CC BY
41
С.А. Кузнецов, Н. Черман, М. Манкани,
П. Герон Робей.
Образование костной ткани путём трансплантации стромальных клеток костного мозга и эмбриональных стволовых клеток человека
Национальные Институты Здоровья, Бетезда, США skuznets@mail.nih.gov
S.A. Kuznetsov, N. Cherman, М.Н. Mankani, P. Gehron Robey Bone tissue engineering by in vivo transplantation of human bone marrow stromal cells and human embryonic stem cells
Стромальные клетки костного мозга (СККМ) были открыты более 40 лет назад Александром Яковлевичем Фриденштейном; в начале 90-х их неудачно переименовали в «мезенхимальные стволовые клетки». В последние годы количество публикаций, посвящённых СККМ, растёт лавинообразно, что вызвано двумя важнейшими их особенностями. При системном введении, благодаря обилию освобождающихся цитоки-нов и сильному иммуномодулирующему эффекту, СККМ оказывают благоприятное воздействие на течение целого ряда заболеваний, от инфаркта миокарда до реакции «тансплантат против хозяина». Трансплантированные локально, СККМ, в составе которых присутствуют мультипотентные скелетные стволовые клетки (ССК), могут образовывать кость и кроветворное микроокружение (КМО), а в ряде случаев также и хрящ.
Образование костной ткани аутогенными СККМ является весьма перспективным подходом при многих травмах и иных патологиях костей, когда существующие приёмы (ауто- и аллотрансплантация кости, остеопроводящие материалы, остеоиндуцирующие факторы) оказываются недостаточными. Однако, широкому применению этого подхода препятствует тот факт, что методы культивирования и трансплантации СККМ человека (СККМч) ещё недостаточно разработаны. Наша лаборатория многие годы занимается вопросами биологии и клинического применения СККМ. В настоящем докладе представлены результаты экспериментов по трансплантации СККМч, когда клетки 2—4-го пассажей трансплантировали подкожно иммунонеком-петентным мышам bg-nu/nu-xid; трансплантаты фиксировали 8—16 нед. спустя.
Нами было показано, что СККМ разных видов животных нуждаются в различных компонентах культуральной среды для пролиферации in vitro, и в различных носителях для образования кости in vivo; очевидно, данные, полученные на СККМ мышей, кроликов или овец нельзя механически переносить на СККМч. Последние не образуют кости при трансплантации с носителями, построенными на основе синтетических полимеров, таких как polyvinyl, polyCL-lactic acid), hyaluronic acid, или poly(lactide-co-glycolide). Очень мало костной ткани образуют СККМч при трансплантации с деминерализованным костным матриксом или с коллагеновыми губками. Только носители, содержащие фосфаты кальция: гидроксиапатит (ГА), трифосфат кальция (ТФК) или их комбинации, способствуют интенсивному костеобразованию в трансплантатах СККМч. При сравнении продуктов нескольких компаний оказалось, что среди восьми различных ГА/ТФК носителей, имеющих сходный химический состав и близкую структуру, лишь два поддерживают не только обширный остеогенез, но и обильное кроветворение — последнее сви-
детельствует о сохранении ССК в составе популяции СККМч. Важную роль в стимуляции остеогенеза играют такие качества ГА/ТФК носителей как биосовместимость, способность подвергаться деградации в организме, порозность, структура поверхности, соотношение между кальцием и фосфором. Сравнение макроструктуры ГА/ТФК носителей показало, что порошковые носители, состоящие из отдельных мелких частиц, имеют существенное преимущество перед цельными блоками. Среди порошков наилучшему костеобразованию способствовали частицы диаметром от 0,1 до 0,5 мм; как уменьшение (<0,044 мм — 0,1 мм), так и увеличение (0,5—2,0 мм) размеров частиц приводило к существенному сокращению костеобразования. Мы продолжаем активный поиск и разработку ГА/ТФК носителей, способствующих формированию наиболее обширной кости и КМО при трансплантации СККМч.
В отличие от СККМч, СККМ мыши образуют прекрасную кость и КМО, когда их трансплантируют в коллагеновых губках. Мы предположили, что низкий уровень остеогенеза в трансплантатах СККМч в коллагеновых носителях может быть вызван быстрой деградацией коллагена клетками человека. Для замедления деградации был применён метод поперечной сшивки молекул коллагена глютаральдегидом и дифе-нилфосфорилазидом (ДФФА). Оказалось, что, при использовании 0,1—0,5% ДФФА, СККМч образуют атипический хрящ и хондроидную кость. Применяя 0,5—1,5% ДФФА в сочетании со вторичным носителем (фибриновым сгустком), можно получить образование кости и КМО. Этот подход открывает широкие перспективы получения, путём модификации структуры носителя, не только кости, но и других скелетных тканей в трансплантатах СККМч.
Как известно, в подавляющем большинстве работ СККМч выращиваются на средах, содержащих эмбриональную бычью сыворотку (ЭБС). Между тем, клетки, находившиеся в контакте с ЭБС, могут служить переносчиками вирусов, прионов и зоонозов, а также вызывать иммунные реакции против сывороточных антигенов коровы. Чтобы разработать систему культивирования СККМч, свободную от продуктов животного происхождения, мы заменили ЭБС на тромбоцитарный лизат человека (ТЛ, 1x10° тромбоцитов на 1 мл плазмы крови). Оказалось, что стимулирующий эффект на пролиферацию СККМч уменьшается в ряду: 5% ТЛ > 20% ЭТС ~ 2,5% ТЛ > 1% ТЛ. Более того, СККМч, выращенные на средах, содержащих 5%, 2,5% или 1 % ТЛ, образуют столько же (или даже больше) кости и КМО, как и СККМч, выращенные на среде с 20% ЭТС. Следовательно, ССК хорошо поддерживаются в культурах с ТЛ; среды, содержащие ТЛ, весьма перспективны для выращивания СККМч с целью их последующего клинического применения.
Образование кости на основе эмбриональных стволовых клеток человека (ЭСКч) или собственных индуцированных плюрипотентных стволовых (ИПС) клеток больного явилось бы серьёзным достижением, так как открыло бы доступ к неограниченным ресурсам остеогенных клеток-предшественниц. До настоящего времени, однако, не считая спорадически формируемых, мелких островков костной ткани, образования кости клетками — производными ЭСКч достичь не удавалось. Мы поставили своей задачей выработать методику образования костной ткани in vivo потомками ЭСКч при отсутствии опухолевого роста (формированиятератом). ЭСКч (линия HSF-6, 58-62 пассажей) длительно,
в течение 2—4 мес., выращивали в дифференциро-вочных условиях in vitro. При использовании 12 культуральных сред различного состава, было создано 16 дифференцированных клеточных линий фибробластной морфологии, которые были трансплантированы in vivo в сочетании с ГА/ТФК носителями. Через 8—16 нед. во многих трансплантатах была сформирована гистологически несомненная костная ткань человеческого происхождения. Она была хорошо минерализованной, имела пластинчатую структуру и состояла из многочисленных, тесно переплетённых трабекул. Эта кость по своим размерам значительно превосходила все костные структуры, построенные in vivo клетками — потомками ЭСКч, которые были описаны ранее. Культуральные среды, созданные на основе DMEM, с добавлением ЭБС, дексаметазона и аскорбата, способствовали существенно более частому образованию кости. Напротив, среды, основанные на —МЕМ, благоприятствовали развитию тератом. В клетках дифференцированных линий — потомков HSF-6 уровни транскрипции генов, связанных с плюрипотентностью (0ct4, Nanog), остеогенезом (Coll I, Runx2, ALP, BSP) и хонд-рогенезом (Coll II и X, Aggrecan), не коррелировали с образованием ни кости, ни тератом. Полученные результаты намечают новые пути к созданию костной ткани на основе ЭСКч или собственных ИПС клеток человека.
Н.В. Ламовская, М.М. Зафранская, Г.Я. Хулуп Влияние ростовых факторов на эндотелиальную дифференцировк у мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека in vitro
Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск, Беларусь natkhripach@tut.by
N.V. Lamouskaya, М.М. Zafranskaya, G.Ya. Khulup The Influence of Growth Factors on Endothelial Differentiation of Human Multipotential Mesenchymal Stromal Cells into Endothelial-like Cells in vitro
Цель исследования. Изучить влияние ростовых факторов на дифференцировку мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга (КМ) и жировой ткани (ЖТ) в эндотелиальном направлении по экспрессии эндотелиальных и мезенхимальных маркеров дифференцируемыми культурами для оптимизации протокола направленной дифферен-цировки ММСК в эндотелиоциты.
Материал и методы. Для получения ММСК моно-нуклеары костного мозга и обработанный коллагеназой липоаспират засевали в культуральные чашки в среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки коров, 2 мМ L-глутамина и антибиотики. Индукцию эндотелиальной дифференцировки ММСК проводили культивированием в питательной среде m199 с пониженным содержанием сыворотки в присутствии сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), фактора роста фибробластов (FGF), и различных комбинаций ростовых факторов: VEGF+FGF, VEGF+инсулиноподобный фактор роста (IGF), VEGF+FGF+IGF+эпидермальный фактор роста (EGF). Эффективность дифференцировки оценивали по экспрессии маркеров CD90, CD31, CD34 методом проточной цитометрии. В качестве положительного контроля использовали культуры эндотелиальных клеток пуповинной вены (ЭКПВ) человека.
Результаты определения маркеров при различных способах индукции эндотелиальной дифференцировки были подвергнуты кластерному анализу. Дальнейшее сравнение выделенных кластеров (подгрупп) проводили с использованием непараметрического 11-критерия Манна-Уитни. Клеточный прирост в культурах вычисляли по формуле: П = N/N(3, где П — клеточных прирост в течение пассажа, N, — количество полученных клеток; N(3 — количество посеянных клеток. Сравнение клеточного прироста при дифференцировке и в контроле в параллельных опытах (связанные группы) проводили с использованием непараметрического критерия Вилкоксона. Результаты представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (Ме (25-й — 75-й процентили).
Результаты. Недифференцированные ММСК КМ и ЖТ человека характеризовались сходной фиброблас-топодобной морфологией и стабильным фенотипом С090+/С0105+/С044+/С0347С0317С045- ЭКПВ и ММСК различались по экспрессии молекул С031, С034, характерных для эндотелиальных клеток, и С090, являющегося маркером ММСК и не экспрессирующегося на эндотелиоцитах в стандартных условиях культивирования.
При проведении кластерного анализа установлено, что культуры ММСК, в которых индукция эндотелиальной дифференцировки осуществлялась с использованием комбинации факторов роста, включающей как минимум \ZEGF и Р6Р, формируют отдельный кластер (подгруппу) за счет максимального изменения экспрессии изучаемых маркеров. В подгруппе, где для индукции дифференцировки использовалась комбинация факторов, включающая \ZEGF и Р6Р, экспрессия маркеров С031 и С034 была выше, а маркера С090 — ниже, чем в подгруппе культур, где дифференцировка индуцировалась с использованием только одного фактора (УЕОР или РОР), либо комбинации факторов, включающей УЕВР и ЮР, причем обнаруженные различия являются статистически значимыми (таблица).
Экспрессия маркеров С1Э90, С031 и С1Э34 в культурах клеток при использовании различных способов индукции направленной дифференцировки в эндотелиоциты
Подгруппа способов индукции дифференцировки
и
к
Маркер Комбинация факторов роста, включающая VEGF и FGF Использование в качестве индукторов дифференциров VEGF или FGF или VEGF+IGF Значение р
CD9O 66,6% (S8,S-71,6%) 94% (87-99,S%) O,O21
CD31 6S,3% (S1,7-47%) O,6%2(O,S-O,8%) O,O2O
CD34 S1,2S% (14,2-81%) O,4% (O,1-1,7S%) O,O42
При культивировании ММСК в присутствии комбинации факторов УЕОР+РОР в среде т199 с пониженным содержанием сыворотки отмечался меньший клеточный прирост по сравнению со стандартными условиями культивирования (соответственно, 1,54 (0,71—1,54) и 4 (4—7,62), р<0,05). При культивировании в присутствии комбинации ростовых факторов
