de Ridder J. // Genome Biology. 2018. Vol. 19. Article ID90.
15. Next Generation Sequencing 2017-2025. 2018. Report №978-168038-428-4 // https://www.grandviewresearch.com.
16. Cottrell C. E., Al-Kateb H., Bredemeyer A. J. et al. // J. Mol. Diagn. 2014. Vol. 16. P. 89.
17. Дрибдноходова О., Миронов К. О., Дунаева Е. А. и др. // Клиническая лабораторная диагностика. 2013. №6. C. 49.
Полный список использованных источников http://innosfera.by/2019/04/DNA
