CC BY
51
УДК 619:616-092.19 А.В. Сахаров
ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА ОПТИМАЛЬНОГО КЛЕТОЧНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ ПРИ ЗАМЕЩЕНИИ ДЕФЕКТОВ ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ
Изучены структурно-функциональные особенности клеток хондрогенного дифферона в зонах роста формирующихся тел позвонков свиньи. Описана морфология хондробластов разной степени диф-ференцировки и определены количественные характеристики клеточного состава хрящевой ткани зон роста тел позвонков свиньи в различные возрастные периоды.
Полученные результаты позволяют рекомендовать использование выявленных морфогистохимических признаков для оценки клеточного материала при разработке тканеинженерных конструкций для замещения дефектов хрящевой ткани.
Ключевые слова: пластинка роста, клеточный состав, возрастной период, тканеинженерная конструкция.
A.V. Sakharov SUBSTANTIATION OF THE OPTIMUM CELL MATERIAL CHOICE FOR THE TISSUEENGINEERING CONSTRUCTIONS TO REPLACE THE CARTILAGINOUS TISSUE DEFECTIONS
The structural-functional features of chondrogenic differon cells in growth zones forming pig vertebra are studied. The morphology of chondroblasts of the different differentiation degrees is described. The quantitative characteristics of cartilaginous tissue cell structure in growth zones of pig vertebra in different age periods are defined. The received results allow to recommend the use of the found morphogistochemical features for estimating the cell material in the development of tissueengineering constructions for replacing the cartilaginous tissue defections.
Key words: growth plate, cell structure, age period, tissueengineering constructions.
Управление посттравматической регенерацией хрящевой ткани является одной из наиболее трудных задач реконструктивной хирургии. Надежды на успешное лечение заболеваний суставного хряща связаны с развитием клеточной и тканевой инженерий [7]. Биотехнологические подходы к решению проблемы восстановления структуры и функций поврежденного хряща включают выделение клеточного материала из органов, культивирование клеток in vitro и трансплантацию полученного клеточного материала в составе тканеинженерной конструкции в очаг повреждения. Дефицит человеческих клеток для трансплантации заставляет осуществлять поиск альтернативных источников донорского материала, в том числе полученного от животных. Сходство некоторых тканей человека и свиньи по антигенным, морфологическим и физиологическим характеристикам открывает новые перспективы возможного использования клеток свиньи в клеточных технологиях. Проблема выбора оптимального клеточного материала для восстановления поврежденного хряща пока остается нерешенной, что определяет актуальность настоящего исследования.
Целью исследования являлось определение оптимального возрастного периода забора донорской хрящевой ткани у плодов свиньи для ее использования при разработке тканеинженерных конструкций.
Материал и методы исследования
Исследования проводили на помесных свиньях пород крупная белая и ландрас. Зоны роста тел позвонков выделяли из грудного отдела позвоночника эмбрионов и плодов свиньи 21 —100-суточного возраста (всего 427 животных). Образцы фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и декальцинировали в забуференном растворе ЭДТА, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, просветляли в кси-
лоле и заливали в целлоидин-парафин. Срезы толщиной 3-5 мкм изготавливали на санном микротоме, монтировали на предметные стекла. Обзорные препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Гликоген и гликопротеины определяли реактивом Шиффа по Мак-Манусу и ставили ферментативный контроль с амилазой. Кислые гликозаминогликаны (ГАГ) выявляли альциановым синим по Стидмену. Локализацию и интенсивность рефракции кератансульфата (КС), хондроитинсульфата (ХС) и гиалуроновой кислоты в клетках и межклеточном веществе хрящевой ткани изучали в реакции с толуидиновым синим при рН 1,5; 2,5 и 5,0 соответственно. Пространственную организацию коллагеновых фибрилл определяли в реакции с пикросириу-сом красным и оценивали в поляризованном свете. Морфометрические характеристики определяли с помощью комплекса программ АхюМвюп. Статистическую обработку данных проводили с использованием 1-критерия Стьюдента и различия считали достоверными при Р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Позвоночный столб эмбриона свиньи в возрасте 21 суток представлен хордой и расположенными вокруг нее клетками уплощенной или полигональной формы. Ядро округлой формы интенсивно окрашивается гематоксилином. В цитоплазме клеток выявляется пылевидный ШИК-позитивный материал, исчезающий после предварительной ферментативной обработки срезов амилазой. Кислые ГАГ в цитоплазме определяются в следовых количествах. Межклеточное вещество выражено слабо, бледно окрашивается на коллаген по Маллори и характеризуется умеренной ШИК-позитивной реакцией.
Реакция с толуидиновым синим на гиалуроновую кислоту позволяет определить слабо выраженное окрашивание в цитоплазме и межклеточном веществе. Реакция с толуидиновым синим на КС и ХС отрицательна. Рефракция макромолекул сульфатированных и несульфатированных ГАГ в поляризованном свете отсутствует.
Хрящевая модель тела позвонка плода свиньи в возрасте 45 суток представлена мелкими клетками округлой формы, которые располагаются в одиночных лакунах округлой или овальной формы. Хондробласты имеют небольшое интенсивно базофильное ядро округлой формы, расположенное в центре клетки, и высокое ядерно-цитоплазматическое отношение. Слабо развитый матрикс, невысокое содержание коллагена и сульфа-тированных ГАГ, которые по данным поляризационно-оптического анализа присутствуют в низкополимерной форме, характеризуют их как низкодифференцированные клетки. Результаты морфометрического анализа показали, что их процентное содержание в хрящевой ткани зоны роста составляет 71,65 ± 2,24%.
По направлению от периферии хрящевого тела позвонка к центру оссификации возрастает степень дифференцировки клеток, что проявляется усилением синтеза компонентов хрящевого матрикса и снижением содержания клеток на единицу площади. С увеличением степени дифференцировки хондробластов происходит изменение их морфологии. Хондробласты располагаются в овальных лакунах и принимают уплощенную форму, снижается их ядерно-цитоплазматическое отношение. Ядро становится овальной или бобовидной формы.
Ближе к центру оссификации степень дифференцировки хондробластов возрастает. Уплощение ядра и цитоплазмы становится еще более заметным. На границе с центром оссификации располагаются гипертрофические клетки, содержание которых составляет 28,35 ± 1,04%. Это наиболее дифференцированные хондробласты, которые представляют собой самые крупные клетки с низким ядерно-цитоплазматическим отношением. Их цитоплазма и территориальный матрикс обильно заполнены сульфатированными ГАГ.
На срезах, выполненных под углом к сагиттальной плоскости, заметно, что ядро имеет форму диска. Уплощенное с двух полюсов округлое ядро при изменении плоскости его расположения в клетке дает картину круга или овала, либо вытянутого профиля.
Исследование образцов зон роста в поляризованном свете позволило выявить следовую рефракцию макромолекул гиалуроновой кислоты, ХС, КС и коллагена только вокруг клеточных лакун.
У плодов в возрасте 76 суток в гиалиновом хряще пластинок роста тел позвонков идентифицируются следующие зоны: резервная, пролиферации, созревающего хряща, гипертрофического хряща и остеогенеза. Развитая резервная зона и зона пролиферации свидетельствуют о высоком пролиферативном потенциале фетальной хрящевой ткани в данный возрастной период. По сравнению с предыдущим возрастным периодом отмечается изменение морфологических признаков хондробластов. Клетки по направлению от резервной зоны к зоне энхондрального остеогенеза принимают более уплощенную форму. С изменением формы клетки происходит уплощение ядра и снижается ядерно-цитоплазматическое отношение. В межклеточном веществе увеличивается интенсивность реакции на сульфатированные и несульфатированные ГАГ, гликопротеиды и коллаген, возрастает пространственно-упорядоченная организация макромолекул КС, ХС, гиа-
луроновой кислоты и коллагена.
У плодов 100-суточного возраста изменяется строение пластинки роста. Сглаживается граница между резервной зоной и зоной пролиферации, уменьшается их ширина. Развитые зоны созревания и гипертрофии, в межклеточном веществе которых выявляются КС, ХС, гиалуроновая кислота и коллаген в высокополимерной форме, указывают на преобладание в пластинке роста высокодифференцированных клеток.
При обсуждении полученных результатов следует отметить, что стадийность синтеза компонентов хрящевого матрикса и биохимические критерии дифференцировки клеток хондрогенного дифферона достаточно полно освещены в литературных источниках [1]. Отсутствие четких морфологических признаков клеток хондрогенного дифферона в динамике их последовательной дифференцировки определило необходимость их подробного описания. Проведенное исследование показало, что кроме снижения ядерноцитоплазматического отношения, изменение формы ядра клетки от овальной к бобовидной, а затем к уплощенной форме является морфологическим признаком нарастания степени их дифференцировки, и данный признак ранее не был отмечен. Вероятно, это связано с общепринятым методическим подходом при изучении гистологических препаратов пластинки роста тел позвонков. Изменения морфологии хондробластов в зависимости от стадии дифференцировки отчетливо заметны на срезах, которые проходят не в сагиттальной, а в горизонтальной плоскости.
В качестве аргументов, объясняющих изменение морфологических признаков ядра в хондробластах, происходящих в процессе дифференцировки, можно привести данные Н.В. Дедух (1988) и М. Керн (1985). По их мнению, строгая взаимосвязь между клетками и неклеточными компонентами хрящевой ткани проявляется в том, что клетка не только воспроизводит макромолекулы матрикса - коллаген, гликопротеины, проте-огликаны, но что немаловажно, эти макромолекулы оказывают влияние на ее цитодифференцировку. В связи с тем, что в ранний плодный период позвоночник не испытывает значительной нагрузки, коллагеновые фибриллы и макромолекулы протеогликанов не имеют такой высокоупорядоченной пространственной организации, как в матриксе зрелой ПР, где макромолекулярные агрегаты в межклеточном веществе строго упорядочены. Это определяется главным образом вектором нагрузки на тело позвонка. В глубоких слоях зоны пролиферации, созревания и гипертрофии расположение коллагеновых фибрилл параллельно продольной оси тела позвонка приводит к формированию колонковых структур. Ограниченные с двух сторон коллагеновыми фибриллами и протеогликанами матрикса клетки вынуждены располагаться друг над другом в виде монетного столбика. В условиях действия компрессии, клетки в колонковых структурах хряща уплощаются, что находит отражение в изменении морфологии лакун, клеток и их ядер.
Подробное изучение морфологии клеток формирующихся тел позвонков имеет прямое отношение к определению критериев выбора оптимального клеточного материала для ксенотрансплантации. Несмотря на успешное использование клеток кожи свиньи и b-клеток поджелудочной железы в медицинской практике [4], попытки трансплантации жизненно важных органов людям заканчиваются отторжением ксенотрансплан-тата. Единственное различие в антигенах, экспрессируемых на поверхности клеток сосудистого эндотелия человека и свиньи, имеет ключевое значение в запуске сверхострого отторжения и является одним из главных препятствий на пути к успешной ксенотрансплантации [8]. Для преодоления физиологических и иммунологических барьеров необходимо проведение общей иммуносупрессии рецепиента, иммуномодуляции трансплантата и индукции специфической толерантности, использование для тканеинженерных конструкций иммуномеханических барьеров [6]. В совокупности с невысокой скоростью роста in vitro первичной культуры клеток, выделенных из зрелых тканей, использование клеточного материала от взрослых животных не нашло широкого применения в практической медицине.
Транплантация эмбриональных клеток имеет существенные преимущества перед пересадкой клеток, выделенных из тканей взрослых животных. Это связано с тем, что в конце эмбрионального периода клетки тканей слабо экспрессируют антигены главного комплекса гистосовместимости и активно пролиферируют [5], что позволяет в значительной степени избежать конфликта между клетками донора и организмом реципиента. Использование эмбрионального материала обеспечивает также возможность быстрого получения необходимого количества клеток.
Сложность управления направленной дифференцировкой эмбриональных клеток in vitro и возможность их некорректной дифференцировки являются основанием для отказа от использования в тканеинженерных конструкциях мезенхимных клеток, выделенных из тел позвонков эмбрионов свиньи 21-суточного возраста. С нашей точки зрения, оптимальным клеточным материалом для разработки тканеинженерных конструкций является фетальная хрящевая ткань тел позвонков плодов свиньи в возрасте 45 суток. Это обусловлено тем, что, во-первых, в начале плодного периода в тканях содержится лишь около 5% терминально дифференцированных соматических клеток, способных вызвать иммунный
конфликт [3]. Во-вторых, хрящевая ткань тел позвонков на 70% представлена низкодифференцированными хондробластами с высоким пролиферативным потенциалом. Можно полагать, что трансплантация клеток в составе тканеинженерной конструкции в дефект суставного хряща не будет провоцировать развитие иммунного воспаления, а пролиферация и синтез хондробластами основных биополимеров хряща позволит заполнить дефект.
Использование в клеточных технологиях хрящевой ткани пластинки роста плодов 76-100-суточного возраста менее оправдано. Это объясняется тем, что в данные периоды фетальная хрящевая ткань обладает более низким пролиферативным потенциалом, а дифференцированные клетки экспрессируют белки, провоцирующие иммунный конфликт между клетками тканей реципиента и донора.
Выводы
1. Ядерно-цитоплазматическое отношение и форма ядра клетки являются морфологическими признаками дифференцировки клеток хондрогенного дифферона.
2. Хрящевая ткань зоны роста тела позвонка плода свиньи 45-суточного возраста является оптимальным источником клеточного материала для тканеинженерных конструкций.
Литература
1. Дедух, Н.В. Гормональная регуляция процессов развития / Н.В. Дедух, Е.Я. Панков // Успехи совр. биологии. - 1988. - № 6. - С. 454-469.
2. Принципы поляризационно-оптического анализа в изучении соединительной ткани / М. Керн [и др.] // Архив анатомии. - 1985. - Т. 88. - Вып. 6. - С. 5 -12.
3. Сухих, Г.Т. Трансплантация эмбриональных гепатоцитов: экспериментальное обоснование нового подхода к лечению недостаточности печени / Г.Т. Сухих, А.А. Штиль // Бюл. экспер. биологии и медицины. - 2002. - Т. 134. - № 12. - С. 604-609.
4. Шумаков, В.И. Трансплантология / В.И. Шумаков. - М.: Медицина, 1995. - 575 с.
5. Ксенотрансплантация эмбриональных предшественников миогенеза человека для коррекции дистро-финопатии у мышей с наследственной миодистрофией / В.Н. Ярыгин [и др.] // Бюл. экспер. биол. и медицины. - 2003. - Т. 136. - № 7. - С. 100-105.
6. Cai, D.Z. Biodegradable chitosan scaffolds containing microspheres as carriers for controlled transforming growth factor-beta1 delivery for cartilage tissue engineering / D.Z. Cai, C. Zeng, D.P. Quan // Chin Med J (Engl). - 2007. - Vol. 120. - № 3. - P. 197-203.
7. Cozzi, E. An update on xenotransplantation / E. Cozzi, M. Seveso, S. Hutabba //.Vet Res Commun. - 2007. - Vol. 11. - P. 15-25.
8. Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics in articular cartilage repair / F. Guilak, DL Butler, SA Goldstein // Clin Orthop. - 2001. - Vol. 391. - P. 295-305.
УДК 619:616-092.19+636.4:611.018.4
А.В. Сахаров, А.А. Макеев, Е.И. Рябчикова
