CC BY
11
https://doi.org/10.17116/molgen20203801140
Общая выживаемость больных раком молочной железы зависит от сочетания полиморфизмов гена фактора некроза опухоли и HLA-гаплотипов
© Т.Ф. МАЛИВАНОВА1' 2, Е.В. АЛФЕРОВА1, А.С. ОСТАШКИН2, Т.А. АСТРЕЛИНА2, Н.Н. МАЗУРЕНКО1
'ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва, Россия; 2ФГБУ «ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна» ФМБА России, Москва, Россия
Резюме
Введение. Фактор некроза опухоли (TNF) — это провоспалительный цитокин, вовлеченный в патогенез ряда заболеваний, в т.ч. онкологических и аутоиммунных. Полиморфизмы -308(g/a)TNF и -238(G/A)TNF входят в расширенные наследственные гаплотипы, охватывающие весь комплекс генов HLA. Мы предположили, что обнаруженное ранее влияние этих полиморфизмов на общую выживаемость (ОВ) больных раком молочной железы (РМЖ) может быть следствием кооперации с геномным окружением, а именно — с гаплотипами AH8.1 и B57, связанными с аутоиммунными состояниями. Материал и методы. В работе использована архивная коллекция ДНК от 442 первичных больных РМЖ и 327 женщин контрольной группы с известными генотипами -308(g/a)TNF и -238(G/A)TNF. На маркерные аллели AH8.1 и B57 были протестированы 412 больных РМЖ.
Результаты. В ходе исследования была подтверждена ассоциация аллелей -308a и -238A гена TNF с маркерами гаплоти-пов AH8.1 и B57 соответственно. Анализ результатов исследования показал, что полиморфизмы гена TNF не влияют на предрасположенность к заболеванию РМЖ, но существенно снижают ОВ больных РМЖ, причем конечный эффект полиморфизмов гена TNF на прогноз заболевания зависит от геномного контекста. При II стадии заболевания 10-летнюю ОВ выше 80% имели носители генотипа -308ag/-238GG при наличии маркерных аллелей AH8.1 и -308gg/-238GG независимо от маркеров AH8.1, тогда как 10-летняя ОВ была ниже 50% у носителей -308ag/-238GG в отсутствии маркеров AH8.1 и у носителей генотипа -308gg/-238AG (p=0,0076).
Заключение. Механизмы действия -308(g/a)TNF и -238(G/A)TNF отличаются, и снижение ОВ у носителей минорного аллеля -238A опосредовано его ассоциацией с HLA-B*57, тогда как снижение ОВ у носителей -308a, напротив, не связано с наследственным гаплотипом AH8.1. Таким образом, выявлены две генетически детерминированные группы больных РМЖ, имеющие неблагоприятный прогноз в условиях стандартной терапии РМЖ.
Ключевые слова: полиморфизм TNF, HLA, наследственный гаплотип, рак молочной железы, общая выживаемость. ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:
Маливанова Т.Ф. — e-mail: tmalivanova@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-9699-2603 Алферова Е.В. — e-mail: skoromyslovalena@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-3423-9816 Осташкин А.С. — e-mail: ostashkin@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-5809-0075 Астрелина Т.А. — e-mail: t_astrelina@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-3629-0372 Мазуренко Н.Н. — e-mail: nnmazurenko@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-4767-6983
Автор, ответственный за переписку: Маливанова Т.Ф. — e-mail: tmalivanova@yandex.ru
КАК ЦИТИРОВАТЬ:
Маливанова Т.Ф., Алферова Е.В., Осташкин А.С., Астрелина Т.А., Мазуренко Н.Н. Общая выживаемость больных раком молочной железы зависит от сочетания полиморфизмов гена фактора некроза опухоли и HLA-гаплотипов. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2020;38(1):40—48. https://doi.org/10.17116/molgen20203801140
Breast cancer patients overall survival depends on a combination of the polymorphisms of tumor necrosis factor gene and HLA-haplotypes
© T.F. MALIVANOVA1'2, E.V. ALFEROVA1, A.S. OSTASHKIN2, T.A. ASTRELINA2, N.N. MAZURENKO1
1FSBI «N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology» of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow, Russia; 2 FSBI «SRC A.I. Burnasyan Federal Medical Biophysical Center» of Federal Medical Biological Agency, Moscow, Russia
Abstract
Background. Tumor necrosis factor (TNF) is a proinflammatory cytokine involved in the pathogenesis of a number of diseases, including cancer and autoimmune diseases. The -308(g/a)TNF and -238(G/A)TNF polymorphisms are included in the extended ancestral haplotypes covering the full range of HLA genes. We suggested that the previously discovered effect of these polymorphisms on the breast cancer patients overall survival may be the result of cooperation with the genomic environment, namely, the AH8.1 and B57 haplotypes associated with autoimmune conditions.
Methods. We used the archival collection of DNA from 442 primary BC patients and 327 women of control group with known
genotypes -308(g/a)TNFand -238(G/A)TNF. 412 BC patients were tested for marker alleles of AH8.1 and B57. The obtained results confirmed the association of -308a and -238A with markers of haplotypes AH8.1 and B57 respectively.
Results. Analysis of the results showed that TNF gene polymorphisms do not affect the predisposition to breast cancer, but significantly reduce the OS of BC patients, and the final effect of TNF gene polymorphisms on the disease prognosis depends on the genomic context. At stage II of the disease, the carriers of the -308ag and -238GG in the presence of the markers of AH8.1 and the carriers of the -308gg/-238GG (regardless of the AH8.1 markers) had the 10-year OS above 80%, while the 10-year OS was below 50% for the -308ag/-238GG carriers in the absence of AH8.1 markers and for -308gg/-238AG carriers (p=0.0076). Conclusions. It was concluded that the mechanisms of action of -308(g/a)TNF and -238(G/A)TNF are different, and the decrease of OS for carriers of the minor allele -238A is mediated by its association with HLA-B*57, while the decrease of OS for carriers of the -308a, in contrast, is not associated with the ancestral haplotype AH8.1. Thus, two genetically determined groups of BC patients have been identified that have an unfavorable prognosis in the conditions of standard BC therapy.
Keywords: TNF polymorphisms; HLA; ancestral haplotype; breast cancer; overall survival. INFORMATION ABOUT AUTHORS:
Malivanova T.F. — e-mail: tmalivanova@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-9699-2603 Alferova E.V. — e-mail: skoromyslovalena@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-3423-9816 Ostashkin A.S. — e-mail: ostashkin@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-5809-0075 Astrelina T.A. — e-mail: t_astrelina@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-3629-0372 Mazurenko N.N. — e-mail: nnmazurenko@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-4767-6983
Corresponding author: Malivanova T.F. — e-mail: tmalivanova@yandex.ru
TO CITE THIS ARTICLE:
Malivanova T.F., Alferova E.V., Ostashkin A.S., Astrelina T.A., Mazurenko N.N. Breast cancer patients overall survival depends on a combination of the polymorphisms of tumor necrosis factor gene and HLA-haplotypes. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2020;38(1):40—48. (Russian). https://doi.org/10.17116/molgen20203801140
Введение
Фактор некроза опухоли (Tumor necrosis factor, TNF) — это провоспалительный цитокин, который играет значительную роль в патогенезе большого ряда заболеваний, в том числе онкологических и аутоиммунных [1, 2]. Ген TNF расположен на 6 хромосоме (6p21.3) в высоко полиморфной области комплекса гистосовместимости HLA III класса, на расстоянии 250 kb от HLA-B локуса I класса и 850 kb от HLA-DR локуса II класса. Ген TNF имеет ряд функциональных полиморфизмов, из которых наиболее изучены однонуклеотидные замены в промо-торной области -308(g/a)TNF (rs1800629) и -238(G/ A)TNF (rs361525) [3] (для удобства аллели -308(g/a) TNF и -238(G/A)TNF обозначены строчными и заглавными буквами соответственно). Известно, что эти полиморфизмы входят в расширенные наследственные гаплотипы (ancestral haplotype), охватывающие весь комплекс генов HLA. Один из наиболее распространенных гаплотипов — AH8.1 (обнаруживается в 9% случаев в европейской популяции), в состав которого входят аллели HLA-A*1, HLA-B*8, HLA-DRB1*3 и -308(a)TNF, ассоциирован с повышенным уровнем синтеза TNF и предрасположенностью к аутоиммунным заболеваниям [4, 5]. В свою очередь аллель -238(A)TNF ассоциирован с низкой продукцией цитокина и образует уникальный га-плотип B57 с аллелем HLA-B*5701, известным как протективный аллель в патогенезе инфекции HIV-1 [6]. Предполагается, что эффект гаплотипов ком-
плекса HLA может быть связан с уровнем экспрессии гена TNF, однако, напротив, эффект TNF может быть обусловлен сцепленностью с генами комплекса HLA.
В патогенезе онкологических заболеваний TNF может выполнять разнонаправленные функции: вызывать как апоптоз, так и пролиферацию опухолевых клеток; стимулировать инфильтрацию опухоли клетками иммунной системы и способствовать инвазии и метастазированию опухолевых клеток [1].
Рак молочной железы (РМЖ) — это наиболее распространенное онкологическое заболевание у женщин. Противоопухолевая активность TNF при РМЖ активно изучается в доклинических и клинических исследованиях. Хотя клиническое применение TNF ограничивается системной токсичностью, перспективным считается его использование как адъюванта в сочетании с химио- и лучевой терапией [7]. Необходимо, однако, учитывать влияние микроокружения, клеточного и геномного контекста на конечные эффекты TNF. Полиморфизм гена TNF изучается как фактор риска и прогноза РМЖ. Ранее нами была показана зависимость общей выживаемости (ОВ) больных РМЖ от полиморфизмов -308(g/a)TNF и -238(G/A)TNF [8, 9]. В настоящем исследовании мы попытались ответить на вопрос, не является ли влияние полиморфизмов гена TNF на ОВ следствием кооперации с генным окружением, а именно — с наследственными гаплотипами комплекса HLA, вовлеченными в аутоиммунные процессы.
Материал и методы
В работе использована архивная коллекция ДНК от 442 первичных больных РМЖ с подтвержденным гистологическим диагнозом и 327 женщин без онкологических и аутоиммунных заболеваний (группа клинического контроля) с известными генотипами -238(G/A)TNFи -308(g/a)TNF, частично описанные ранее [8—10]. Средний возраст больных РМЖ составил 54,2 года (от 23 до 80 лет), в контрольной группе — 53,7 года (от 19 до 89 лет). Для 420 больных РМЖ имелись данные о стадии заболевания. Поскольку только 2,9% больных имели IV стадию РМЖ, этих больных включили в группу с III стадией РМЖ, и в целом распределение по стадиям заболевания было следующим: I — 25,0%; II — 46,4%; III — 28,6%. Сведения о состоянии больных РМЖ за время наблюдения с момента первичной госпитализации были получены в 278 случаях.
Аллели HLA-A*1, HLA-B*8 и HLA-DRB1*03 определяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) у 412 больных РМЖ; HLA-B*57 — у 169 больных РМЖ. В реакции использовали аллель-специфические праймеры: A1_F: 5'-ggACCAggAgACACg-gAATA-3' A1_R: 5'-AggTATCTgCggAgCCCg-3'; B8_F: 5'-gACCggAACACACAgATCTT-3' B8_R: 5'-CCgCgC-gCTCCAgCgTg-3' [11]; B57_F: 5'-gCTCACATCATC-CAggT-3' B57_R: 5'-CgTCTCCTTCCCgTTCTC-3'; B57_ R0101: 5'-ATCCTTgCCgTCgTAggCgg-3' B57_R0102: 5'-ATCCTTgCCgTCgTAGGCAG-3' [12]; DR3_F: 5'-TACTTCCATAAC CaggAggAgA-3' DR3_R: 5'-Tg-CAgTAgTTgTCCACCCg-3' [13]. Аллели -238(G/A)TNF определяли методом ПЦР-ПДРФ, как описано ранее [9].
Для определения гаплотипа -308/-238 гена TNF в образцах, гетерозиготных по обоим исследуемым сайтам (генотип -308ag/-238AG), проводили ПЦР с использованием аллель-специфических праймеров для определения полиморфизма -308(g/a)TNF: TNF-308aF 5'-AATAggTTTTgAggggCATgA-3' TNF-308gF 5'-ATAggTTTTgAggggCATgg-3' TNF-308R 5'-TCTC-ggTTTCTTCTCCATCg-3' [14], т.к. эта область продукта ПЦР включает положение полиморфизма -238(G/A)TNF (рис. 1, а). Нуклеотидную последовательность продукта ПЦР каждого гаплотипа определяли обратным секвенированием по Сенгеру.
При анализе полученных данных группы сравнивали двусторонним критерием Фишера. Для проверки согласия распределения генотипов с распределением, равновесным по Харди-Вайнбергу, использовали критерий Пирсона. Распределение гаплотипов -238/-308 гена TNF определяли прямым подсчетом. Для оценки риска заболевания рассчитывали отношение шансов и представляли как OR [95% доверительный интервал — CI]. Критерием оценки прогностической значимости признака являлось отношение рисков HR [95% CI]; показатели 10-летней ОВ
представляли как Mean±SE%; сравнение кривых ОВ проводили методом Каплана-Майера с применением Logrank Test в программе GraphPad Prism (Version 4.00). Для всех критериев различия считали достоверными при достижении p<0,05.
Результаты
Данные о полиморфизме гена TNF были проанализированы для 442 больных РМЖ и 327 женщин контрольной группы. Распределение генотипов -308(g/a)TNF и -238(G/A)TNF соответствовали теоретическому распределению по Харди-Вайнбергу (p>0,05). Распределение генотипов и гаплотипов по этим сайтам у больных РМЖ и в контрольной группе статистически значимых отличий не имело, а полученные значения OR не позволяют говорить о влиянии этих полиморфизмов на предрасположенность к заболеванию РМЖ (табл. 1).
Необходимо отметить, что все 7 образцов (3 из контрольной группы и 4 от больных РМЖ), гетерозиготных как по сайту -238(G/A)TNF, так и по сайту -308(g/a)TNF, в каждом из гаплотипов своего диплоидного набора имели только одну из полиморфных замен (см. рис. 1, б). Соответственно, двойной гетерозиготный генотип -308ag/-238AG учитывался в анализе как содержащий 2 гаплотипа: -308a/-238G и -308g/-238A (см. табл. 1). Таким образом, за исключением этих образцов, носители трех гаплотипов -308/-238 гена TNF — a/G, g/G и g/A — фактически соответствуют носителям генотипов ag/GG, gg/GG и gg/AG. Носители генотипа aa/GG (в нашей выборке 1,4% среди больных РМЖ) для дальнейшего анализа были включены в группу ag/GG.
412 больных РМЖ были протестированы на маркеры расширенного гаплотипа AH8.1 — аллели HLA-A*1, HLA-B*8и HLA-DRB1*03 (табл. 2). В 8,5% случаев встречались 3 маркера одновременно, что соответствует данным литературы [15]. HLA-B*57 был выявлен только у носителей аллеля -238A, но не у носителей гомозиготы -238GG гена TNF (74,4% и 0% соответственно; p=7,1D-22). Кроме того, дополнительно в гнездовой ПЦР были протестированы образцы, положительные по HLA-B*57, из которых 96% (24 из 25) имели аллельный субтип HLA-B*5701.
Распределение маркерных аллелей AH8.1 у носителей генотипов -308/-238 гена TNF — gg/GG, ag/GG и gg/AG — представлено в табл. 2. Группа носителей ag/GG достоверно отличалась по частотам аллелей HLA-A*1, HLA-B*8 и HLA-DRB1*03 от носителей как gg/GG, так и gg/AG генотипов, за исключением HLA-A*1 у носителей gg/AG (см. табл. 2). Для генотипа -238AG была отмечена высокая частота аллелей HLA-A*1 (30,3%), что соответствует данным литературы, поскольку наследственный гаплотип B57 наряду с минорным алле-лем A полиморфизма -238(A/G)TNF и аллелем
Таблица 1. Распределение генотипов и гаплотипов гена TNF у больных РМЖ (n=442) и в контрольной группе (n=327)
Выборка Контроль РМЖ Г»!? f^Tl
n % n % UK [95% CI]
Генотип -308(g/a) aa 2 0,6 6 1,4 2,2 [0,4; 11,2]
ag 76 23,2 105 23,8 1,03 [0,7; 1,4]
gg 249 76,1 331 74,9 0,9 [0,7; 1,3]
Генотип -238(G/A) AG 20 6,1 35 7,9 1,3 [0,7; 2,3]
GG 307 93,9 407 92,1 0,8 [0,4; 1,3]
Генотип -308/-238 aa/GG 2 0,6 6 1,4 2,2 [0,4; 11,2]
ag/GG 73 22,3 101 22,9 1,03 [0,7; 1,5]
gg/GG 232 70,9 300 67,9 0,9 [0,6; 1,2]
gg/AG 17 5,2 31 7,0 1,4 [0,7; 2,5]
ag/AG 3 0,9 4 0,9 0,9 [0,2; 4,4]
Гаплотип -308/-238 g/A 20 3,1 35 4,0 1,3; [0,7; 2,3]
g/G 554 84,7 732 82,8 0,87; [0,66; 1,15]
a/G 80 12,2 117 13,2 1,1; [0,8; 1,5]
Таблица 2. Распределение маркерных аллелей гаплотипов AH8.1 и B57 у больных РМЖ с различными генотипами TNF
Маркеры гаплотипов Всего A*1 B*8 DKB1*3 M+ 1 AH.8.1 2 Всего B*57
Все РМЖ n=412 93 55 75 131 35 n=165
22,6% 13,3% 18,2% 31,8% 8,5%
Генотип TNF
-238AG n=33 10 4 7 15 2 n=35 25
30,3% 12,1% 21,2% 45,5% 6,1% 71,4%
-238GG n=379 83 51 68 116 33 n=130 0
21,9% 13,5% 17,9% 30,6% 8,7% 0,0%
pF -238AG vs -238GG 0,3 1 0,6 0,08 1 7,1D-22
Генотип TNF
-308ag n=107 47 48 46 64 30 n=47 4
43,9% 44,9% 43,0% 59,8% 28,0% 8,5%
-308gg n=305 46 7 29 67 5 n=118 21
15,1% 2,3% 9,5% 22,0% 1,6% 17,8%
pF -308ag vs -308gg 5,7D-9 2,8D-25 4,0D-13 3,1D-12 9,7D-15 0,16
TNF -308/-238
gg/AG n=29 7 1 5 12 0 n=31 21
24,1% 3,4% 17,2% 41,4% 0,0% 67,7%
gg/GG n=276 39 6 24 55 5 n=87 0
14,1% 2,2% 8,7% 19,9% 1,8% 0,0%
ag/GG n=103 44 45 44 61 28 n=43 0
42,7% 43,7% 42,7% 59,2% 27,2% 0,0%
ag/AG n=4 3 3 2 3 2 n=4 4
3 из 4 3 из 4 2 из 4 3 из 4 2 из 4 4 из 4
pF gg/AG vs ag/GG 0,085 1,6D-5 0,016 0,096 5,4D-4 2,9D-11
pF gg/GG vs ag/GG 1,04D-8 3,4D-23 4,5D-13 9,4D-13 5,2D-13 1
pF gg/GG vs gg/AG 0,17 0,51 0,13 0,016 1 4,7D-16
Примечание. 1 — генотип содержит 1 или более маркерных аллелей гаплотипа ЛН.8.1 (Л*1, В*8, DRB1*3); 2 — генотип содержит 3 маркерных аллеля гаплотипа ЛН.8.1 (Л*1, В*8, DRB1*3).
HLA-B*57 включает также HLA-A*1 [15, 16]. Следует отметить, что из 4 носителей двойного гетерозиготного генотипа -308ag/-238AG гена TNF все были положительными по HLA-B*57, а 2 из них имели все 3 маркера AH8.1. Таким образом, как и ожидалось, с маркерами AH8.1 ассоциируется генотип -308ag, тогда как с маркерами гаплотипа B57 ассоциируется -238AG гена TNF.
В качестве характеристики конечного эффекта полиморфных аллелей мы рассматривали ОВ больных РМЖ. Мы не обнаружили статистически значимых отличий для всей выборки, и 10-летняя ОВ составила 65,0+10,6% для gg/AG генотипа, 73,6+3,3% для gg/GG и 75,0+5,3% для ag/G (рис. 2, а). Для носителей генотипа -308gg/-238AG снижение 10-летней ОВ до 50,0+17,7% было связано с HLA-B*57, хотя эта
Рис. 1. Результат секвенирования двойного гетерозиготного генотипа -308ag/-238AG гена TNF.
а — последовательность продукта ПЦР с использованием аллель-специфических праймеров TNF-308a/gF и TNF-308R [14] (подчеркнуты) включает сайты однонуклеотидных замен -308(g/a)TNFn -238(G/A)TNF(выделены жирным шрифтом); б — фрагмент сиквен-са ПЦР-продуктов: вверху — гаплотип -308a/-238G, внизу — гаплотип -308g/-238A гена TNF.
Рис. 2. Обшая выживаемость больных РМЖ в зависимости от генотипов -308/-238 гена TNF и маркерных аллелей наследственных гаплотипов AH8.1 и В57.
Кривые общей выживаемости по Каплану-Майеру. Ось абсцисс — время наблюдения, мес. Ось ординат — общая выживаемость, %. а — ag/GG, gg/GG, gg/AG генотипы -308/-238 гена TNF; б — кривые общей выживаемости для носителей генотипа gg/AG гена TNF при наличии или отсутствии аллелей HLA- A*1 и HLA-B*57; в — AH8.1+ содержит одновременно 3 маркерных аллеля HLA-A*1, HLA-B*8, HLA-DRB1*3; г — М+ содержит 1 или более маркерных аллелей гаплотипа AH.8.1.
зависимость не была статистически значимой (см. рис. 2, б). Не обнаружено статистически значимого влияния на ОВ больных РМЖ гаплотипа AH8.1 (см. рис. 2, в). Поскольку число носителей одновременно трех маркерных аллелей гаплотипа AH8.1 было мало (8,5% в нашей выборке), в дальнейшем группы сравнения формировали в зависимости от наличия хотя бы одного из маркерных аллелей HLA-A*1, HLA-B*8 и HLA-DRB1*03 или при отсутствии этих аллелей (обозначали как М+ и M— соответственно) (см. рис. 2, г).
Далее мы попытались выявить влияние маркерных аллелей AH8.1 (М+) на ОВ носителей генотипов gg/AG, gg/GG и ag/GG гена TNF (рис. 3, а). Значимое различие было выявлено только для генотипа ag/GG (10-летняя ОВ составила 87,2±5,4% при наличии хотя бы одного маркера AH8.1 и 56,0±9,9% в отсутствии аллелей AH8.1; Logrank test p=0,0052; HR=3,8 [1,4; 11,1]) (см. рис. 3, а). Для носителей gg/AG 10-летняя ОВ имела даже большее, однако статистически недостоверное различие при наличии маркерных аллелей AH8.1 и в их отсутствие (88,9±10,5% и 44,4±16,6% соответственно; Logrank test p=0,064; HR=5,9 [0,9; 22,9]) (см. рис. 3, а).
Встречаемость как маркерных аллелей гаплоти-па AH8.1, так и минорных аллелей полиморфизмов -238(G/A)TNFи -308(g/a)TNF, от стадии РМЖ не зависела (см. рис. 3, б). При включении стадийности РМЖ в анализ зависимости ОВ от генотипов TNF были отмечены 3 группы кривых выживаемости (см. рис. 3, в). Носители распространенного gg/GG генотипа при II стадии заболевания имели высокую 10-летнюю ОВ (более 80%), сравнимую с ОВ больных I стадией РМЖ. Напротив, носители генотипа gg/AG при II стадии РМЖ имели низкую 10-летнюю ОВ (менее 60%), сравнимую с III стадией РМЖ. Промежуточную группу составили носители генотипа ag/ GG больные II и III стадией РМЖ. При этом максимальное различие было отмечено между группами носителей трех генотипов TNF при II стадии заболевания (Logrank test p=0,05; Logrank test for trend p=0,016) (см. рис. 3, в).
При анализе II стадии РМЖ оказалось, что 10-летняя ОВ носителей -308ag/-238GG гена TNF при наличии хотя бы одного аллеля AH8.1 (М+) была достоверно выше, чем в их отсутствии (90,0±6,7% и 46,2±13,8% соответственно; Logrank test p=0,0063; HR=6,6 [1,7; 26,9]). При этом кривые ОВ составили 2 группы: 10-летнюю ОВ выше 80% имели носители генотипа ag/GG при наличии маркеров AH8.1 и gg/ GG независимо от маркеров AH8.1; 10-летняя ОВ была ниже 50% у носителей ag/GG в отсутствии маркеров AH8.1 и у носителей gg/AG (т.к. частота носителей gg/AG мала, объем этой группы в данном случае не позволил провести анализ зависимости ОВ от маркеров AH8.1) (см. рис. 3, г).
Обсуждение
Влияние полиморфизмов гена TNF на предрасположенность к онкологическим заболеваниям изучается довольно широко. В метаанализе данных литературы о влиянии -238(G/A)TNF на предрасположенность к РМЖ, основанном на 8 исследованиях, не было выявлено ассоциации этого полиморфизма с РМЖ, в том числе при стратификации по этнической принадлежности [16]. Для полиморфизма -308(g/a)TNF в метаанализе 20 публикаций также не обнаружено влияния на предрасположенность к РМЖ для всей выборки, однако авторы делают заключение, что аллель -308a может быть протектив-ным фактором в постменопаузе, а генотип -308aa — фактором риска в пременопаузе [17]. В нашем исследовании мы не обнаружили ассоциации с РМЖ как генотипов -238(G/A)TNFи -308(g/a)TNF, так и гаплотипов -308/-238 гена TNF (см. табл. 1).
Гораздо менее изучено влияние полиморфизмов гена TNF на прогноз РМЖ, а опубликованные данные имеют противоречивый характер. Была выявлена ассоциация гомозиготы -308aa гена TNF с общей и с опухоль-специфической выживаемостью [18], тогда как другие авторы не обнаружили такой ассоциации для полиморфизмов -238(G/A)TNF и -308(g/ a)TNF [19]. В других работах минорный аллель полиморфизма -308(G/A)TNF ассоциировался как с общей, так и безрецидивной выживаемостью [20, 21]. Ранее нами было показано статистически значимое снижение 5-летней ОВ у носителей распространенного генотипа -308gg больных РМЖ III стадии [8] и у носителей минорного аллеля -238A при II стадии заболевания [9]. Эти ранее полученные данные можно интерпретировать как снижение ОВ для носителей генотипов -308gg/-238GG и -308gg/-238AG больных РМЖ III стадии и для носителей генотипа -308gg/-238AG с II стадией заболевания, представленное в этом исследовании (см. рис. 3, в).
При анализе зависимости кривых ОВ от генотипа TNF и стадии заболевания нами были выделены три группы больных РМЖ с высоким, низким и промежуточным уровнем ОВ (см. рис. 3, в), суммарные показатели 10-летней ОВ для которых составили: 86,7±2,9, 70,6±6,4 и 46,3±6,1% соответственно (^<0,0001). Хотя основной вклад в такое различие вносит стадийность РМЖ — прогностический признак, применяемый в клинике, однако нельзя не отметить модулирующее влияние полиморфизмов гена TNF на ОВ, максимально выраженное во II стадии заболевания. Возможно, именно при II стадии РМЖ создаются условия для проявления функциональных отличий минорных аллелей гена TNF. К таким условиям может относиться дисбаланс работы иммунной системы при онкологическом заболевании. Известно, что по мере прогрессии РМЖ снижается экспрессия молекул HLA I класса, в то же вре-
Рис. 3. Обшая выживаемость больных РМЖ в зависимости от генотипа и стадии заболевания.
а, в, г — кривые общей выживаемости по Каплану-Майеру. По оси абсцисс — время наблюдения, мес; по оси ординат — общая выживаемость, %; б — зависимость встречаемости генотипов от стадии РМЖ. По оси абсцисс — стадия РМЖ, по оси ординат — встречаемость, %. а, б, в — вся выборка больных РМЖ; г — больные II стадии РМЖ. I, II, III — стадии РМЖ; ag/GG, gg/GG, gg/AG — генотипы -308/-238гена TNF; генотип М+ содержит 1 или более маркерных аллелей гаплотипа AH.8.1.
мя в опухолевой ткани появляется экспрессия ИЬЛ II класса. Молекулы ИЬЛ I класса играют центральную роль в клеточном иммунном ответе как анти-ген-презентирующие молекулы для цитотоксических Т-лимфоцитов. Снижение экспрессии ИЬЛ I класса вплоть до их полной элиминации с поверхности опухолевых клеток является механизмом ускользания неопластических клеток из-под противоопухолевого иммунного надзора, что приводит к диссемина-ции и метастазированию и ухудшает прогноз заболевания [22]. В свою очередь, молекулы ИЬЛ II класса необходимы для презентации пептидов Т-хелперам, и их экспрессия отвечает за инициацию иммунного ответа. Присутствие таких молекул делает опухоль более иммуногенной, что дает хороший прогноз [23]. Так как гаплотип ЛН8.1 имеет отношение к аутоиммунным процессам [6], мы предположили, что он может оказывать влияние на интенсивность противоопухолевого иммунного ответа и прогноз РМЖ.
Максимальный эффект взаимодействия генотипа ag/GG гена ТИГ с маркерными аллелями ЛН8.1 был отмечен для II стадии РМЖ (см. рис. 3, г), хотя выявлялся и для всей выборки в целом. Относительно генотипа §§/00 (на который не оказывают влияние аллели ЛН8.1) наличие маркерных аллелей ЛН8.1 повышает, а их отсутствие снижает ОВ носителей минорных аллелей -308а и -238А гена ТИГв общей выборке (см. рис. 3, а). Однако для II стадии РМЖ можно наблюдать только снижение ОВ для генотипа а
GG в отсутствии маркерных аллелей AH8.1. Таким образом, если принять за точку отсчета эффект генотипа gg/GG (представленного в 67,9% нашей выборки больных РМЖ), то приближенным к нему будет эффект суррогатного гаплотипа AH8.1, включающего аллель -308а гена TNF и хотя бы один из аллелей HLA-A*1, HLA-B*8 и HLA-DRB1*3. Можно предположить, что в условиях стандартной терапии РМЖ наследственный гаплотип AH8.1 поддерживает регуляцию и иммунный баланс на оптимальном (благоприятном) уровне, при этом сочетание аллелей -308a и -238A гена TNF с другими гаплотипами HLA, по-видимому, неблагоприятно для прогноза РМЖ.
Для носителей генотипа gg/AG также была выявлена тенденция к повышению ОВ при наличии хотя бы одного маркера AH8.1, возможно, благодаря ассоциации этого генотипа с аллелем HLA-A*1. Тем не менее в целом носители генотипа gg/AG имеют плохой прогноз при II стадии РМЖ, по-видимому, из-за ассоциации с аллелем HLA-B*57 (см. рис. 2, б). Уникальный гаплотип B57 известен и исследуется в связи с инфекцией HIV-1. Предполагается, что низкая экспрессия цитокина TNF у носителей -238A может способствовать протективному действию аллеля HLA-B*5701 [24]. У здоровых неинфицированных носителей HLA-B*57 был обнаружен повышенный уровень ряда факторов, обладающих противовирусной активностью, в том числе относящихся к семейству цитидиновых деаминаз APOBEC3 [25]. APO-
BECJ-ассоциированный мутагенез зафиксирован во многих опухолях, при этом только экспрессия APOBEC3B коррелирует с пролиферацией опухолевых клеток, тогда как функции других членов этого семейства относятся к процессам в клетках иммунной системы [26]. Было показано, что при РМЖ повышенный уровень мРНК APOBEC3B коррелирует с плохим прогнозом заболевания [27, 28]. Амплификация HER2 и потеря гена-супрессора PTEN активирует APOBEC3B in vitro и коррелирует с APO-BEC3-ассоциированным мутагенезом in vivo [29]. Ранее в своих исследованиях мы обнаружили, что полиморфизм -238(G/A)TNF ассоциирован с активирующим аллелем Ile655Val HER2 и может быть фактором риска РМЖ для носителей генотипа -238AG [10]. Таким образом, можно предположить, что повышенный риск РМЖ и снижение ОВ у носителей минорного аллеля -238(G/A)TNF могут быть опосредованы ассоциацией HLA-B*57 с APOBEC3B.
Ограничением данного исследования является низкая частота носителей минорного аллеля -238A гена TNF и, соответственно, небольшие группы сравнения. Однако хотя мы не получили статистически значимых доказательств влияния полиморфизма -238(G/A)TNF на прогноз заболевания, результаты кажутся нам биологически обоснованными и требующими дальнейшего детального изучения. По-видимому, эта группа больных РМЖ, как и носители аллеля -308a в отсутствии маркерных аллелей AH8.1, нуждаются в дополнительном
лечении, и применение иммунотерапевтических подходов может оказаться эффективным для этих случаев.
Заключение
Результаты нашего исследования показывают, что полиморфизмы -308(g/a)TNF и -238( G/A)TNF не влияют на предрасположенность к заболеванию РМЖ, но оба существенно снижают ОВ больных РМЖ, особенно во II стадии заболевания. По-видимому, конечный эффект полиморфизмов гена TNF на прогноз заболевания зависит от геномного контекста. Исходя из полученных данных и анализа источников литературы, можно предположить, что механизмы действия -308(g/a)TNF и -238(G/A)TNF отличаются. Так, снижение ОВ у носителей минорного аллеля -238A может быть опосредовано его ассоциацией с HLA-B*57. Напротив, снижение ОВ у носителей -308a не связано с аутоиммунным гапло-типом AH8.1. Таким образом, выявлены две генетически детерминированные группы больных РМЖ, имеющие неблагоприятный прогноз в условиях стандартной противоопухолевой терапии РМЖ, что требует дополнительного исследования.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Waters JP, Pober JS, Bradley JR. Tumour necrosis factor and cancer. Journal of Pathology. 2013;230(3):241-248. https://doi.org/10.1002/path.4188
2. El-Tahan RR, Ghoneim AM, El-Mashad N. TNF-a gene polymorphisms and expression. SpringerPlus. 2016;5(1):1508. https://doi.org/10.1186/s40064-016-3197-y
3. Hajeer AH, Hutchinson IV. TNF-alpha gene polymorphism: clinical and biological implications. Microscopy Research and Technique. 2000;50(3):216-228.
https://doi.org/10.1002/1097-0029(20000801)50:3<216::AID-JEMT5>3.0.C0;2-Q
4. Elahi MM, Asotra K, Matata BM, Mastana SS. Tumor necrosis factor alpha -308 gene locus promoter polymorphism: an analysis of association with health and disease. Biochimica et Biophysica Acta. 2009;1792(3):163-172. https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2009.01.007
5. Aly TA, Eller E, Ide A, Gowan K, Babu SR, Erlich HA, et al. Multi-SNP analysis of MHC region: remarkable conservation of HLA-A1-B8-DR3 hap-lotype. Diabetes. 2006;55(5):1265-1269. https://doi.org/10.2337/db05-1276
6. Merino AM, Zhang K, Kaslow RA, Aissani B. Structure of tumor necrosis factor-alpha haploblocks in European populations. Immunogenetics. 2013;65(7):543-552.
https://doi.org/10.1007/s00251-013-0700-2
7. Martinez-Reza I, Diaz L, Garcia-Becerra R.J. Preclinical and clinical aspects of TNF-a and its receptors TNFR1 and TNFR2 in breast cancer. Journal of Biomedical Science. 2017;24(1):90. https://doi.org/10.1186/s12929-017-0398-9
8. Маливанова Т.Ф., Юрченко В.А., Скоромыслова Е.В., Мазуренко Н.Н. Влияние полиморфизма -308(G/A)TNF на общую выживаемость боль-
ных раком молочной железы. Вестник РОНЦим. Н.Н. Блохина РАМН. 2012;23(1):40-44. Ссылка активна на 12.08.19. http s://elibrary.ru/item.asp?id=17901571
Malivanova TF, Yurchenko VA, Skoromyslova EV, Mazurenko NN. -308(G/ A)TNF polymorphism influences overall survival of breast cancer patients. Journal of N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS. 2012;23(1):40-44. (In Russ.) Accessed 12.08.19. https://elibrary.ru/item.asp?id=17901571
9. Malivanova TF, Skoromyslova EV, Yurchenko VA, Kononenko IV, Man-zyuk LV, Mazurenko NN. Analysis of the -238(G/A)TNF polymorphism in breast cancer patients. Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 2013;28(2):52-55.
https://doi.org/10.3103/S0891416813020031
10. Malivanova TF, Ostashkin AS, Mazurenko NN. The Connection of Polymorphisms —238A/G TNF and Ile655Val HER2 Influences the Risk and Molecular Features of Breast Cancer. Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 2017;32(3):141-147. https://doi.org/10.3103/S0891416817030053
11. Tonks S, Marsh SG, Bunce M, Bodmer JG. Molecular typing for HLA class I using ARMS-PCR: further developments following the 12th International Histocompatibility Workshop. Tissue Antigens. 1999;53(2):175-183. https://doi.org/10.1034/j.1399-0039.1999.530208.x
12. Cascella R, Strafella C, Ragazzo M, Zampatti S, Borgiani P, Gambardella S, et al. Direct PCR: a new pharmacogenetic approach for the inexpensive testing of HLA-B*57:01. The Pharmacogenomics Journal. 2015;15(2):196-200. https://doi.org/10.1038/tpj.2014.48
13. Ma S, Wu J, Wu J, Wei Y, Zhang L, Ning Q, Hu D. Relationship between HLA-DRB1 allele polymorphisms and familial aggregations of hepatocel-lular carcinoma. Current Oncology. 2016;23(1):1-7. https://doi.org/10.3747/co.23.2839
14. Perrey C, Turner SJ, Pravica V, Howell WM, Hutchinson IV. ARMS-PCR methodologies to determine IL-10, TNF-alpha, TNF-beta and TGF-beta 1 gene polymorphisms. Transplant Immunology. 1999;7(2):127-128. https://doi.org/10.1016/S0966-3274(99)80030-6
15. Williams F, Meenagh A, Single R, McNally M, Kelly P, Nelson MP, et al. High resolution HLA-DRB1 identification of a Caucasian population. Human Immunology. 2004;65(1):66-77. https://doi.org/10.1016Zj.humimm.2003.10.004
16. Zhang Q, Zhao GS, Yuan XL, Li XH, Yang Z, Cui YF, et al. Tumor necrosis factor alpha-238G/A polymorphism and risk of breast cancer: An update by meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2017;96(29):e7442. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000007442
17. Jin G, Zhao Y, Sun S, Kang H. Association between the tumor necrosis factor alpha gene -308G> A polymorphism and the risk of breast cancer: a meta-analysis. Tumor Biology. 2014;35(12):12091-12098. https://doi.org/10.1007/s13277-014-2510-z
18. Mestiri S, Bouaouina N, Ahmed SB, Khedhaier A, Jrad BB, Remadi S, Chouchane L. Genetic variation in the tumor necrosis factor-alpha promoter region and in the stress protein hsp70-2: susceptibility and prognostic implications in breast carcinoma. Cancer. 2001;91(4):672-678. https://doi.org/10.1002/1097-0142(20010215)91:4<672::AID-CN-CR1050>3.0.C0;2-J
19. DeMichele A, Martin AM, Mick R, Gor P, Wray L, Klein-Cabral M, et al. In-terleukin-6 -174G-->C polymorphism is associated with improved outcome in high-risk breast cancer. Cancer Research. 2003;63(22):8051-8056. Accessed 12.08.2019.
http://cancerres.aacrjournals.org/content/63/22/8051.full-text.pdf
20. Duggan C, Baumgartner RN, Baumgartner KB, Bernstein L, George S, Ballard R, et al. Genetic variation in TNFa, PPARy, and IRS-1 genes, and their association with breast-cancer survival in the HEAL cohort. Breast Cancer Research and Treatment. 2018;168(2):567-576. https://doi.org/10.1007/s10549-017-4621-x
21. Korobeinikova E, Myrzaliyeva D, Ugenskiene R, Raulinaityte D, Gedmin-aite J, Smigelskas K, Juozaityte E. The prognostic value of IL10 and TNF alpha functional polymorphisms in premenopausal early-stage breast cancer patients. BMC Genetics. 2015;16:70. https://doi.org/10.1186/s12863-015-0234-8
22. Park HS, Cho U, Im SY, Yoo CY, Jung JH, Suh YJ, Choi HJ. Loss of Human Leukocyte Antigen Class I Expression Is Associated with Poor Prognosis in Patients with Advanced Breast Cancer. Journal of Pathology and Trans-lationalMedicine. 2019;53(2):75-85. https://doi.org/10.4132/jptm.2018.10.11
23. Axelrod ML, Cook RS, Johnson DB, Balko JM. Biological Consequences of MHC-II Expression by Tumor Cells in Cancer. Clinical Cancer Research. 2019;25(8):2392-2402.
https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-18-3200
24. Simpson PD, Moysi E, Wicks K, Sudan K, Rowland-Jones SL, McMichael AJ, et al. Functional differences exist between TNFa promoters encoding the common -237G SNP and the rarer HLA-B*5701-linked A variant. PLoS One. 2012;7(7):e40100.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040100
25. Raposo RA, Abdel-Mohsen M, Holditch SJ, Kuebler PJ, Cheng RG, Eriksson EM, et al. Increased expression of intrinsic antiviral genes in HLA-B*57-positive individuals. Journal of Leukocyte Biology. 2013;94(5): 1051-1059.
https://doi.org/10.1189/jlb.0313150
26. Ng JCF, Quist J, Grigoriadis A, Malim MH, Fraternali F. Pan-cancer tran-scriptomic analysis dissects immune and proliferative functions of APO-BEC3 cytidine deaminases. Nucleic Acids Research. 2019;47(3):1178-1194. https://doi.org/10.1093/nar/gky1316
27. Tokunaga E, Yamashita N, Tanaka K, Inoue Y, Akiyoshi S, Saeki H, et al. Expression of APOBEC3B mRNA in Primary Breast Cancer of Japanese Women. PLoS One. 2016;11(12):e0168090. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0168090
28. Sieuwerts AM, Schrijver WA, Dalm SU, de Weerd V, Moelans CB, Ter Ho-eve N, et al. Progressive APOBEC3B mRNA expression in distant breast cancer metastases. PLoS One. 2017;12(1):e0171343. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0171343
29. Kanu N, Cerone MA, Goh G, Zalmas LP, Bartkova J, Dietzen M, et al. DNA replication stress mediates APOBEC3 family mutagenesis in breast cancer. Genome Biology. 2016;17(1):185. https://doi.org/10.1186/s13059-016-1042-9
Поступила в редакцию 16.08.19 Received 16.08.19 После доработки 17.10.19 Revised 17.10.19 Принята к публикации 03.12.19 Accepted 03.12.19
Поздравление
Поздравляем члена редакционной коллегии журнала,
доктора мед. наук, профессора
Анатолия Давидовича Альтштейна с юбилеем!
Желаем здоровья и новых творческих успехов!
