CC BY
59
УДК 549.02’057’549.75+548.523
Е. В. Россеева, О. В. Франк-Каменецкая, О. А. Голованова, М. Л. Зорина
образование минеральных фаз в прототипах ротовых жидкостей человека
введение
Зубные камни (дентолиты) по статистике встречаются у 75 — 80 % людей [1]. Для разработки методов лечения и профилактики этого заболевания необходимо знание закономерностей их образования. Поэтому изучение процесса образования зубных камней и выявление факторов, существенно влияющих на его протекание, является одной из актуальных проблем современной биоминералогии.
Дентолиты представляют собой органо-минеральные композиты. Их минеральная составляющая представлена в основном фосфатами кальция: брушитом СаНРО4-2Н2О. карбонат-содержащим апатитом Са5(РО4)3ОН и магний-содержащим витлокитом (Ca, Mg)з(РО4)2, а также октакальциевым фосфатом Ca4H (РО4)3-2.5Н2О. В редких случаях встречаются оксалаты кальция (уэвеллит СаС2О4-Н2О и уэделлит СаС2О4-2Н2О), а также фосфаты магния (струвит NH4MgPO4 -6Н2О, ньюбериит MgHPO^H^) [1-5].
Генезис зубных камней протекает в ротовой жидкости. Это, в первую очередь. суммарный секрет всех слюнных желез (смешанная слюна) и жидкость, локализованная в мягком зубном налете (plaque fluid), а также содержимое десневых карманов и десневая жидкость. В ротовой жидкости содержится микрофлора, продукты жизнедеятельности микроорганизмов и остатки пищи, присутствие которых влияет на образование зубных камней [2, 6, 7].
Единой теории, объясняющей причины и механизмы образования зубных камней, в настоящее время не существует. При изучении этих процессов часто используют методы теоретического и экспериментального моделирования [8-13]. Это позволяет, в первую очередь, упростить биологическую систему, а также изучить влияние конкретных факторов на фазообразование. Ранее были выполнены термодинамические расчеты условий образования основных фаз зубных камней [7-9], показавшие, что из всех фосфатов кальция наибольшую степень пересыщения в растворах, моделирующих ионный состав смешанной слюны и жидкости мягкого зубного налета, имеют фтор- и гидроксилапатиты. Также достаточно полно было исследовано образование из водных растворов фосфатов кальция и магния, в широком диапазоне рН при различных концентрациях осадкообразующих ионов [10]. Кроме того, было проведено изучение возможности фазообразования непосредственно из собранных образцов слюны и жидкости зубного налета человека [11, 12]. Однако сложный состав использованных в этих работах физиологических растворов и невозможность контролировать влияние различных параметров (концентрации ионов, рН и т. д.) на кристаллизацию минеральных фаз не позволили надежно проинтерпретировать результаты экспериментов.
© Е. В. Россеева, О. В. Франк-Каменецкая, О. А. Голованова, М. Л. Зорина, 2009
Задачей настоящего исследования является устранить этот пробел, изучив закономерности образования минеральных фаз в прототипах основных ротовых жидкостей человека.
Эксперимент
Синтез патогенных фаз был осуществлен методом осаждения из растворов, близких по составу к смешанной слюне и жидкости зубного налета (табл.1) при температуре 37,0(5) °С, т. е. нормальной температуре тела человека. Время фазообразования составляло 24 часа. Было проведено три серии опытов, отличающихся начальными концентрациями исходных компонентов (табл. 2). В I серии состав растворов соответствовал максимальным концентрациям компонентов в смешанной слюне человека, во II и III сериях — максимальным и средним концентрациям компонентов в жидкости зубного налета, соответственно. В каждой серии синтез проводили при трех различных значениях рН (см. табл. 2), характерных для моделируемых биологических жидкостей (см. табл. 1).
В качестве исходных реагентов использовали соли марки ч. д. а и х. ч. и бидистил-лированную воду. Выбор реагентов и их соотношение в растворе определяли таким образом, чтобы концентрации ионов и ионная сила раствора были максимально приближены к параметрам моделируемой системы (см. табл. 2 и 1, соответственно.). Отклонение начального значения ионной силы раствора от теоретически рассчитанного во всех опытах не превышало 3 ммоль/л.
Для каждой серии экспериментов были приготовлены исходные растворы (растворы № 1 и № 2 см. в табл. 2), в которых в данных условиях малорастворимые соединения не образуются. После смешения их эквивалентных объемов (500 мл) производили корректировку значений рН (см. табл. 2) путем добавления 6 М раствора №ОН или НС1 (конц.). Полученные осадки отфильтровывали и сушили в течение суток при температуре опыта. Анализ синтезированных материалов проводили, используя рентгенофазовый анализ
Таблица 1
Неорганические компоненты, ионная сила и рН ротовых жидкостей человека [2, 6, 7]
Ион Концентрация, ммоль/л
Смешанная слюна Жидкость зубного налета (Plaque fluid)
Na+ 4,80-30,40 13,40-25,60
K+ 12,80-25,60 48,40-64,60
Ca2+ 0,75-3,00 4,30-6,90
Mg2+ 0,38-0,85 2,40-3,00
nh4+ 2,70-6,70 40,50-63,50
Cl- 11,30-28,30 20,00-31,00
CO32- 19,37-24,81 0,00-5,00
PO43- 4,81-6,47 14,00-17,00
F- 0,005-0,100 0,002-0,008
Ионная сила 20,92-76,81 83,06-127,38
pH 5,00-7,95 6,10-6,60
Состав, ионная сила и рН исходных растворов в экспериментах (ммоль/л)
№ раствора Реагент Серии опытов
Смешанная слюна Жидкость зубного налета (Plaque fluid)
I II III
1 NaCl 21,41 9,00 8,00
KHCO3 24,81 - -
K2CO3 - 5,00 2,50
(NH4)2HPO4 3,30 17,00 15,50
NaH2PO4-2H2O 3,17 - -
NH4Cl - 29,49 21,00
NH4F 0,10 0,01 0,005
KCl 0,79 25,00 24,00
2 CaQ2-2H2O 3,00 6,90 5,60
MgCl2-6H2O 0,85 3,00 2,70
Ионная сила 73 105 125
рН 6,55; 7,15; 7,95 6,05; 6,20; 6,55 6,20; 6,45; 6,55
(РФА), ИК-спектроскопию, сканирующую электронную микроскопию (СЕМ) и также локальный рентгеноспектральный анализ (ЛРСА).
Рентгеновское исследование методом порошка проводили на автоматическом дифрактометре ДРОН (CuKa-, NiKa-излучения, графитовый монохроматор, Д29 = 0,02°; экспозиция в точке 1-2 с.). Диагностику фаз проводили с использованием базы рентгеновских порошковых данных JCPDS PDF-2.
Метод инфракрасной спектроскопии применяли для выявления в составе осадков карбонат-, гидрофосфат- и гидроксил-ионов, молекул воды и идентификации рентгеноаморфных фаз. ИК-спектры были сняты в диапазоне 400-1700 см-1 на двухлучевом спектрофотометре UR-20 с разрешением 1см-1. Образцы готовили методом осаждением из спиртовой порошковой суспензии на подложке из пластинки KBr, расколотой по плоскости спайности. При интерпретации инфракрасных спектров определяли характеристические частоты колебаний связей между атомами и сравнивали их с эталонными.
Сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) использовали для изучения морфологии синтезированных агрегатов. СЭМ исследования проводили на электронном микроскопе ESEM FEI Quanta 200 FEGi (FEI company, Eindhoven, NL) в условиях низкого вакуума (60 Pa) при ускоряющем напряжении 15 kV. Для анализа элементного состава синтезированных образцов использовали локальный рентгеноспектральный анализ (ЛРСА). ЛРСА проводили на СЭМ с энергодисперсионным анализатором (LaBg-катод, U = 25 кВ, S-UTW-Si (Li) плавающий детектор). Перед проведением анализа образцы напыляли углеродом.
Результаты и их обсуждение
В результате экспериментов были получены аналоги следующих минералов зубных камней: брушита, струвита, апатита, а также рентгеноаморфный фосфат кальция.
В первой серии экспериментов, моделирующих фазообразование в смешанной слюне человека, при начальном рН 6,55(5) в растворе через 24 часа значение рН осталось прежнем, твердые фазы отсутствовали. В опыте с начальным рН 7,15(5), рН раствора в конце эксперимента увеличилась до 7,25(5). По данным РФА образовавшийся осадок содержал большое количество брушита (рис.1а). При этом на ИК-спектре этого образца (рис. 2а) кроме полос 605, 990, 1070, 1130 см-1, соответствующих валентным и деформационным колебаниям Р-0 связей, присутствовали полосы поглощения 530, 580, 880, и 1210 см-1, которые характерны для колебаний Р-0 (Н) связей гидрофосфат-ионов в структуре брушита, и полоса 1650 см-1, отвечающая деформационным колебаниям молекулы воды [14]. Наличие слабой диффузной полосы в области 1420-1460 см-1 указывало на присутствие следов ионов карбоната [15], которые могут входить в состав рентгеноаморфного материала (фосфата кальция) или плохо окристаллизованного апатита (частицы которого зафиксированы СЭМ). Осадок из раствора с рН 7,95(5) по данным РФА представлял собой плохо окристаллизованный апатит (см. рис. 1б). ИК-спектр образца (см. рис. 2б) отличался от предыдущего значительным сдвигом полос поглощения колебаний Р-0 связей фосфат ионов и отсутствием полос поглощения Р-0 (Н) связей [НР04]2- групп, характерных для структуры брушита [14]. Положение полос поглощений колебаний связей фосфатных групп на ИК-спектре характерно для структуры апатита, что согласуется с данными РФА. Наличие полосы в области 880 см-1 указывало на присутствие гидрофосфат-ионов в структуре апатита [15]. Широкую полосу в области 400-550 см-1 можно объяснить колебаниями связи металл-фтор. Присутствие карбонат-ионов (полосы поглощения 880, 1420 и 1460 см-1) в составе осадков может быть обусловлено как его сорбцией на поверхности частиц фосфатов кальция, так и замещением Р04-групп [15, 16].
Во второй серии экспериментов, моделирующих фазообразование в жидкости зубного налета, через 24 часа рН растворов увеличивалось на 0,1. По данным РФА во всех
X
X
X
о
X
«
е-
X
5
а)
2ЄИіКа
Рис. 1. Рентгенограммы осадков, полученных из прототипа смешанной слюны человека (серия I) Начальные значения рН растворов: а — 7,15(5); б — 7,95(5). Обозначения: Вт — брушит, Ар - апатит
V (см *)
Рис. 2. ИК-спектры осадков, полученных из прототипов ротовых жидкостей человека Начальные значения рН растворов: серия I — 7,95 (а), 7,15 (б); серия II — 6,55 (в), 6,20 (г), 6,05 (д).
и
£
X
X
X
о
X
«
е-
X
5
Ар
Г ги
'И]
Вги
В™ Р!''Вг.
“р в)
Ші
ІІ'ЧМуи-'-Ч'гЧ
Рм Ар Бій
,4
---------1-------
*ЧцНіі
Вт Ем Вга
Вги
і„-- Вги Вги і вги Ьп
т---------1--------1--------1--------1
25 30 35 40 45 50 55
2ШіКа
ТЭ Вги
В,и , Вги Ьга
10 15
т
б)
а)
Рис. 3. Рентгенограммы осадков, полученных из прототипа жидкости зубного налета человека (серия II) Начальные значения рН растворов: а — 6,05(5); б — 6,20(5); в — 6,55(5). Обозначения: Вги — брушит, Ар - апатит,
Str — струвит.
опытах в осадках преобладал брушит, а содержание плохо окристаллизованного апатита увеличивалось по мере увеличения рН (см. рис. 3). В осадке, полученном при рН = 6,65(5) был зафиксирован струвит (см. рис. 3в). Данные ИК-спектроскопии указывают на наличие в системах небольшого количества С032- ионов (см. рис. 2 в-д), входящего, вероятно, в структуру апатита. По данным СЭМ брушит кристаллизуется в виде удлиненных пластинчатых кристаллов размером около100 цт, на поверхности которых видны глобулярные частицы апатита (рис. 4а), образующиеся, вероятно, в результате трансформации брушита и вторичного фазообразования при увеличении рН раствора и времени кристаллизации [13, 17, 18]. Сферические глобулы апатита размером не более 1 цм часто образуют агрегаты (см. рис. 4б). Соотношения Са/Р и (Са+Na+Mg+K)/P составляют соответственно 1,50(5) и 1,60(5), что свидетельствует о дефиците кальция в структуре апатита. Значение соотношения Са/Р для кристаллов брушита с адсорбированными глобулами апатита (рис. 4а) равно 1,20(5), что выше значения, характерного для брушита (Са/Р = 1), и существенно ниже значения, характерного для стехиометрического апатита (Са/Р = 1,67). Присутствие в составе осадков ионов №+, Mg2+, СІ-, К+ (менее 2 масс.%) может быть обусловлено как их сорбцией на поверхности образовавшихся кристаллов, так и изоморфным вхождением в структуры апатита и брушита. Струвит кристаллизуется в виде удлиненных кристаллов размером до 150 цм (см. рис. 4в). Характерные для него соотношения Mg/Р и (Са+ Mg)/P составляют 0,70(5) и 0,71(5), соответственно, что можно объяснить наличием вакансий в позиции Mg [19].
В третьей серии экспериментов, также моделирующих фазообразование в жидкости зубного налета, но в менее концентрированных растворах, через 24 часа значения рН растворов уменьшились: при начальных значениях рН 6,60(5) и 6,45(5) на 0,3, а при рН. 6,20(5) на 0,2. В первых двух опытах образовался мелкокристаллический белый осадок, по данным РФА — брушит с примесью плохо окристаллизованного апатита (рис. 5). При рН = 6,20(5) в конце эксперимента образовались удлиненно-пластинчатые прозрачные кристаллы брушита размером до 2-3 мм (рис. 6). На поверхности этих кристаллов наблюдается наличие характерных ступеней роста. Соотношение Са/Р составляет 1,00(5), что близко к идеальной формуле брушита.
Заключение
При проведении модельных экспериментов были получены аналоги фосфатных минералов зубных камней (брушит, апатит, струвит и аморфный фосфат кальция), а также выявлены различия в условиях их образования. Морфология синтезированных кристаллов и агрегатов близка к характерной для соответствующих минералов патогенных агрегатов человека [1, 20].
Основной фазой полученных осадков является брушит. Содержание в них плохо окристаллизованного апатита невелико и возрастает по мере увеличения начального рН раствора. Как известно, минеральная компонента слабоминерализованного зубного налета представлена в основном брушитом [17, 18]. По результатам термодинамических расчетов в данных условиях синтеза брушит является термодинамически менее устойчивой фазой по сравнению с гидроксил- и фторапатитом [7-9]. Таким образом, результаты экспериментов показали, что на начальной стадии формирования зубных камней фазообразование. в значительной степени контролируется кинетическими факторами. Струвит в полученных осадках был зафиксирован только в опыте с максимальными концентрациями ионов и рН, характерными для жидкости зубного налета. Это согласуется с ранее проведенными термодинамическими расчетами, которые показали, что образование струвита в моделируемых
Рис. 4. Электронно-микроскопические снимки и результаты локального рентгеноспектрального анализа синтезированных кристаллов (серия II): кристаллы брушита с глобулами апатита (а), агрегаты
апатита (б), кристаллы струвита (в)
а)
б)
20№Ка
Рис. 5. Рентгенограммы осадков, полученных из прототипа жидкости зубного налета человека (серия III) Начальные значения pH растворов: а — 6,20(5); б — 6,45(5); в — 6,60(5). Обозначения: Вт — брушит, Ар - апатит.
Рис. 6. СЭМ снимки и результаты ЛРСА кристаллов брушита с характерными ступенями роста на поверхности (серия III, начальное значение рН 6,20)
системах возможно только в жидкости зубного налета при максимальных концентрациях ионов рН [9]. Все остальные растворы являются ненасыщенными относительно малорастворимых фосфатов магния. Известно, что ньюбериит MgHP04•3Н20 и струвит NH4МgPO4 •6Н2О в зубных камнях встречаются очень редко [1]. Результаты экспериментов позволяют предположить, что их образование связано с резкими локальными изменениями состава раствора.
Сравнение результатов экспериментов различных серий показало, что образование минеральных фаз в прототипе смешанной слюны идет при более высоких значениях рН,
что связано с более низкими концентрациями осадкообразующих ионов. На состав образующейся твердой фазы наиболее существенное влияние оказывает рН раствора. Наличие в растворах ионов Mg2+ также способствует образованию на начальной стадии термодинамически менее стабильных фосфатов кальция (брушита и аморфного фосфата кальция) и ингибирует их трансформацию в более термодинамчески стабильный апатит [10].
Проведенное исследование позволило уточнить особенности образования минералов зубных камней человека.
Литература
1. Кораго А. А. Введение в биоминералогию. СПб., 1992.
2. Денисов А. Б. Слюнные железы. Слюна. М., 2003. .
3. Грохольский А. П., Файзуллаев Т. Н. Зубные отложения при болезнях пародонта. Ташкент, 1982.
4. Le GerosR. Z. Variations in the crystalline components of human dental calculus: I. Crystallographic and spectroscopic methods of analysis // J. Dental Res. 1974, Vol. 53, N 1.
5. Kani T., KaniM., Mariwaki Y., Doi Y. Microbeam X-ray diffraction analysis of dental calculus // J. Dent. Res. 1983. Vol. 62. № 2.
6. Margolis H. C. An assessment of recent advances in the study of the chemistry and biochemistry of dental plaque fluid // J. Dent. Res. 1990. Vol. 69, № 6.
7. Moreno E. C., Margolis H. C. Composition of human plaque fluid // J. Dent. Res. 1988. Vol. 67.
8. M. J. Larsen, E. I.F. Pearce Saturation of human saliva with respect to calcium salts // Archives of Oral Biology. 2003. 48.
9. Россеева Е. В., Голованова О. А., Франк-Каменецкая О. В. Термодинамическое моделирование образования основных минеральных фаз зубных камней. // Минералогия техногенеза. Миасс, 2006.
10. Abbona F., Lundagermadsen H., Boistelle R. The initial phases of calcium and magnesium phosphates precipitated from solutions of high to medium concentration // J. Cryst. Growth. 1986. № 74.
11. Tannenbaum P. J., PosnerA. S., MandelI. D. Formation of Calcium Phosphates in Saliva and Dental Plaque // J. Dent. Res. 1976.55:6.
12. Blomfifld J., Van Lennep E. W., Shorey C. D., Malin A. S., Dascalu J., Brown J. M. Ultrastructure of the In Vitro Formation of Hydroxyapatite in Submandibular Saliva of Children with Cystic Fibrosis // Arch. Oral Biol. 1974. 19.
13. Schroeder HE, Bambauer H. U. Stages of calcium phosphate crystallization during calculus formation // Arch. of Oral Biology. 1966.
14. TortetL., Gavarri J. R., Nihoul G., Dianoux A. J. Study of Protonic Mobility in CaHPO4 • 2H2O (Brushite) and CaHPO4 (Monetite) by Infrared Spectroscopy and Neutron Scattering // Journal of solid state chemistry. 1997. 132.
15. Elliott J. C. Structure and Chemistry of the Apatites and Other Calcium Orthophosphates. Amsterdam, 1994.
16. Франк-Каменецкая О. В., Голубцов В. В., Пихур О. Л., Зорина М. Л., Плоткина Ю. В. Нестехиометрический апатит твердых тканей зубов человека (возрастные изменения) // Зап. Всерос. минер. о-ва. 2004. № 5.
17. Francis M. D., Webb N. C. Hydroxyapatite Formation from a Hydrated Calcium Monohydrogen Phosphate Precursor // Calcif Tissue Res 1971. 6.
18. Kaufman H. W. Kleinberg I. X-ray Diffraction Examination of Calcium Phosphate in Dental Plaque // Calcif. Tissue. Res. 1973.11.
19. Ельников В. Ю., Журавлев С. В., Кузьмина М. А., Франк-Каменецкая О. В., Голованова О. А., Плот-кина Ю. В. // Струвит в организме человека: морфология, изоморфизм и условия синтеза: мат-лы IV международного семинара «Минералогия и жизнь». Сыктывкар, 2007.
20. Pikhur O. L., Rosseeva E. V., Plotkina Yu. V., Kasbohm J., Golovanova O. A., Frank-Kamenetskaya O. V, Zorina M. L. Features of the morphology and composition of salivary calculi of patients from Saint-Petersburg region // Medical Geology Newsletter. 2008. № 12.
