Образование радикалов кислорода лейкоцитами крови у пациентов с острым коронарным синдромом, возможность коррекции их образования триметазидином МВ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Образование радикалов кислорода лейкоцитами крови у пациентов с острым коронарным синдромом, возможность коррекции их образования триметазидином МВ

М.Г. Глезер1*, С.В. Куликов2, Р.Т. Сайгитов2, Е.И. Асташкин1

!НИЦ Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова, 2Городская клиническая больница №59. Москва, Россия

Reactive oxygen species production by blood leukocytes and its correction by trimetazidine MB in patients with acute coronary syndrome

M.G. Glezer1*, S.V. Kulikov2, R.T. Saygitov2, E.I. Astashkin1

1Research Centre, I.M. Sechenov Moscow Medical Academy, 2City Clinical Hospital No. 59. Moscow, Russia

Цель. Выявить у пациентов с острым коронарным синдромом (ОКС) в периферической крови предактивиро-ванные (праймированные) фагоциты и оценить возможность изменения образования свободных радикалов кислорода (АФК) при добавлении к стандартной терапии триметазидина МВ.

Материал и методы. У 113 пациентов с ОКС: 86 с инфарктом миокарда (ИМ) и 27 с нестабильной стенокардией (НС), прослежена динамика в стационарном периоде лейкоцитов крови и АФК (базальная активность и стимулированная РМА (форбол-12-миристат-13-ацетат) в образцах цельной крови методом люцигенин-зависимой хемилюминесценции. У 60 пациентов оценена возможность триметазидина МВ в дозе 70 мг/сут. изменить образование АФК.

Результаты. Уровень лейкоцитов крови, базальный и PMA-стимулированный уровень продукции АФК на момент госпитализации был достоверно выше у пациентов с ИМ, чем c НС, особенно в группе умерших в последующем. Лечение триметазидином МВ способствовало более быстрому и выраженному снижению числа лейкоцитов по сравнению с пациентами, получавшими стандартную терапию — на 3-5, 7-10 и 15-21 сут госпитального наблюдения — на -20 vs -14%, на -37 vs -30% и на -47 vs -32%, соответственно. В группе пациентов, получавших триметазидин МВ, отсутствовала выраженная динамика образования базальной и РМА-стимулированной АФК, в группе стандартной терапии образование АФК увеличивалось в течение 3-15 сут. ИМ.

Заключение. Присоединение к обычной терапии больных с ОКС триметазидина МВ более значительно уменьшает число лейкоцитов периферической крови на 15-21 сут. наблюдения, предотвращая при этом их активацию в подострый период ишемии миокарда.

Ключевые слова: острый коронарный синдром, лейкоциты, активные формы кислорода, триметазидин.

Aim. In patients with acute coronary syndrome (ACS), to detect pre-activated (primed) phagocytes in peripheral blood and to evaluate the effects of trimetazidine MB, when added to standard therapy, on reactive oxygen species (ROS) production.

Material and methods. In 113 hospitalised ACS patients — 86 with myocardial infraction (MI) and 27 with unstable angina (UA) — the dynamics of blood leukocytes and ROS (baseline activity and PMA (phorbol-12-myristate-13-acetate) stimulated activity) was assessed by lucigen-dependent chemiluminescence method. In 60 participants, trimetazidine MB (70 mg/d) effects on ROS production were investigated.

Results. At hospital admission, blood leukocyte levels, basal and PMA-stimulated ROS production were significantly higher in AMI patients (especially in those who subsequently died) than in UA participants. Trimetazidine MB therapy facilitated more rapid and manifested leukocyte count reduction, compared to the standard therapy alone: the respective reductions at Days 3-5, 7-10, and 15-21 were -20 vs. -14%, -37 vs. -30%, and -47 vs. -32%. In the trimetazidine MB group, the basal and PMA-stimulated ROS production did not change significantly, while in the standard therapy group, the ROS production increased from Day 3 to Day 15.

Conclusion. Adding trimetazidine MB to standard therapy of ACS patients significantly reduced the peripheral blood leukocyte count at Days 15-21, without leukocyte activation in the sub-acute phase of myocardial ischemia. Key words: Acute coronary syndrome, leukocytes, reactive oxygen species, trimetazidine.

© Коллектив авторов, 2009 Тел.: (499) 972-96-12 e-mail: glezermg@mtu-net.ru

['*Глезер М.Г. — зав.лабораторией функциональных методов исследования и рациональной фармакотерапии ССЗ, 2КуликовС.В. — врач-кардиолог, 2Сайгитов Р.Т. — врач-кардиолог, 'Асташкин Е.И. — зав.лабораторией экстремальных состояний].

Нейтрофилы и моноциты крови, поступающие в очаг некроза миокарда, играют важную роль в удалении некротизированных обломков клеток, однако при неадекватном (чрезмерном) ответе могут увеличивать объем пораженного миокарда при инфаркте (ИМ). В первые 8-12 ч после некроза в очаг поступают нейтрофилы, в более поздние сроки инфильтрация идет моноцитами. Активация фагоцитов крови проявляется в виде хемотаксиса, адгезии клеток к стенке сосудов, предактивации метаболических реакций (праймировании), выхода этих клеток из кровотока в пораженную область миокарда, где они секретируют протеолические ферменты и радикалы кислорода. Радикалы кислорода образуются в фагоцитах крови главным образом вследствие активации восстановленного никотинаденинди-нуклеотидфосфата [НАД(Ф)Н] оксидазного комплекса, который состоит из двух мембранных компонентов и нескольких компонентов, локализованных в цитоплазме. Для увеличения активности НАД(Ф)Н оксидазного комплекса необходимым условием является "самосборка" всех компонентов НАД(Ф)Н оксидазного ферментативного комплекса на плазматической мембране фагоцитов, потребление больших количеств кислорода и активация других метаболических реакций. Однако выделить фагоциты из ткани миокарда у пациентов не представляется возможным.

В связи с этим целью настоящего исследования было выявить у пациентов с острым коронарным синдромом (ОКС) в периферической крови предактивированные (праймированные) фагоциты по их способности образовывать радикалы кислорода в ответ на внешние стимулы, а также оценить возможность изменения образования радикалов при добавлении к стандартной терапии ОКС триметазидина МВ (Предуктал® МВ, Лаборатории Сервье, Франция), обладающего способностью изменять метаболизм миокарда.

Материалы и методы

В исследование включены 113 пациентов, госпитализированных в отделение кардиореанимации московской ГКБ № 59 с типичными клиническими проявлениями в виде стенокардического болевого синдрома, усилившимися в течение 14 дней, предшествующих госпитализации, либо затяжного болевого приступа продолжительностью > 20 мин и характерными ишемическими изменениями на электрокардиограмме (ЭКГ) сегмента 8Т (>1 мм) либо зубца Т (инверсия, псевдонормализация и др.) или появлением нового патологического зубца Q. При диагностически значимом повышении креатинин-фосфокиназы (КФК)/КФК-МВ (>348/24 Ед/л) или при повышенных уровнях тропонина I устанавливали диагноз ИМ (п=86) и при нормальных их значениях — нестабильной стенокардии (НС) (п=27). Пациенты проходили общепринятое лабораторное и инструментальное обследования, включавшие в себя клинический анализ крови,

мочи, биохимический анализ крови с определением аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансфера-зы, КФК, общего белка, билирубина, креатинина, мочевины. Пациентам проводились регистрация ЭКГ, эхо-кардиографическое (ЭхоКГ) обследование, при необходимости мониторирование ЭКГ, артериального давления

(АД).

Продукция активных форм кислорода (АФК) анализировалась в образцах цельной крови (объем=100 мкл), взятой из локтевой вены в момент поступления больного в стационар и в последующие 3-5, 7-10 и 15-21 сут. госпитального наблюдения. Функциональную активность лейкоцитов оценивали на приборе Биотокс-7 (Россия) методом люцигенин-зависимой хемилюминесценции (ХЛ). Инициирование свободнорадикального окисления в модельной системе осуществляли с помощью 1 мкл форболового эфира — РМА (форбол-12-миристат-13-ацетат). Регистрация интенсивности ХЛ проводилась с использованием программы Origin 6.0 (Microcal Software, Inc). Учитывались базальная и PMA-стимулированная амплитуда ответа (импульс в сек., имп/с), а также суммарное количество АФК, образованного в ответ на стимуляцию (площадь под кривой амплитуды стимулированного ответа, регистрируемой в течение1500 с; х106).

За время наблюдения умерли 12 пациентов с документированным ИМ. Расчеты производили раздельно у пациентов, умерших и выживших с ИМ, и у пациентов с НС.

В рамках исследования была выполнена работа по изучению влияния триметазидина МВ на продукцию АФК лейкоцитами периферической крови. Дизайн исследования — рандомизированное, открытое, проспективное, сравнительное, в параллельных группах (гр.). После рандомизации части больным (n=24) — основная гр. (ОГ), к лечению, рекомендованному при ОКС, добавляли Предуктал® МВ в дозе 35 мг 2 раза в сут., гр. контроля (ГК) составили пациенты (n=36), у которых использовалась стандартная терапия.

Статистический анализ результатов исследования проводили с помощью пакета программ SPSS 12.0. Сравнение переменных с интервальной шкалой измерения, представленных в виде медианы (25;75 процентиль), осуществлялось по методу Манна-Уитни для независимых выборок; их изменение в ходе повторного определения — по методу Вилкоксона. Величина изменения исследуемых показателей представлена в виде отношения каждого последующего определения к исходному, зарегистрированному при поступлении. Для оценки различий дискретных величин использован критерий %2 для частотной таблицы 2x2 и точный критерий Фишера при числе наблюдений в сравниваемых гр <5. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты

В момент поступления в стационар уровень лейкоцитов в крови у пациентов с ИМ был достоверно выше, чем у лиц с НС, особенно у пациентов с последующим летальным исходом (рисунок 1).

Базальный уровень продукции АФК лейкоцитами периферической крови у пациентов с летальным исходом более чем в 4 раза превышал значения, наблюдавшиеся у пациентов с НС и благоприятным течением ИМ (рисунок 2).

PMA-стимулированный уровень продукции АФК различался только в гр. больных с летальным

4500

О 14

12,1

**

10,7

7,0

^ 25-75 процентиль

Умершие п=12

ИМ

п=74

НС

п=27

9,4

8,0

8,6

7,3

6,4

Контроль

п=26

Предукгал

п=15

4153

I Спонтанная ■ Стимулированная

3126

2394

Примечание: * р=0,004; ** р<0,001 — по сравнению с показателем в

группе больных НС. Рис. 1 Число лейкоцитов в периферической крови у больных ИМ и НС при поступлении.

исходом ИМ и НС (амплитуда ответа 4153 (2244;11412) и 2394 (976;4730) имп/с, р=0,063). У больных с благоприятным исходом ИМ РМА-стимулированная продукция АФК достигала промежуточных значений — 3126 (1426;6864) имп/с.

В свою очередь, суммарное количество продуцируемых АФК в ГС не различалось (2,4 (0,9;7,6), 1,5 (0,5;3,5), 1,1 (0,5;2,0) х106 импульсов за 1500 с).

Клиническая характеристика больных, включенных в сравнительное исследование влияния Предуктала® МВ на продукцию АФК, представлена в таблице 1.

Учитывая, что практически все исследованные показатели в ГК не различались, рандомизацию можно признать успешной. Исключение составили более высокие значения систолического АД (САД) и менее частое использование ингибиторов ангио-тензин-превращающего фермента (ИАПФ) у больных, получавших стандартную терапию.

Анализ уровня лейкоцитов, а также параметров их функциональной активности показал, что эти значения у больных, лечившихся Предукталом®

15 т-

1512

Умершие п=12

**

375 392

ИМ п=74

НС п=27

Примечание: * р=0,03; ** р=0,002 — по сравнению с показателем в группе умерших.

Рис. 2 Продукция АФК лейкоцитами периферической крови больных ИМ и НС.

МВ на момент госпитализации, не отличались от таковых у больных ГК.

В ходе госпитального наблюдения отмечалось снижение числа лейкоцитов у пациентов обеих гр. (рисунок 3). Вместе с тем, в ОГ достоверное снижение числа лейкоцитов было отмечено уже на 3-5 сут. госпитального наблюдения (-20%, р=0,033). Указанная тенденция сохранилась и в последующем. В частности на 7-10 сут. снижение составило уже 37% (р=0,002), на 15-21 сут. - 47% (р<0,001). В ГК значимое снижение числа лейкоцитов было отмечено только после 7 сут. госпитального наблюдения: на 3-5 сут. - -14% (р=0,067); 7-10 сут. - -30% (р=0,012); 15-21 сут. - -32% (р<0,001). Причем величина снижения на 15-21 сут. у больных ОГ была больше, чем в ГК (р=0,072).

Спонтанная продукция АФК у пациентов, получавших Предуктал® МВ, практически не изменялась. Лишь на 3-5 сут. заболевания наблюдалось небольшое повышение этого показателя на 36% (р=0,065) (рисунок 4). В тоже время, у пациентов ГК спонтанная продукция АФК увеличивалась зна-

3000 п-

2745

*

1485

717

1009

674

341

■ Исходно □ 7-10 сут ■ 3-5 сут □ 15-21 сут

Примечание: * р<0,05; ** р<0,01; *** р<0,001 - по сравнению

с исходным показателем. Рис. 3 Изменение количества лейкоцитов периферической крови в ходе госпитального наблюдения.

Контроль Предуктал

п=35 п=20

■ Исходно ■ 3-5 сут □ 7-10 сут □ 15-21 сут

Примечание: * р=0,006 - по сравнению с исходным показателем. Рис. 4 Изменение амплитуды спонтанной продукции АФК в ходе госпитального наблюдения.

Таблица 1

Общая характеристика исследованных больных

Показатель Предуктал (-), n=36 Предуктал (+), n=24 р

Возраст, годы 67 (55;77) 68 (64;75) 0,898

Мужчины, абс. (%) 21 (58,3) 14 (58,3) 1,000

В анамнезе, абс. (%):

Гипертония 31(86,1) 20 (83,3) 0,768

Стенокардия 33 (91,7) 20 (83,3) 0,325

ИМ 12 (33,3) 6 (25,0) 0,490

Сахарный диабет 2-го типа 4 (11,1) 5 (20,8) 0,302

Курение 9 (25,0) 6 (25,0) 1,000

При поступлении:

ЮШр >2 класса, абс. (%) 3 (8,6) 3 (13,0) 0,584

САД, мм рт.ст. 140 (130;160) 130 (120;140) 0,008

ЧСС, уд/мин 76 (66;96) 76 (60;88) 0,731

Лечение, абс. (%):

ТЛТ 1 24 (77,4) 15 (78,9) 0,899

Аспирин 34 (97,1) 24 (100) 0,404

НФГ 2 31 (91,2) 18 (75,0) 0,094

Нитраты 27 (77,1) 15 (62,5) 0,222

ИАПФ 27 (77,1) 23 (95,8) 0,05

Статин 27 (75,0) 17 (70,8) 0,721

Исходы, абс. (%):

ИМ 3 31 (86,5) 19 (79,8) 0,480

Смерть 2 (5,7) 0 (0) 0,240

Смерть, рецидив ИМ, инсульт 5 (13,9) 1 (4,2) 0,219

Примечание: 1 у больных с подтвержденным ИМ; 2 нефракционированный гепарин; 3 диагноз при выписке из стационара.

чительно на 3-5 (+53%, р=0,006) и 7-10 (+49%, р=0,085) сут заболевания.

Аналогичная ситуация наблюдалась и при анализе относительно уровня продукции АФК, стимулированной PMA (рисунок 5). В гр. больных, получавших лечение Предукталом МВ, изменений стимулированной продукции АФК не наблюдалось, тогда, как в ГК увеличивались на 38% (р=0,033) и 110% (р=0,002) от исходного уровня на 3-5 и 7-10 сут., соответственно. Величина АФК, РМА-стимулированной на 7-10 сут. наблюдения у больных ГК была выше аналогичных значений у больных ОГ (р=0,023).

Суммарное количество продуцируемых АФК в ОГ больных в ходе госпитального наблюдения также не изменялось (рисунок 6). Напротив, у больных ГК на 7-10 сут. суммарное количество продуцируемых АФК было достоверно более высоким 10000

Î **

(+106%, р=0,012), чем вначале заболевания, причем величина эта заметно отличалась от показателя в гр. пациентов, принимавших Предуктал МВ (р=0,043).

Обсуждение

Уровень лейкоцитов периферической крови является простым и, вместе с тем, универсальным маркером воспаления, в т.ч. и при острой ишемии миокарда. Неоднократно было показано, что высокие значения данного показателя, определяют неблагоприятный госпитальный прогноз у больных с ОКС [1,2]. Аналогично, и в данном исследовании был продемонстрирован высокий уровень лейкоцитов и их функциональной активности, оцененной по уровню продукции АФК у пациентов с неблагоприятным исходом ИМ. Высокие значения спонтанной продукции АФК у больных с летальным исходом ИМ, по всей видимости, указывают на факт

6771

* ^^Н 529

3944 3801

5271

3464

3275

Контроль

п=32

Предуктал

п=19

Предуктал п=19

■ Исходно ■ 3-5 сут □ 7-10 сут □ 15-21 сут

Примечание: * р=0,033 ** р=0,002 - по сравнению с исходным показателем

Рис. 5 Изменение амплитуды стимулированной продукции АФК в ходе госпитального наблюдения.

■ Исходно ■ 3-5 сут □ 7-10 сут □ 15-21 сут

Примечание: * р=0,012 — по сравнению с исходным показателем. Рис. 6 Изменение суммарного количества продуцируемых АФК в ходе госпитального наблюдения.

уже внутрисосудистои активации лейкоцитарных клеток. Инициировать подобные события, перешагнув через этапы предактивации клеток и их последующей адгезии и миграции в очаг воспаления способны лишь необычно высокие концентрации соответствующих активаторов (цитокинов, продуктов некроза кардиомиоцитов и др.).

В ходе настоящего исследования было также показано, что относительно благоприятное течение острой ишемии миокарда сопровождается снижением числа лейкоцитов периферической крови, начиная уже с 3-5 сут. заболевания. Об этом свидетельствуют и другие исследователи — пик уровня лейкоцитов у больных ИМ приходится на 2 сут. болезни, снижаясь в последующем [3]. Данное наблюдение вполне закономерно, т. к. отражает естественное течение процесса ишемии миокарда и связанной с ним воспалительной реакции. Вместе с тем, дополнительное снижение числа лейкоцитов в гр. больных, получавших Предуктал® МВ, вероятно, указывает на более выраженную интенсивность восстановительных процессов. Об этом свидетельствует и тот факт, что в ходе госпитального наблюдения функциональная активность лейкоцитов в этой гр. практически не изменялась. Напротив, в ГК в период 3-10 сут. с момента развития острой ишемии миокарда снижение числа лейкоцитов сопровождалось увеличением продукции ими АФК. Механизм подобного благоприятного влияния Предуктала® МВ на функциональное состояние лейкоцитов неоднозначен. В большинстве исследований лечебный эффект триметазидина рассматривается с точки зрения протекции им клеток-мишеней (кардиомиоцитов и др.). Реализация данного эффекта связана с изменением метаболизма клеток, формированием устойчивости мембран клеток к

Литература

1. Furman IM, Davidson CM, Anderson AF. Relationship between elevated leukocyte count and hospital clinical events in patients with acute coronary syndromes: findings from the Global Registry 7 of Acute Coronary Events (GRACE). Circulation 2001; 104(l 2): 3074.

2. Grzybowski M, Welch DR, Parsons L, et al. The association g between white blood cell count and acute myocardial infarction in-hospital mortality: findings from the National Registry of Myocardial Infarction. Acad Emerg Med 2004; 11(10): 10496°. 9.

3. Shinozaki K, Tamura A, Watanabe T, et al. Significance of

neutrophil counts after reperfusion therapy in patients with a first anterior wall acute myocardial infarction. Circ J 2005; 69:

526-9. 10.

4. Gambert S, Vergely C, Filomenko R, et al. Adverse effects of free fatty acid associated with increased oxidative stress in pos-tischemic isolated rat hearts. Mol Cell Biochem 2006; 283(1-2):

147-52. 11.

5. Yin RX, Liang WW, Liu TW, et al. Inhibitory effect of trimetazi-dine on cardiac myocyte apoptosis in rabbit model of ischemia-reperfusion. Chin Med Sci J 2004; 19(4): 242.

6. Tetik C, Ozden A, Calli N, et al. Cytoprotective effect of Данная работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований по гранту 07-04-01452

окислительному повреждению, ингибированием апоптотических процессов [4-6]. В то же время, влияние триметазидина на функцию эффекторных клеток изучено в меньшей степени. В небольшом числе работ, показано, что триметазидин способен напрямую ингибировать высвобождение грануло-цитами токсических веществ, в т.ч. АФК, регулировать функционирование митохондрий [7-10]. Вероятно и то, что ингибирующее влияние Предуктала® МВ на функциональное состояние гранулоцитов опосредовано более быстрым регрессом локальных проявлений воспаления [3]. Некоторые авторы не исключают прямого эффекта триметазидина в качестве скавенджер-агента [4], хотя в других исследованиях это наблюдение не нашло подтверждения [3]. Тем не менее, ряд исследований показывает возможность защитного действия Предуктала® МВ от ишемически/репер-фузионного повреждения [9,11].

Таким образом, показано, что уровень лейкоцитов периферической крови и, в меньшей степени, уровень продукции АФК, зарегистрированные при поступлении в стационар, связаны с неблагоприятным прогнозом развития ОКС. В процессе традиционной терапии больных с ОКС в течение всего срока госпитального наблюдения отмечается снижение числа лейкоцитарных клеток. Напротив, в период 3-10 сут. наблюдения степень их функциональной активности заметно повышается, результатом чего является более чем двукратное увеличение продукции АФК. Добавление к обычной терапии больных с ОКС Предуктала® МВ приводит к более значительному уменьшению числа лейкоцитов периферической крови на 15-21 сут. наблюдения, предотвращая при этом их активацию в подострый период ишемии миокарда.

trimetazidine on 60 minutes of intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Transpl Int 1999; 12(2): 108-12. Fabiani JN, Farah B, Vuilleminot A, et al. Chromosomal aberrations and neutrophil activation induced by reperfusion in the ischaemic human heart. Eur Heart J 1993; 14: 12-7. Argaud L, Gomez L, Gateau-Roesch O, et al. Trimetazidine inhibits mitochondrial permeability transition pore opening and prevents lethal ischemia-reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol 2005; 39(6): 893-9.

Kutala VK, Khan M, Mandal R, et al. Attenuation of myocardial ischemia-reperfusion injury by trimetazidine derivatives func-tionalized with antioxidant properties. J Pharmacol Exp Ther 2006; 317(3): 921-8.

Labrou A, Giannoglou G, Zioutas D, et al. Trimetazidine administration minimizes myocardial damage and improves left ventricular function after percutaneous coronary intervention. Am J Cardiovasc Drugs 2007; 7(2): 143-50. Романов В.А., Кратнов А.Е., Романова Н.В., Хрусталев О.А. Особенности кислород-зависимого метаболизма нейтро-филов и моноцитов у больных нестабильной стенокардией и его коррекция Предукталом. Патолог физ эксперим тер 2003; 3: 14-7.

Поступила 02/11-2009