CC BY
14
HayKOBMM BiCHMK ^tBiBCtKoro Ha^OHa^tHoro yHiBepcMTeTy
BeTepMHapHoi Megw^HM Ta öioTexHO^oriw iMem C.3. I^M^Koro
Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies
ISSN 2519-268X print ISSN 2518-1327 online
doi: 10.15421/nvlvet8526 http://nvlvet.com.ua/
UDC 602.4:[577.15:577.114.4]:635.342
Obtaining and characteristic of degradation products of Lactobacillus acidophilus K 3111 peptidoglycan
A.I. Kapustian, N.K. Cherno
Odesa National Academy of Food Technologies, Odesa, Ukraine
Article info
Received 19.02.2018 Received in revised form
12.03.2018 Accepted 16.03.2018
Odessa National Academy of Food Technologies, Kanatna Str., 112, Odesa, 65039, Ukraine. Tel. +38-096-758-88-34 E-mail: [email protected]
Kapustian, A.I., & Cherno, N.K. (2018). Obtaining and characteristic of degradation products of Lactobacillus acidophilus K 3111 peptidoglycan. Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies. 20(85), 141-147. doi: 10.15421/nvlvet8526
It is shown in the article that low molecular weight degradation products of peptidoglycans of bacterial walls possess high immunotropic activity and can stimulate evolutionarily fixed mechanisms of immune response. It is proposed to obtain low molecular weight fragments ofpeptidoglycans of cell walls of Lactobacillus acidophilus K 3111 - muropeptides. Fragmentation was carried out by combining physical and enzymatic methods of disintegration. As a physical factor of influence, an ultrasonic treatment was used, as enzymatic factor, a treatment with proteases of digestive, plant and microbial origin was used. These enzymes have a significant range of substrate specificity and can catalyze the specific binding of peptidoglycans to bacterial walls. The regularities of ultrasonic disintegration of Lactobacillus acidophilus K 311 has been investigated in the article. The rational conditions of ultrasonic disintegration are the treatment of biomass at a frequency of 35 kHz for 600 seconds. Under these conditions, the maximum amount of amino acids is accumulated in the disintegrate and the integrity of most bacterial cells is violated. The regularities of the enzymolysis of peptidoglycans of cell walls of Lactobacillus acidophilus K 3111 by pancreatin, papain andprotosubtilin has been determined. It has been shown that ultrasonic disintegration, which precedes enzymatic hydrolysis, contributes to a significant increase in the content of low molecular weight peptides in hydrolysates by almost 50%. The expediency of using an enzyme of plant origin papain for enzymatic fragmentation of peptidoglycan is substantiated. When the ratio of the enzyme (papain): substrate 1: 200 and the duration of the process for 180 minutes, the highest content of low molecular weight peptides in hydrolysates (6.6 mg/cm3) is achieved. It is proved that the target compounds muropeptides are contained in the products of enzymatic hydrolysis, the content of muropeptides reaches 38% of the total amount of low molecular weight peptides at the hydrolysis by papain, 31% -by pancreatin and 23% - by protosubtilin.
Key words: peptidoglycan, muropeptides, disintegration, ultrasonic, enzymatic hydrolysis.
Отримання та характеристика продукпв деструкцп пептидоглжану Lactobacillus acidophilus K 3111
А.1. Капустян, Н.К. Черно
Одеська нацюнальна академiя харчових технологт, м. Одеса, Укра'ша
Показано, що низькомолекулярн продукти деструкцп пептидоглтатв бактерiалъних стток володють високою мунотроп-ною активтстю та здатт стимулювати еволюцшно закроет мехатзми мунног вiдповiдi. Запропоновано отримання низькомо-лекулярних фрагментiв пептидоглтанв клтинних стток Lactobacillus acidophilus K 3111 - муропептидiв. ФрагментацЮ здшсню-вали комб^ванням фiзичних та ензиматичних методiв дезттеграци У якостi фiзичного фактору впливу застосовували ультраз-вукову обробку, ензиматичного - обробку протеазами травного, рослинного та мiкробiального походження. Даш ферменти володють значним ареалом субстратног специфiчностi та здатн каталiзувати специфiчнi зв 'язки пептидоглтатв бактерiальних стток. До^джено закономiрностi ультразвуковог дезттеграци Lactobacillus acidophilus K 311. Встановлено, що ращональними умовами ультразвуковог дезттеграци е обробка бюмаси за частоти 35 кГц протягом 600 с. За цих умов у дезiнтегратi накопичу-еться максимальна ктьккть амтокислот та порушуеться цШстсть бiльшостi бактерiальних клШин. Визначено закономiрностi ферментолiзу пептидоглтатв клШинних стток Lactobacillus acidophilus K 3111 панкреатином, папагном та протосубтилтом. Показано, що ультразвукова дезттегращя, яка передуе ферментативному гiдролiзу, сприяе суттевому, майже на 50%, зростан-
ню eMicmy низькомолекулярних nenmudie у ферментолiзатах. Обгрунтовано доцтьтсть використання ферменту рослинного походження папагну для ензиматичног фрагментацИ пептидоглтану. При сniввiдношeннi фермент (папагн): субстрат 1:200 та mрuвалосmi процесу протягом 180 хв, досягаеться найбтьший вмкт низькомолекулярних nenmuдiв у фeрмeнmолiзаmах (6,6 мг/см3). Доведено, що у складi nродукmiв фeрмeнmолiзу мктяться цiльовi сполуки - муропептиди, вмкт яких сягае 38% eid загальног кiлькосmi низькомолекулярних nenmuдiв при фeрмeнmолiзi папагном, 31% - панкреатином та 23% - протосубтилтом.
Ключовi слова: пептидоглтан, муропептиди, дезттегращя, ультразвук, ферментативний гiдролiз.
Вступ
Загальновщомою проблемою сучасносп е збшь-шення випадшв застудних та шфекцшних захворю-вань серед населення. Стан здоров'я населення бага-тьох кра!н свггу значно пригшчуеться пвд впливом антропогенних та сощальних фактор1в. Створення та впровадження ефективних превентивних заход1в е необхщним для подолання ще! глобально! проблеми. Важливою е нутрггавна тдтримка населення, а саме, введения в рацюн функцюнально! !ж1 з вм1стом функ-цюнально^зюлопчних 1мунотропних 1нгред1ент1в, здатних сприяти пвдвищенню ошрносл оргашзму до р1зномаштних захворювань.
Перспективним та доцшьним е використання у якосп 1мунотропних харчових шгред1енпв продукпв деградацп пептидогакашв клгганних стшок пробю-тичних бактерш - низькомолекулярних муропептид1в (Kapustyan and Cherno, 2015; Cherno and Kapustyan 2016). Фрагменти пептидоглтану здатш проникати через кишечний бар'ер (Vavricka, 2004), стимулюючи еволюцшно закршлеш мехашзми 1мунно! вщповщ. Розщеплений пептидоглжан транспортуеться всере-дину клгган i розтзнаеться цитоплазматичними рецепторами (Nod 1 i Nod 2). Шсля активацй' цi молекули викликають внутрiшньоклiтиннi сигнали, якi приводить до активацп транскрипцiйних вщповвдей, куль-мiнацiею яких е експре^ запальних генiв (Traub et al., 2006; Kawai and Akira, 2010; Qingshan et al., 2012; Matsui et al., 2014). Структури пептидогакану, що розпiзнаються рецепторами Nod 1 та Nod 2 зображено на рис 1.
сн3он
К ¿Г
нн )
с-о
I
CH.t
NODI
----1--*
d-gu 1
I
^_IJCJL Ü^P J
ГЬАЬ d-ao
Рис. 1. Структури що розпiзнаються рецепторами
Nod 1 та Nod 2 (Kawai and Akira, 2010)
Досить складним е питання деструкцп бактерш. особливо грампозитивних. Клiтиннi стшки мжроор-ганiзмiв надзвичайно стiйкi до до деградуючих фак-торiв. Роль основного захисного бар'еру виконуе пептидоглшан, доля якого й визначае мщшсть бакте-рiальних клiтин (Chapot-Chartier and Kulakauskas,
2014). Тому актуальним е розроблення доступних та простих у реалiзацi! способiв деструкцй' пептидогль кашв клiтинних стiнок пробiотичних культур з метою отримання !хшх бiологiчно активних фрагментiв.
Деструкцш клiтинних стiнок мiкроорганiзмiв здiйснюють застосовуючи фiзичнi, хiмiчнi, бiохiмiчнi або комбiнованi методи впливу. Б^шють ввдомих методiв отримання муропептидiв (Senchenko et al., 2005; Gavrilin et al., 2007; Matsumoto et al., 2009; Regulski, 2012; Ku'hner et al., 2014) досить складш у виконанш, особливо у промислових масштабах. Вони е багатостадшними, iз застосуванням специфiчних та високовартiсних реагентiв. Як правило, для отримання структурних компонента пептидоглiканiв регулярно! будови, застосовують комбшацш фiзичних та ензиматичних методiв впливу (Matsumoto et al., 2009; Regulski, 2012; Ku'hner et al., 2014), причому iз фiзич-них методiв дезiнтеграцi! бактерiальних клгтин вико-ристовують переважно ультразвукову обробку (Livinskaya et al., 2011). Для ензиматичного каталiзу специфiчних зв'язшв пептидоглiкану (рис. 2), як правило, використовують протеази, мурамвдази, або !хню комбiнацiю (Senchenko et al., 2005; Gavrilin et al., 2007; Matsumoto et al., 2009; Regulski, 2012; Ku hner et al., 2014). У якосп протеаз найчастше застосовують травш ферменти: пепсин, трипсин, хiмотрипсин або комплексний ферментний препарат панкреатин. У якосп мурамщаз застосовують лiзоцим, або мутаноль зин, який е метаболгтом Streptomyces globisporus ATCC 21553.
Враховуючи складшсть структури пептидоглiканiв (рис. 2), доцшьним е використання для !хньо! частко-во! деструкцй' бшьш широкого спектру протеаз iз залученням, окрiм травних, рослинних i мжробних протеолiтичних ферментiв, що володшть б№ш знач-ним ареалом субстратно! специфiчностi (Yakubke and Eshkide, 1985; Golovach et al., 2008; Ovsyannikova and Komarova, 2012; Geiger et al., 2017).
У представленш роботi розглянуто можливiсть отримання iмунотропних фрагментiв пептидоглжашв клiтинних стiнок лактобацил, шляхом застосування процесiв ультразвуково! обробки та фермеш^зу протеазами не тiльки травного, а й рослинного та мiкробiального походження. Комбшування вказаних методiв дезiнтеграцi! мшробних клiтин може сприяти бiльш глибокому гiдролiзу пептидоглiканiв !хнiх кль тинних стшок, що дозволить збiльшити вихвд цшьо-вих iмунотропних муропептидiв. О^м того, багатос-тадiйний процес очищення цiльових компонентiв запропоновано здiйснювати шляхом застосування юнообмшно! хроматограф^, що дозволить значно скоротити стадшшсть та тривалють загального процесу отримання iмунотропних муропептидiв.
I
MurNAc ^ Ala
I
Gil)
I
DAP - Ala
GlcNAc
i
Ala Ala
GlcNAc.
DAP
I
Glu
l
Ala MurNAc
Ap
Glu
DAP
I
Ala
i
Ala
GlcNAc
urNAc
Ala GlcNA. Glu DAP
aL
t
Ala
GlcNAc
MurNAc.
I
Ala
Glu
i
DAP - Ala
I
MDP
GlcNAc
MurNAc
I
Ala
I
Glu
DAP- Ala
I
I
Ala
i
Ala
GlcNAc
DAP
Glu
I
Ala
I
MurNAc
DAP Ala Ala
MurNAc
I
Ala Ala
GlcNAc
DAP
I
Glu Ala
GlcNAc
MurNAc
Рис. 2. Структурна оргашзащя пептидоглшану бактер1альних стшок
Мета роботи - отримання та характеристики ни-зькомолекулярних фрагмента пептидоглшашв Lactobacillus acidophilus K 3111 - муропептид1в, шляхом дезштеграцп i3 залученням ультразвуково! обро-бки та фeрмeнтолiзу протеазами травного, рослинного та мiкробiального походження.
Завдання дослвджень:
1. дослiдити закономiрностi ультразвуково! дезштеграцп Lactobacillus acidophilus K 3111;
2. дослщити закономiрностi фeрмeнтолiзу пеп-тидоглiканiв клiтинних стiнок Lactobacillus acidophilus K 3111 панкреатином, палашом та прото-субтилшом;
3. надати характеристику отриманих низькомо-лекулярних продукпв деструкцп пeптидоглiканiв.
Матерiал та методи дослвджень
Для дослiджeнь використовували бюмасу (БМ) Lactobacillus acidophilus K 3111 iз колекцп НВП «Арь адна», м. Одеса iз концeнтрацieю 7 109 КУО/см3. Видiлeння клiтин з культурально! рвдини здiйснювали шляхом центрифугування протягом 15 хв при 8000 хв-1. Осад клггин вщмивали дистильованою водою та ресуспендували. Для ультразвуково! дезштеграцп використовували суспензш клгтин Lactobacillus acidophilus K 3111 у дистильованш водi з вмiстом сухих речовин 4,78 ± 0,02%. Джерело ультразвуку -ультразвуковi ванни ПСБ-1335-05 iз робочою частотою 25, 35 та 40 кГц, тривалють обробки варшвали в iнтeрвалi 60-900 с.
Ферментативну дeструкцiю клiтинних стшок бю-маси здiйснювали обробкою панкреатином iз протео-лiтичною активнiстю 370 Од/г, протосубтилшом Г20х iз актившстю 70 Од/г, папа!ном iз актившстю 10 Од/мг. Постiйними параметрами гiдролiзу були температура 37 °С та рН = 7,4. Варшвали сшввщно-шення фермент: субстрат (вмiст сухих речовин БМ) у
дiапазонi ввд 1 : 50 до 1 : 300 та тривалють шкубацп реакцшно! сумiшi - 10-300 хв. Фeрмeнтолiз зупиняли екстреним нагрiванням до температури 100 °С, сумiш охолоджували, вiдокрeмлювали рвдку фазу ввд твердо! шляхом центрифугування протягом 10 хв при 8000 хв-1.
У рщкий фазi контролювали вмiст вiльних амшо-кислот методом формольного титрування (Semak et al., 2007). Вмiст низькомолекулярних пeптидiв (НМП) визначали методом Бенедикта (Semak et al., 2007) тсля осадження високомолекулярних бiлкiв 10% розчином трихлороцтово! кислоти (ТХО), (адже ведомо, що пептиди з молекулярною масою до 1500 Да не осаджуються розчинами ТХО) та наступно! юнооб-мiннiй хроматографi! з використанням катiонiту КУ-2 з метою позбавлених ввд нейтральних цукрiв, органi-чних кислот, продукпв мeтаболiзму. Вмiст муропеп-тидiв у складi НМП визначали Антроновим методом (Morris, 1948).
Паралельно визначали вщповщш параметри для контрольних зразк1в - фeрмeнтолiзатiв Lactobacillus acidophilus K 3111, яш не тддавали попeрeднiй ульт-развуковiй обробцi.
Результати та Тх обговорення
Пробiотичнi бактери належать до грампозитивних мiкроорганiзмiв, доля пептидоглшану в яких сягае 70% вщ !хньо! загально! маси, що робить !х надзви-чайно стшкими до впливу деградуючих факторiв. Тому для порушення анатомiчно! цiлiсностi клгган-них оболонок Lactobacillus acidophilus K 3111 здшс-нено сер1ю дослщв iз застосуванням ультразвуку, який е найбiльш ефективним фiзичним способом первинно! дeструкцi! мiкроорганiзмiв (Livinskaya et al., 2011). Одним iз найбiльш простих та доступних мeтодiв дeтeкцi! ступеня дeзiнтeграцi! мiкробних клi-тин е визначення динамiки накопичення вiльних амь
нокислот у склад1 дезштеграту (Shaphaev et al., 2015). На рис. 3 зображено залежшсть накопичення останшх в1д умов ультразвуково! обробки.
"J 0,9
X 0,8
¡3 0,7
o
§ 0,6 o s
J 0,5 ■3 0,4 & 0,3
K
H 0,2 « 0,1
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 TpHBajicrb yjbrpa3ByKOBOi oSpoSKH, c —♦—25 Kri 35 sTi 40 Kri
Phc. 3. 3ajeKHicTb HaKOnuneHHa aMiHOKucjOT y ge3iHTerparax Lactobacillus acidophilus K 3111 Big nacTOTH Ta TpHB&rocri yjbrpa3ByKOBOi o6po6KH
BuxOganu 3 gaHHx, HaBegeHHx Ha puc. 3, 3a 3pocTaH-HaM HaKonHHeHHa aMiHOKucjOT y ge3iHTerparax, MOKHa KOHcTaTyBaTH, ^O ge3iHTerpyMHHH BnjHB yjbrpa3ByKy Ha 6aKTepiajibHi KjriTHHH Mae Miciie npH Bcix Bapiaiiax nacTOTH yjbTpa3ByKy. 36ijbmeHHa BMicTy aMiHOKHcjOT y ge3iHTerparax npH O6pO6ii yjbrpa3ByKOM b iHrepBaji nacy 60-600 c HOcHTb jiHiHHHH xapaKTep. 13 nOgajbmuM 36ijbmeHHaM rpHB&rocTi yjbrpa3ByKOBOi o6po6kh, BMicT aMiHOKHcjOT y ge3iHTerpaTax 36ijbmyeTbca He-cyrreBO. Han6ijbm BarOMHH ge3iHTerpyMHHH BnjHB yjbTpa3ByKy Ha KjiTHHHi o6ojohkh Lactobacillus acidophilus K 3111 Mae Micie 3a o6po6kh nacTOTOM
7
0 6
5 5
1 4
30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 Тривалють ферментолзу, хв ........♦........Протосубтилн н Панкреатин к Папаш
40 Kri npOTarOM 900 c, npH ibOMy y ge3iHTerpaTi HaKO-nnHyeTbca MaKcuMajbHa KijbKicrb aMiHOKHcjOT. HaKO-nHHeHHa BijbHHx aMiHOKHcjOT y peaKiiHHOMy cepegO-BH^i 3a o6po6kh nacTOTOM 35 kTi npOTarOM 900 c BcbOrO Ha 5%, a npOTarOM 600 c - Ha 7% Mernne, hdk npH O6pO6ii yjbTpa3ByKOM 3a nacTOTH 40 kFi npOTarOM 900 c. OTKe, paiiOHajbHOM e O6pO6Ka cycneroii' Lactobacillus acidophilus K 3111 yjbTpa3ByKOM 3a nac-toth 35 kTi npOTarOM 600 c.
^ga nOgajbmOi gecrpyKiii nenragOraiKaHiB KjiTHH-hhx cTiHOK gaKTO6aiHj, i3 MeTOM OrpuMaHHa ixHix hh-3bKOMOjeKygapHHx ^pamemiB MypOnenrugiB, 3ginc-HMBajH i'xrnH ^epMeHTaTHBHHH rigpOji3. napagejbHO npOBOgujH $epMeHTOji3 nenTugOrgiKaHiB 3pa3KiB, aKi He niggaBajH yjbrpa3ByKOBm O6pO6ii. ,3ga gOcarHeHHa MaKcHMajbHOi rju6uHH rigpOji3y nenragOraiKaHy, 3a-cTOcOByBajH cepiM npOTea3 i3 mupOKHM apeajOM cy6-cTpaTHOi' cneiH^iHHOcri. y aKOcTi rpaBHHx npOTea3 BHKOpucTOByBajH naHKpeaTHH, y aKOcTi npOTea3 MiKpO-6iajbHOrO nOxOgKeHHa - npOTOcy6THjiH, pocjhhhoto nOxOgKeHHa - nanaiH. y $epMeHTOm3arax kohtpojm-BajH HaKOnuneHHa KijbKOcTi HMQ 3 MOjeKygapHOM MacOM gO 1500 ^a, agKe BigOMO, ^O caMe TaKi nenrugH BOjOgiMTb bhcokom iMyHOTpOnHOM aKTHBHicTM (Traub et al., 2006; Cherno and Kapustyan, 2016). Ha puc. 4 npegcTaBjeHO 3ajeKHicTb HaKOnuneHHa HMQ Big Bugy npOTea3H, rpHB&rocTi $epMeHrom3y Ta Tuny cy6cTpaTy (HaTHBHi KjiTHHH Lactobacillus acidophilus K 3111 Ta nenragOraiKaHiB nicja yjbrpa3ByKOBOi o6po6kh 6aKTe-pin.
4
3 3,5
is 3 С
S 2,5 Л « 2
a 1,5
I 1
й 0,5 0
30 60 90 120 150
210 240 270 300
Тривалсть ферментолзу, хв "'Протосубтилш ■ Панкреатин л Папа!н
a) 6)
Phc.4. 3ajeKHicTb HaKOnuneHHa HMQ y $epMeHTOm3arax Lactobacillus acidophilus K 3111 Big Bugy npOTea3H Ta TpHBajOcri $epMeHTOji3y (npu cniBBigHOmeHHi $epMeHT:cy6cTpaT 1:100): a) $epMeHTOji3 yjbTpa3ByKOBOrO ge3iHTerpaTy Lactobacillus acidophilus K 3111; 6) $epMeHTOji3 Lactobacillus acidophilus K 3111 6e3 nOnepegHbOi yjbTpa3ByKOBOi o6po6kh
3
2
0
Аналiзуючи даш рис. 4 можна зробити висновок, що ефективнiсть ферментолiзу рiзними видами проте-аз протеоглiканiв клiтинних стшок бактерiй, що були пiдgанi ульразвуковш обробцi, в аспектi накопичення НМП е беззаперечною, порiвняно з ферментолiзом протеоглiканiв нативних клiтин Lactobacillus acidophilus K 3111. Так, накопичення НМП у реакцш-ному сереgовищi при ферментолiзi протеоглiканiв бактерiй п1дданих ультразвуковш обробцi папа!ном ~ на 55% б№ше, н1ж при ферментолiзi таких нативних клггин цим же ферментом, панкреатином - ~ на 46% бшьше, протосубтилiном - ~ на 52% б№ше. При порiвняннi кiлькостi НМП у ферменкшзатах ультра-
звукових gезiнтегратiв рiзними протеазами можна зробити висновок, що найбшьш ефективним е засто-сування папа1ну, оск1льки при цьому накопичуеться найбiльша кiлькiсть - 6,4 мг/см3 НМП у реакцiйному сереgовищi, що на 25% бшьше, шж за обробки панкреатином, та на 27% бшьше, шж за обробки прото-субтилшом.
Такий характер ферментолiзу рiзними протеазами можна пояснити характером гхнъо! субстратно! спе-цифiчностi. Так, папа!н може гiдролiзувати пептиgнi зв'язки пептиgоглiкану клiтинних стiнок бактерiй, що утвореш лiзином та глiцином, яш gомiнують у струк-турi пептидоглшану (рис. 2). Щодо панкреатину, до
складу якого входять протеази трипсин та хiмотрип-син, та субтил^ - !хня субстратна спeцифiчность дещо вища, шж у папа!ну, тому i ймовiрнiсть пдроль зу спeцифiчних зв'язк1в у складi пeптидоглiкану мен-ша, що й пiдтвeрджуеться результатами дослщжень.
3 8
5 --
£ 4
На наступному eтапi дослвджень визначали залеж-нiсть накопичення НМП у фeрмeнтолiзатах Lactobacillus acidophilus K 3111 вщ вмiсту ферменту у реакцшному сeрeдовищi (тривалiсть шкубацп склада-ла 180 хв) (рис. 5).
я я о
X 1
0
1:50 1:100 1:150 1:200 1:250 1:300
7
6
Сшввщношення фермент : субстрат □ Протосубтилш □ Панкреатин □ Папаш
Рис. 5. Залeжнiсть накопичення НМП у фeрмeнтолiзатах Lactobacillus acidophilus K 3111 вщ типу ферменту та сшввщношення фермент : субстрат (тривалють фeрмeнтолiзу 180 хв)
Результати eкспeримeнтiв сввдчать про те, що най-бшьший вмiст НМП у середовищах фeрмeнтолiзатiв рiзних протеаз досягаеться ¡з застосуванням неодна-кових концeнтрацiй фeрмeнтiв у реакцшних сумiшах. Так, найбiльший вмют НМП у фeрмeнтолiзатi, отри-маному з використанням папа1ну мае мюце при сшв-вiдношeннi фермент : субстрат 1 : 200 та складае 6,6 мг/см3; ¡з використанням панкреатину - при ств-вщношенш фермент : субстрат 1 : 100 та складае 4,5 мг/см3; ¡з використанням протосубтилшу - при сшввщношенш фермент : субстрат 1 : 150 та складае 4,2 мг/см3. При цьому тeндeнцiя у превалюванш вмю-
ту НМП у фeрмeнтолiзатах, отриманих ¡з використанням папашу збертаеться.
1з метою наочно! дeмонстрацi! eфeктивностi за-пропонованих мeтодiв дeзiнтeграцi! лактобацил, залучено методи мшроскопп. На рис. 6 зображено мшро-фотографi! мiкробних клiтин до та тсля ультразвуко-во! обробки за частоти 35 кГц протягом 600 с, а також тсля фeрмeнтолiзу протeоглiкана бактeрiй, що тдда-вали ультразвуковiй обробцi, папа!ном при сшвввд-ношeннi фермент : субстрат 1 : 200 та тривалосл про-цесу 180 хв.
'/ •J- 4 J r % k * *' N " * ч
'J *
*
v V% 10 мкм V-
Рис. 6. Мiкрофотографi! Lactobacillus acidophilus K 3111: а) нативш клiтни; б) пiсля обробки ультразвуком протягом 600 с за частоти 3 кГц; в) тсля фeрмeнтолiзу ультразвукового дезштеграту папа!ном при сшввщношенш фермент:субстрат 1 : 100 та тривалосл 180 хв
Мкрофотографп на рис. 6 дозволяють констатува-ти ефектившсть обраних мeтодiв та рeжимiв деструк-цi!. На рис. 6а представлено контрольний зразок -нативш клгтини Lactobacillus acidophilus K 3111, яш мають чiткий контур та строго визначену форму. Стан бюмаси на рис. 6 б вже рiзко вiдрiзняеться ввд
контрольного зразка, порушено цшсшсть основно! маси бактeрiальних клiтин. Отже, застосування ульт-развуково! дeзiнтeграцi! створило передумови для бшьш ефективного ферментативного гiдролiзу пепти-доглшашв клiтинних стiнок, оск1льки зовнiшня захи-сна оболонка бактeрiй е значною перепоною для кон-
TaKTy aKTHBHHx nenrpiB ^epMenriB 3i специ^iнним cy6cTpaTOM, mo nigTBepgKyeTbca pe3yjbTaTaMH gocji-gKeHb, HaBegeHHMH Ha puc. 4 a,6. Qicja $epMeHT0m3y (puc. 6b) 3ajumaMTbca oguHHii He nomKogKeHux 330B-Hi KjiTHH, aje n He 3gaTHux go KOjOHieyTBopeHHa.
nicja npoBegeHHa cepii' gocjigiB, b aKux npoBoguju geTeKiiiM HMQ y cKjagi ge3iHTerpaTiB 6aKTepiaubHHx KjiTHH, goiijbHHM 6yjo npoBogeHHa gocjigKeHHb mogo igeHTH^iKaiii' MyponenTugiB y ix cKjagi. HaaBHicTb cnojyK MyponenTugHoro pagy BH3Hanaju 3a peaKiieM 3 Ahtpohobhm peareHTOM, aKa 6a3yeTbca Ha TOMy, mo ByrjeBogHa HacTHHa MyponenTugiB (MypaMOBa KucjOTa Ta N-aieTHjrjMK03aMiH) 3a gonoMoroM KOHnenrpoBa-hoi cyjb^aTHoi' khcjoth nepeTBopMeTbca Ha $yp$ypoj a6o noro noxigHi, aKi mjaxoM KOHgeHcaiii 3 peareHTOM AHTpoHa yTBopMMTb cnojyKH 3ejeHoro Kojbopy. Цi MaHinyjaiii BHKOHyBaju 3i 3pa3KaMH, aKi paHime nigga-Bajiu i0H006MiHHiH xpoMarorpa^ii', 3 MeTOM n036aBjeH-Ha Big HeirrpajibHHx ByrjieBogiB, aKi MOKyTb nepemKO-gKaTH HucTOTi eKcnepuMeHTy.
TaKHM hhhom BcTaHOBjeHO, mo y cKjagi ^epMenro-ji3ary, OTpuMaHOMy 3 BHKopHcraHHaM nanaiHy npu cniBBigHomeHHi ^epMenr : cy6cTpaT 1:200 BMicr MyponenTugiB cKjagae 38% Big 3arajbHoro BMicTy HMQ, i3 BHKopucTaHHaM naHKpeaTHHy npu cniBBigHomeHHi $ep-MeHT : cy6cTpaT 1:100 - 31%; i3 BHKopucTaHHaM np0T0-cy6THjiHy npu cniBBigHomeHHi ^epMenr : cy6cTpaT 1:150 - 23%.
EHCHOBKH
^OdigKeHO 3aK0H0MipH0cTi yjbTpa3ByK0B0i ge3iH-Terpaiii Lactobacillus acidophilus K 311. BcTaHOBjeHO, mo paiioHajbHHMH yMOBaMH o6po6kh 6i0Macu e: Hacro-Ta 35 kTi, TepMiH eKcn03Hiii 600 c Bu3HaneH0 3aK0H0-MipHocTi $epMeHT0ji3y nenTugorjiKaHiB KjiTHHHux cTiHOK Lactobacillus acidophilus K 3111 naHKpearuHOM, nanaiHOM Ta np0T0cy6THjiH0M. Q0Ka3aH0, mo yjbrpa3-ByKOBa ge3iHTerpaiia, aKa nepegye ^epMenrarHBHOMy rigpoji3y, cnpuae cyrreBOMy, ManKe Ha 50%, 3pocraH-hm BMicTy HMQ y $epMeHT0m3arax. 06rpyHT0BaH0 goiijbHicTb BHKopucTaHHa ^epMenry pocjHHHoro no-xogKeHHa nanaiHy gja eH3HMaTHHH0i ^parMeHTaiii nenragomKaHy. npu cniBBigHomeHHi ^epMenr (nanaiH) : cy6crpar 1 : 200 Ta rpHBajocTi nponecy npOTarOM 180 xb gocaraeTbca Han6ijbmHn BMicT HMQ y ^epMeH-T0ji3aTax (6,6 Mr/cM3). ^OBegeHO, mo y cKjagi npogyK-TiB $epMeHT0ji3y MicTaTbca nijbOBi cnojyKH - Mypone-nTugu, BMicT aKux carae 38% Big 3arajbH0i KijbKocri HMQ npu $epMeHT0ji3i nanaiHOM, 31% - naHKpeaTH-hom Ta 23% - np0T0cy6THjiH0M.
References
Kapustyan, A.I., & Cherno, N.K. (2015). Perspektivyi ispolzovaniya biologicheski aktivnyih bakterialnyih gidrolizatov dlya nutritivnoy podderzhki naseleniya s rastroystvami immunnoy sistemyi. Pischevaya nauka i tehnologiya. 2(31), 18-25. doi: 10.15673/20738684.31/2015.44263 (in Russian). Cherno, N., & Kapustyan, A. (2016). Immunological properties of the bacterial origin compounds. Food
science and technology, 10(3), 19-28. doi: http://dx.doi.org/10.15673/fst.v10i3.175.
Vavricka, S.R. (2004). hPepTl transports muramyl dipeptide, activating NF -kappaB and stimulating IL-8 secretion in human colonic Caco2/bbe cells. Gastroenterology. 127, 1401-1409.
Traub, S., Aulock, Von, S., Hartung, T., & Hermann, C.
(2006). MDP and other muropeptides - direct and synergistic effects on the immune system. J Endotoxin Res. 12, 69-85. doi: 10.1179/096805106X89044.
Qingshan, Lv. et al. (2012). MDP Up-Regulates the Gene Expression of Type I Interferons in Human Aortic En-dothelial Cells. Molecules. 17, 3599-3608. doi: 10.3390/molecules17043599.
Matsui, K., Matsui, K., & Ikeda, R. (2014). Peptidoglycan in combination with muramyldipeptide synergistically induces an interleukin-10-dependent T helper 2-dominant immune response. Microbiol Immunol. 58, 260-265. doi: 10.1111/1348-0421.12139.
Kawai, T., & Akira, S. (2010). The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: Update on Toll-like receptors. Nat. Immunol. 11, 373-384. doi: 10.1038/ni.1863.
Chapot-Chartier, M.P., & Kulakauskas, S. (2014). Cell wall structure and function in lactic acid bacteria. Microb Cell Fact. 13, 1-9. doi: 10.1186/1475-2859-13-S1-S9.
Matsumoto, S. et al. (2009). A component of polysaccharide peptidoglycan complex on Lactobacillus induced an improvement of murine model of inflammatory bow-el disease and colitis-associated cancer. Immunology. doi: 10.1111/j.1365-2567.2008.02942.x.
Ku'hner, D., Stahl, M., Demircioglu, D.D., & Bertsche, U. (2014). From cells to muropeptide structures in 24 h: Peptidoglycan mapping by UPLC-MS. Sci. Rep. 4, 74-94. doi: 10.1038/srep07494.
Regulski, K. (2012). Analysis of the Peptidoglycan Hydrolase Complement of Lactobacillus casei and Characterization of the Major c-D-Glutamyl-L-Lysyl-Endopeptidase. PLoS ONE. 7(2), e32301. doi: 10.1371/journal.pone.0032301.
Gavrilin, M.V., Senchukova, G.V, & Senchenko, S.P.
(2007). Vyibor optimalnyih usloviy polucheniya gidrolizatov molochnokislyih bakteriy termokislotnyim sposobom. Him.-farm. Zhurn. 41(2), 54-56 (in Russian).
Senchenko, S.P., Samoylov, V.A., Gostischeva, N.M, Senchukova, G.V., & Gavrilin, M.V. (2005). Izuchenie sostava preparata, poluchennogo na osnove gidrolizata molochnokislyih bakteriy. Him.-farmats. Zhurn. 39(3), 51-53 (in Russian).
Livinskaya, E.P., Kovalenko, N.K., & Garmasheva, I.L. (2011). Dezintegraciya laktobacill i ehnterokokkov dlya polucheniya fragmentov kletochnyh stenok. Mikrobiologichnij zhurnal. 73(3), 26-32 (in Russian).
Ovsyannikova, L.V., & Komarova, E.L. (2012). Sravnytel'naya kharakterystyka proteolytycheskykh fermentov rastytel'noho proyskhozhdenyya - papayna y bromelayna, Dietary supplements market. 7(74), 3 (in Russian).
HayKOBHH BicHHK ^HyBME iMeHi C.3. IW^KOTO, 2018, T 20, № 85
Geiger, C., Spieb, T., Korn, S.M., Kötter, P., & Entian, Semak, I.V., Zyiryanova, T.N., & Gubich, O.I. (2007).
K.-D. (2017), Specificity of subtilin-mediated Biohimiya belkov: praktikum dlya studentov biol.
activation of histidine kinase SpaK, Appl Environ Fak. spets. 1-31 01 01 «Biologiya», Minsk: BGU (in
Microbiol. 83. doi: 10.1128/AEM.00781-17. Russian).
Golovach, T.N., Gavrilenko, N.V., Zhabanos, N.K., & Morris, D.L. (1948). Quantitative Determination of
Kurchenko, V.P. (2008). Zakonomirnosti hidrolizu Carbohydrates With Dreywood's Anthrone Reagent.
syrovatkovykh bilkiv ekzo- I endoproteaz. Works Science, 107(2775), 254-255.
BGU of Biochemistry. 3(1), 1-15 (in Russian). Shaphaev, E.G. Tsyirenov, V.Zh., & Chebunina, E.I.
Yakubke, H.-D., & Eshkide, H. (1985), Aminokislotyi, (2015). Dezintegratsiya kletok v biotehnologii.
peptidyi, belki. Trans. from gem. (in Russian). Uchebnoe posobie, VSGTU,Ulan-Ude in Russian).
