CC BY
146
УДК 579.017.575
Шеховцова Н.В., Маракаев О.А., Первушина К.А., Холмогоров С.В., Цапляева К.Г.
Ярославский государственный университет им. П.Г. Демидова Е-mail: bioksusha@mail.ru
ОБРАЗОВАНИЕ АУКСИНОВ ЭНДОФИТНЫМИ БАКТЕРИЯМИ ПОДЗЕМНЫХ ОРГАНОВ DACTYLORHIZA MACULATA (L.) SOO
(ORCHIDACEAE)
Впервые установлено, что бактерии р. Bacillus, изолированные из подземных органов Dactylorhiza maculata - представителя семейства Orchidaceae умеренного климата России, - продуцируют фитогормон индолил-3-уксусную кислоту (ИУК). Уровень ИУК, обнаруженной в культуральной жидкости 12 из 15 изолятов микроорганизмов, находится в пределах 0,3 - 29,0 мкг/ мл в зависимости от штамма.
Ключевые слова: орхидные, придаточные корни, стеблекорневой тубероид, эндофитные бактерии, индолил-3-уксусная кислота.
Эндофитные бактерии наряду с микромице-тами являются одним из важнейших компонентов системы симбиотических отношений растений семейства Orchidaceae с микроорганизмами [1]. Установлено, что ассоциативные бактерии тропических оранжерейных [2, 3] и дикорастущих [4] орхидных способны продуцировать экзометаболиты, в том числе фитогормоны ауксины, участвующие в регуляции роста и развития растений. Показано, что культуральная жидкость этих бактерий, содержавшая индолил-3-уксусную кислоту (ИУК), активизировала корнеобразование у черенков фасоли [2], а также стимулировала прорастание семян орхидных [3, 4]. Неизученным, и, несомненно, актуальным, является исследование роли эндофитных бактерий в регуляции процессов жизнедеятельности растений семейства Orchidaceae, произрастающих в условиях умеренного климата России. Особый интерес представляют эндофитные спорообразующие бактерии р. Bacillus, способные синтезировать широкий спектр биологически активных веществ, стимулирующих рост и развитие растений [5], и являющиеся наиболее активными продуцентами ауксинов среди ассоциированных с орхидными микроорганизмов, что показано на тропических видах [2, 3, 4]. Ранее нами установлено присутствие бактерий р. Bacillus в сообществе микроорганизмов, ассоциированных с подземными органами орхидных средней России [6].
Цель настоящей работы - выявить способность синтезировать индолил-3-уксусную кислоту грамположительными спорообразующими бактериями, выделенными из подземных органов пальчатокоренника пятнистого Dactylorhiza maculata (L.) Soo - представителя семейства Orchidaceae флоры России.
Объектами исследования являлись 15 штаммов спорообразующих палочковидных бактерий, предварительно отнесенных к р. Bacillus, изолированных ранее [6] из придаточных корней и корневых окон-
чаний тубероидов (запасающих органов) генеративных особей Б. тасыЫа. Различали старые подземные органы, образовавшиеся в прошлом вегетационном периоде, перезимовавшие и обеспечивающие текущую вегетацию, и молодые - формирующиеся в процессе текущей вегетации. Растения произрастали на территории Ярославской области в молодом злаково-разнотравном березняке с примесью ольхи на дерново-подзолистой суглинистой почве.
Чистые культуры бактерий выделяли на питательной среде Чапека и крахмало-аммиачном агаре при температуре 28°С в разные фазы сезонного развития Б. тасыЫа: листообразование (май), цветение (июль) и покой (сентябрь). Для изучения способности микроорганизмов синтезировать ин-долил-3-уксусную кислоту чистые культуры бактерий выращивали в жидкой среде Чапека, в которую вносили 200 мкг/мл Б,Ь-триптофана как прекурсора ИУК [2, 3]. Культивирование осуществляли в периодическом режиме в условиях принудительной аэрации (на качалке Е1рап-357, Польша) в трехкратной повторности. Биомассу бактерий оценивали по оптической плотности бактериальной суспензии при 590 нм. Наличие ИУК в бесклеточ-ной культуральной жидкости определяли колориметрическим методом с реактивом Сальковского при 540 нм [2, 3]. Статистическую обработку данных проводили по стандартным методикам с использованием программы Ехсе1’2003.
Для определения сроков максимального выхода ИУК проводили предварительные эксперименты по изучению динамики синтеза ауксина в процессе периодического роста некоторых штаммов эндофитных бактерий (табл. 1). Установлено, что оптимальное время отбора культуральной жидкости бактерий-продуцентов для определения ИУК приходится на 7-е сутки - в начале фазы отмирания периодической культуры.
Результаты изучения способности чистых культур 15 штаммов эндофитных бактерий к син-
Шеховцова Н.В. и др.
Образование ауксинов эндофитными бактериями..
тезу ИУК в процессе периодического роста на среде Чапека с триптофаном представлены в табл. 2. Показано, что способность к синтезу ауксинов у исследованных штаммов эндофитных бактерий выражена в различной степени. По концентрации ИУК в культуральной жидкости нами выделено 5 групп микроорганизмов: очень активные продуценты (более 10 мкг/мл) - штаммы m2, h, e5 и r, активные (6 - 10 мкг/мл) - k, m и i, слабо активные (2 - 3 мкг/мл) - e2, e8, e1 и u, практически неактивные (менее 1 мкг/мл) - b, непродуценты -s, s5 и е3. Таким образом, ИУК обнаружена в культуральной жидкости 12 из 15 штаммов в количестве от 0,3 до 29,0 мкг/мл, что сопоставимо с аналогичными результатами Е.А. Цавкеловой и др. [2, 3] по изучению культур бактерий р. Bacillus, ассоциированных с воздушными и субстратными корнями тропических орхидных, в которых концентрация ИУК составляла от 4 до 55 мкг/мл.
Общая продукция ИУК чистой культурой не всегда совпадает с удельной активностью микроорганизмов, выраженной как отношение концентрации
ИУК к единице биомассы по ОП590. Например, бактерии штамма e1, являющиеся по суммарной концентрации ауксина слабо активными (2,7 мкг/мл), по удельной активности (8,2) занимают второе место после самой активной культуры - м2, соответствующие показатели для которой составляют - 29,0 мкг/мл и 13,1. Вместе с тем штамм h, обладающий высокой активностью по общей продукции ИУК (20,4 мкг/мл), имеет среднюю удельную активность - 2,5. В то же время выявлены микроорганизмы, которые демонстрируют одинаковый уровень активности по двум сравниваемым показателям. К ним относятся самый активный штамм м2 и, в частности, наименее активный штамм Ь, для которого концентрация ИУК в культуральной жидкости составляет 3,0 мкг/мл, а удельная активность - 0,1.
Наибольшее разнообразие эндофитных бактерий с высокой продукционной активностью в отношении ИУК (штаммы м2, h, i, e1, e5, ш, e2), обнаружено в молодых подземных органах - придаточных корнях и окончаниях стеблекорневых тубероидов Б. шасыШа в фазы цветения и покоя.
Таблица 1. Изменение биомассы и концентрации ИУК в процессе периодического роста чистых культур эндофитных бактерий Б. шасыЫа
Штамм Время, сутки
5 7 9
Биомасса, еД. ОП590 ИУК, мкг/мл Биомасса, ед. ОП590 ИУК, мкг/мл Биомасса, ед. ОП590 ИУК, мкг/мл
b 4,8±0,05 0 3,0±0,10 0,3±0,21 2,4±0,04 0
m 8,3±0,06 5,6±0,01 2,7±0,06 7,2±0,21 2,5±0,06 6,6±0,08
e5 18,1 ±0,14 9,0±0,11 8,2±0,08 14,9±0,44 7,6±0,04 15,2±0,41
s5 2,6±0,04 0 1,6±0,05 0 0,8±0,01 0
Таблица 2. Показатели биомассы и продукции ИУК в чистых культурах эндофитных бактерий Б. шасыЫа
№ п/п Штамм Биомасса, ед. ОП590 ИУК, мкг/мл ИУК/ОП590
1 b 3,0±0,10 0,3±0,21 0,1
2 el 0,3±0,05 2,7±0,12 8,2
3 е2 0,7±0,05 2,9±0,23 4,4
4 е3 0,3±0,04 0 0
5 е5 8,2±0,08 14,9±0,44 1,8
6 е8 4,1±0,10 2,8±0,13 0,7
7 h 8,3±0,24 20,4±0,27 2,5
8 i 1,5±0,08 6,0±0,42 4,1
9 k 6,5±0,47 8,2±0,27 1,3
10 m 2,7±0,06 7,2±0,21 2,7
11 m2 2,2±0,05 29,0±0,51 13,1
12 r 2,6±0,10 11,8±0,34 4,5
13 s 0,7±0,06 0 0
14 s5 1,6±0,05 0 0
15 u 1,3±0,05 2,3±0,22 2,8
Проблемы экологии Южного Урала
Наименьшее количество продуцентов ИУК отмечено в старых подземных органах Б. шасыШа в фазу листообразования. Среди активных бакте-рий-продуцентов в этот период вегетации в придаточных корнях обнаружен штамм ш, а в окончаниях стеблекорневых тубероидов выявлены культуры Ь i и г. Количество и разнообразие продуцентов ИУК, по-видимому, обусловлено содержанием триптофана в подземных органах Б. шасыЫа, который может являться экзогенным прекурсором для бактериального синтеза ауксинов. В частно-
сти, ранее нами был установлен низкий уровень этой аминокислоты в старых тубероидах и способность к ее накоплению в молодых запасающих органах [7], что согласуется с результатами наших микробиологических исследований.
Таким образом, показано, что большинство эндофитных бактерий р. Bacillus могут превращать триптофан в дополнительную ИУК и, тем самым, оказывать влияние на гормональный статус D. maculata, регулируя рост и развитие растительного организма.
10.09.2011
Список литературы:
1. Bayman P., Otero J.T. Microbial endophytes of orchid roots // Soil Biology. - 2006. - V. 9. - P. 153-177.
2. Цавкелова Е.А., Чердынцева Т.А., Нетрусов А.И. Образование ауксинов бактериями, ассоциированными с корнями орхидей // Микробиология. - 2005. - Т. 74. - № 1. - С. 55-62.
3. Tsavkelova E.A., Cherdyntseva T.A., Klimova S.Yu. et al. Orchid-associated bacteria produce indole-3-acetic acid, promote seed germination, and increase their microbial yield in response to exogenous auxin // Archives of Microbiology. - 2007. - V. 188. -№ 6. - P. 655-664.
4. Wilkinson K.G., Dixon K.W., Sivasithamparam K. Effect of IAA оп symbiotic germination of аn Australian orchid and its production by orchid-associated bacteria // Plant Soil. - 1994. - V. 159. - Р 291-295.
5. Тихонович И.А., Кожемяков А.П., Чеботарь В.К. и др. Биопрепараты в сельском хозяйстве (Методология и практика применения микроорганизмов в растениеводстве и кормопроизводстве). М.: Россельхозакадемия, 2005. - 154 с.
6. Шеховцова Н.В., Первушина К.А., Маракаев О.А., Холмогоров С.В., Осипов Г.А. Микроорганизмы, ассоциированные с подземными органами орхидных средней полосы России // Проблемы агрохимии и экологии, 2010. - № 4. - С. 30-36
7. Маракаев О.А., Титова О.В. О возможном участии аминокислот в биосинтезе ауксинов у Dactylorhiza maculata (L.) Soo (Orchidaceae) // Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях. Тезисы VI Международной конференции. Москва, 2000. С. 49.
Работа выполнена в рамках проведения научных исследований по темплану Минобрнауки №01.01.11 и реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»,
госконтракт № П271
Сведения об авторах:
Шеховцова Нина Валентиновна, заведующий кафедрой ботаники и микробиологии факультета биологии и экологии Ярославского государственного университета им. П.Г. Демидова, кандидат биологических наук, доцент, е-mail: ninval@mail.ru Маракаев Олег Анатольевич, доцент кафедры ботаники и микробиологии факультета биологии и экологии Ярославского государственного университета им. П.Г. Демидова, кандидат биол. наук,
доцент, е-mail: olemar@yandex.ru Первушина Ксения Александровна, ассистент кафедры ботаники и микробиологии факультета биологии и экологии Ярославского государственного университета им. П.Г. Демидова, кандидат биологических наук, е-mail: bioksusha@mail.ru Холмогоров Сергей Владимирович, аспирант кафедры ботаники и микробиологии, факультет биологии и экологии Ярославского государственного университета им. П.Г. Демидова,
е-mail: serg_kholm@mail.ru Цапляева Ксения Германовна, студент, выполняющий научную работу на кафедре ботаники и микробиологии факультет биологии и экологии Ярославского государственного университета им. П.Г. Демидова, е-mail: shivery_coddle@km.ru 150000, г. Ярославль, ул. Советская, д. 14, тел. (4852) 480739
UDC 579.017.575
Shehovtsova N.V., Marakaev O.A., Pervushina K.A., Kholmogorov S.V., Tsaplyaeva K.G.
Yaroslavl state university, e-mail: bioksusha@mail.ru
AUXINE PRODUCTION BY ENDOPHYTIC BACTERIA FROM UNDERGROUND ORGANS OF DACTYLORHIZA MACULATA (L.) SOO (ORCHIDACEAE)
For the first time it was established, that the bacteria of the genus Bacillus which were isolated from the underground organs of Dactylorhiza maculata, the representative of family Orchidaceae inhabiting temperate climate region of Russia, have produced phytohormone 3-indolylacetic acid (IAA). The IAA level found out in cultural liquid of 12 from 15 bacterial strains was within the limits 0,3 - 29 mkg/ml and depended on strain.
Key words: orchids, additional roots, tuber, endophytes, endophytic bacteria, 3-indolylacetic acid.
