CC BY
51
УДК 543:Б15.2/.3:Б15.22
ОБОСНОВАНИЕ СПОСОБОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МОНОМЕКАИНА -ПОТЕНЦИАЛЬНОГО АНТИАРИТМИЧЕСКОГО СРЕДСТВА
Е.А. Брылина, Л.А. Чекрышкина, Н.В. Слепова, И.П. Рудакова,
ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия»
Чекрышкина Людмила Александровна - e-mail: [email protected]
В статье приведены результаты разработки способов оценки качества мономекаина (2-метиланилид MN-диэтиламиноэтановой кислоты нитрата) - БАВ из группы ариламидов, который рассматривается в качестве потенциального антиаритмического средства. В сравнении с аналогом по структуре и фармакологическому действию лидокаином мономекаин обладает большей эффективностью и меньшей токсичностью. Использованы традиционные и современные методы, комплекс которых позволяет достоверно оценить качество исследуемого соединения.
Ключевые слова: мономекаин, антиаритмическое действие, оценка качества.
In the article the results of development of methods of estimation of quality of monomekaine (2-methyl-anilide N,N- of diethylaminoethanic acid nitrate) are given - BAS from the group of arrhylamides, this is examined as a potential antiarrhythmic remedy. In comparison with the analogue on the structure and pharmacological action the lidocaine, monomekaine possesses greater efficiency and less toxicity. Traditional and modern methods were used the complex of which allows to estimate for certain the quality of the investigated compound.
Key words: monomekaine, antiarrhythmic action, estimation of quality.
Введение
Известно, что сердечно-сосудистые заболевания занимают одно из первых мест в структуре заболеваний, а смертность от них составляет более 50% от общей смертности [1]. Значительный удельный вес в ряду этих заболеваний занимают аритмии, в связи с чем профилактика и лечение аритмий являются одной из наиболее актуальных проблем современной кардиологии [2].
Практическая медицина располагает значительным арсеналом лекарственных средств, оказывающих нормализующее влияние на нарушенный ритм сердечных сокращений. Они относятся к разным классам химических соединений и принадлежат к различным фармакологическим группам [3]. Однако абсолютно безопасных антиаритмиче-ских препаратов не существует; каждый из них имеет четкие показания и противопоказания, проявляет спектр побочных действий, что в ряде случаев ограничивает их выбор. В соответствии с этим проводятся исследования, направленные на поиск и создание эффективных и безопасных антиаритмических средств.
Исследуются биологически активные вещества (БАВ) различной химической структуры: производные
Ы-фенилацетамида и амидов ароматических карбоновых кислот [4], пиперидил-4-этана [5], 3-ацетил-2-г-9-диалкиламиноэтилимидазо[1,2-а]-бензимидазолов [6], 1,1-диалкил (алкил)аминоэтил-2,3-дигидроимидазо-[1,2-а]бензимидазолов [7], соли 1\1,1\Г-малонил-бис-п-аминобензойной кислоты [8], Ы'-(2,6-диметилфенил)-1\12,1\12-диэтилглицинамида и 4-амино-Ы-[2-(диэтиламино) этил]бензамида [4] и др.
Значительный вклад в это направление исследований внесли разработки, выполненные в ПГФА [9, 11]. Так, 2-метиланилид Ы,Ы-диэтиламиноэтановой кислоты нитрат, получивший условное название мономекаин, проявляет больший антиаритмический эффект по сравнению со своим структурным аналогом, уже известным антиарит-мическим препаратом лидокаином. Лабораторные исследования показали, что антиаритмический эффект мономекаина превосходит эффект лидокаина в 1,5 раза, при этом токсичность мономекаина меньше в 5,5 раза [10].
Получен ряд производных ариламидов Ы-алкилпирро-лидин-2-карбоновой кислоты [11], которые по результатам фармакологических исследований проявили большую широту терапевтического действия (антиаритмический
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
индекс) в сравнении с лидокаином. Например, 2-этоксиа-нилид 1\1-н-пропилпирролидин-2-карбоновой кислоты гидрохлорид в 1,44; 1,59; 4 и 6,4 раза менее токсичен в сравнении с лидокаином, тримекаином, ропивакаином и бупивакаином, соответственно; он имеет эффективную дозу, предупреждающую хлоридкальциевую аритмию на уровне ропивакаина и бупивакаина, превосходя по этому показателю в 2,2 и 2,3 раза лидокаин и тримекаин, соответственно. Кроме того, указанное БАВ проявляет большую широту терапевтического действия (антиаритмиче-ский индекс) в 3,2; 3,7; 4,2 и 6,4 раза в сравнении с лидокаином, тримекаином, ропивакаином и бупивакаином, соответственно.
Цель работы: проведение комплекса исследований, направленных на формирование показателей качества мономекаина, что необходимо при подготовке стандарта качества в связи с выпуском опытных серий и разработкой лекарственных форм для углубленных фармакологических исследований.
Материалы и методы
Эксперименты проведены в соответствии с положениями ОФС 42-0074-07 [12], определяющей требования к формированию стандарта качества на фармацевтические субстанции.
Исследования выполнены на 5 опытно-лабораторных сериях 2-метиланилида \,\-диэтиламиноэтановой кислоты нитрата (мономекаина), синтезированных по известной методике [9], модифицированной авторами.
Растворимость полученной субстанции, прозрачность и цветность водных растворов, сульфатную золу и тяжелые металлы, значение pH водного раствора устанавливали в соответствии с требованиями ГФ XII. Методики испытания на подлинность на основе химических реакций разрабатывали с учетом свойств функциональных групп, входящих в химическую структуру мономекаина.
Оборудование: прибор для определения температуры плавления МЕТТЛЕР ТОЛЕДО FP-62; значение pH водных растворов получали на приборе РВ-11 Sartorius; использовали УФ-спектрометр Perkin Elmer Lambda 45; ИК-Фурье спектрометр ALPHA-T с приставкой НПВО; жидкостной хроматограф Agilent Technologies Series 1200, оборудованный диодной матрицей UV-VIS (DAD) и масс-селективным детектором (MSD) Quadrupole Agilent 6120; газовый хроматограф CG-2010 (Shimadzu), оборудованный пламенноионизационным детектором.
УФ спектры вещества сняты в области 190-380 нм в растворителях вода, спирт 96%, хлороформ и азотная кислота 0,01 М, концентрация БАВ 0,001%; ИК спектр получен для кристаллического образца в области 4000-400 см-1.
Исследование методом ВЭЖХ проводили в следующих условиях: предколонка с сорбентом SB-8, колонка Zorbax Eclipse XDB-C18, с обращенной фазой C18 (150 х 2,1 мм), элюент - ацетонитрил - 0,1% водный раствор муравьиной кислоты, градиентный режим, 0-3 мин (5% - содержание в элюенте ацетонитрила), 3-8 мин (5-50% ацетонитрила), 8-10 мин (50% ацетонитрила), 10-15 мин (5-50% ацетонитрила), скорость подачи элюента 0,3 л/ мин.; температура термостата 40°С; объем вводимой пробы 0,1 мкл; время анализа 15 мин; кондиционирование колонки 1 мин; детектирование спектров в диапазоне
длин волн от 190 до 400 нм, с выделением аналитической длины волны 240 нм.
Установление предельного содержания остаточных органических растворителей проводили методом газовой хроматографии. Условия хроматографирования: капиллярная колонка длиной 30 м, диаметром 0,25 мм; толщина пленки неподвижной фазы на колонке 0,25 рм; газ-носитель - азот, соотношение 1:30; скорость газового потока, подаваемого через колонку, 1,0 мл/мин; температура инжектора 250°С, детектора - 300°С; температура колонки (изотерма) 40°С (выдержано 5 мин), программирование температуры со скоростью 10°С/мин до 280°С; время анализа 6 мин.
Методика: точную навеску вещества (около 0,1 г) растворяли в 2 мл воды в виале вместимостью 4 мл, выдерживали 40 мин при 80°С. Затем пробу, взятую из газовоздушной фазы, объемом 0,1 мл с помощью шприца Луер вводили в хроматографическую колонку и хроматографировали в указанных выше условиях. По полученным хроматограммам проведены количественные расчеты по методу абсолютной градуировки с использованием водных растворов бензола и ацетона.
Количественное содержание мономекаина устанавливали титриметрическим методом в смеси протогенных растворителей - безводной уксусной кислоты и уксусного ангидрида (10:10) с использованием автоматического титратора TitroLine easy, снабженного магнитной мешалкой и комбинированным электродом. Навеска для анализа 0,1000 (точная масса), титрант 0,1 М раствор хлорной кислоты.
Выбор методов и условий проведения эксперимента определяли исходя из физических, физико-химических и химических свойств исследуемого БАВ. Значительная часть из них - спектральные и хроматографические методы - соответствуют уровню требований современных фар-макопей: Европейской, Международной, США, что отвечает принципу гармонизации отечественных стандартов на лекарственные средства с вышеуказанными стандартами.
Обсуждение
Мономекаин представляет собой белый кристаллический порошок без запаха, легко растворим в воде, растворим в спирте 96%, мало растворим в хлороформе; температура плавления 137-138°С.
При разработке химических реакций подлинности исходили из свойств функциональных групп и фрагментов структуры исследуемого БАВ: третичной аминогруппы, амидной группы, замещенного ароматического радикала, аниона кислоты, солью которой является анализируемое БАВ. Исходя из этого, предложен комплекс осадительных и цветных реакций, отражающих химические свойства мономекаина (таблица 1).
Полученные УФ-спектры БАВ (концентрация 0,001%) в хлороформе и спирте имеют по одному максимуму: при длине волны 250+1 нм (хлороформ), 244+1 нм (спирт), характерному для сопряженной ^-электронной системы ароматического цикла. В УФ-спектре образца в воде очищенной пик находится в области менее 190 нм, что затрудняет использование этого растворителя в практике фармацевтического анализа, а в 0,01 М растворе азотной кислоты в интервале 190-230 нм имеется серия нечетко разделен-
ных пиков. По результатам проведенных исследований можно сделать вывод, что при введении спектральных характеристик УФ области в ФС для оценки качества моно-мекаина следует рекомендовать его спиртовый раствор, т. к. в этом растворителе имеется четкий максимум и он менее токсичен и летуч, чем хлороформ.
ТАБЛИЦА 1.
Реакции подлинности мономекаина
Полосы поглощения в ИК-спектре подтверждают строение вещества: 3209 см-1 - валентные колебания СН бензольного кольца и NH (амид II); 3032 см-1 - валентные колебания СН бензольного кольца; 2954 см-1 - колебания СН метильной группы, N(C2H5)2; 1688 см-1 - колебания связи С=О (амид I); 1530-1293 см-1 - полосы поглощения связей С=С, СН, «амид II»; полоса при 751 см-1 характеризует орто-дизамещение в ароматическом цикле, полосы при 1372 см-1 и 824 см-1 соответствуют поглощению группы NO3—. ИК спектр как индивидуальная характеристика соединения может быть рекомендован для включения в ФС.
Методику ВЭЖХ разрабатывали для обнаружения и установления предельного содержания полупродукта синтеза 2-метиланилина, который может содержаться в анализируемом БАВ в качестве специфической примеси. На хроматограмме мономекаина идентифицировали пик со временем удерживания - 9,087 мин для сигнала DAD А, 9,205 мин для сигнала MSD 1, 9,212 мин для сигнала MSD 2, по УФ спектру с нечетко выраженным максимумом при 225 нм, масс-спектру с группой ионов 221, 222, 223 а.е.м.
В тех же условиях хроматографировали смесь мономекаина и 2-метиланилина. На хроматограмме идентифицировали пик со временем удерживания 3,251 мин для сигнала DAD A, характерный для 2-метиланилина, и пик со временем удерживания 9,113 мин для сигнала DAD A, характерный для исследуемого БАВ; пик 3,410 мин для сигнала MSD 1, характерный для 2-метиланилина, и пик 9,235 мин - для сигнала MSD 1, характерный для мономекаина. Различие во временах удерживания основного вещества и 2-метиланилина позволяет использовать методику как для идентификации мономекаина, так и для обнаружения сопутствующей примеси. Как показали результаты хрома-
тографических исследований пяти опытных серий мономекаина, в двух из них был обнаружен 2-метиланилин в количестве, не превышающем 0,2%.
В процессе синтеза мономекаина нитрата используют органические растворители (бензол и ацетон). В среде ацетона осуществляют первую стадию синтеза мономекаина - реакцию конденсации о-толуидина с хлорацетилхло-ридом, которая сопровождается образованием 2-метил-хлорацетанилида. Затем его растворяют в бензоле и для получения мономекаина - основания вводят в реакцию с диэтиламином, после чего получают азотнокислую соль, для перекристаллизации которой используют ацетон.
Согласно ОФС 42-0057-07 «Остаточные органические растворители», фармацевтическую субстанцию необходимо контролировать на содержание органических растворителей, используемых в процессе синтеза. Исходя из степени их возможного риска для здоровья человека, они разделены на 3 класса, для каждого представителя которого нормировано его предельно допустимое содержание в лекарственных средствах. В соответствии с классификацией, приведенной в указанной ОФС, бензол относится к 1-му классу токсичности (высокотоксичные растворители), ацетон - к 3-му классу (нетоксичные растворители). Требования ГФ XII по их содержанию: бензола не более 2 ppm, ацетона не более 0,5%. В результате проведенных на 5 сериях БАВ исследований установлено, что содержание бензола и ацетона в исследуемых образцах не превышает предельно допустимые нормы, регламентированные ОФС 42-0057-07 (таблица 2).
ТАБЛИЦА 2.
Содержание бензола и ацетона в экспериментальных сериях образцов мономекаина нитрата (п=3)
№ п/п Исследуемые серии мономекаина Содержание бензола и ацетона
Бензол, ppm Ацетон, %
1 141209 - 0,0299
2 290110 0,3 0,0910
3 190210 - 0,0550
4 161211 0,04 0,0958
5 130612 0,52 0,0928
Количественное определение мономекаина как соединения, обладающего слабыми основными свойствами, проведено в среде протогенных растворителей на 5 опытно-лабораторных сериях. В таблице 3 приведены результаты количественного анализа мономекаина серии 010212 и их статистической обработки.
ТАБЛИЦА 3.
Результаты количественного определения мономекаина
(серия 010212, n = 7; f = 6; t0 95 =2,45)
x S Sx Дх Е х±Дх
99,72 0,206 0,078 0,19 0,19 99,72+0,19
Как следует из представленных результатов, методика характеризуется хорошей воспроизводимостью и может быть рекомендована для включения в проект ФС на исследуемое БАВ.
Выводы
1. Мономекаин - 2-метиланилид 1\,1\-диэтиламино-этановой кислоты нитрат по результатам проведенных предварительных фармакологических испытаний может
Реактив Эффект Чувствительность, мг
Драгендорфа Кристаллический осадок краснооранжевого цвета (в поле зрения микроскопа - кристаллы кубической формы 0,4
Бушарда-Вагнера Кристаллический осадок краснобурого цвета (в поле зрения микроскопа - кристаллы пирамидальной формы) 1,5
Пикриновая кислота Кристаллический осадок желтого цвета (в поле зрения микроскопа -кристаллы в виде тонких веточек) 2,5
Дифениламин Синее окрашивание 0,05
Хлористоводородная кислота (>1:°), натрия нитрит, |}-нафтол Азокраситель интенсивно оранжевого цвета 0,5
Хлористоводородная кислота (>1°), п-димети-ламинобензальдегид Основание Шиффа ярко-желтого цвета 0,2
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
рассматриваться как потенциальное антиаритмическое средство, поэтому для проведения углубленных фармакологических и фармакокинетических исследований, создания лекарственной формы необходима стандартизация субстанции БАВ.
2. Для установления подлинности в стандарт на мономе-каин рекомендовано включить комплекс физикохимических и физических характеристик, химических реакций подлинности; при испытании на специфические примеси (полупродукты синтеза, остаточные органические растворители) - современные хроматографические методы: ВЭЖХ и ГХ; количественное содержание в исследуемом БАВ предлагается оценивать методом неводной аци-диметрии.
3. На основе проведенных исследований подготовлен проект ВФС, в который включены предложенные методы испытаний, а также в соответствии с требованиями общих статей ГФ XII нормы предельного содержания по некоторым показателям качества.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бокерия Л.А., Ступаков И.Н., Самородская И.В., Бонтарь Ю.М., Сердечнососудистые заболевания в Российской Федерации на рубеже веков: смертность, распространенность, факторы риска / Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. 2007. Т. 8. № 5. С. 5-11.
Bokeriya L.A., Stupakov I.N., Samorodskaya I.V., Bontar’ YU.M., Serdechno-sosudistye zabolevaniya v Rossijskoj Federacii na rubezhe vekov: smertnost’, rasprostranennost’, faktory riska / Byulleten’ NCSSH im. A.N. Bakuleva RAMN.
2007. Т. 8. № 5. S. 5-11.
2. Ардашев А.В. Клиническая аритмология. М.: Медпрактика-М, 2009. 1220 с.
Ardashev A.V. Klinicheskaya aritmologiya. M.: Medpraktika-M, 2009. S. 1220.
3. Машковский М.Д. Лекарственные средства / 16-е изд., перераб. испр. и доп. М.: Новая волна, 2010. 1216 с.
Mashkovskij M.D. Lekarstvennye Sredstva. M.: Novaya volna, 2010. 1216 s.
4. Хайруллина В.Р., Тарасов Г.П., Герчиков А.Я., Зарудий Ф.С., Тюрина Л.А. Изучение взаимосвязи «структура - антиаритмическая активность» в ряду производных N-фенилацетамида и амидов ароматических карбоновых кислот. Биомедицинская химия. 2010. Т. 56. Вып. 4. С. 471-479.
Hajrullina V.R., Tarasov G.P., Gerchikov A.YA., Zarudij F.S., Tyurina L.A. Izuchenie vzaimosvyazi «struktura - antiaritmicheskaya aktivnost’» v ryadu proizvodnyx n-fenilacetamida i amidov aromaticheskih karbonovyh kislot. Biomedicinskaya ximiya. 2010. Т. 56. V. 4. S. 471-479.
5. Глушков Р.Г., Южаков С.Д., Львов А.И., Жихарева Г.П., Давыдова Н.К., Сизова О.С., Аснина В.В., Салин Е.Н. Новая группа антиаритмических средств III класса - производных пиридил-4-этана. Хим.-фармацев. журн. 2011. Т. 45. № 2. С. 3-12.
Glushkov R.G., Yuzhakov S.D., L’vov A.I., Zhixareva G.P., Davydova N.K., Sizova O.S., Asnina V.V., Salin E.N. Novaya gruppa antiaritmicheskih sredstv III klassa - proizvodnyh piridil-4-etana. Him.-farmacev. zhurn. 2011. Т. 45. № 2.
S. 3-12.
6. Анисимова В.А., Спасов А.А., Толпыгин И.Е., Косолапов В.А.,
Кучерявенко А.Ф. и др. Синтез и фармакологическая активность солей 3-ацетил-2-r-9-диалкиламиноэтилимидазо[1,2-a]-бензимидазолов. Хим.-фармацев. журн. 2010. Т. 44. № 3. С. 8-13.
Anisimova V.A., Spasov A.A., Tolpygin I.E., Kosolapov V.A., Kucheryavenko A.F., Gurova N.A., et a. Sintez i farmakologicheskaya aktivnost solej 3-acetil-2-r-9-dialkilaminoetilimidazo[1,2-a]-benzimidazolov. Him.-farmacev. zhurn. 2010. Т. 44. № 3. S. 8-13.
7. Анисимова В.А., Спасов А.А., Толпыгин И.Е., Черников М.В., Яковлев Д.С.
Синтез и фармакологическая активность 1-диалкил(алкил)аминоэтил-2,3-дигидроимидазо-[1,2-а]-бензимидазолов. Хим.-фармацев. журн. 2010. Т. 44. № 5. С. 8-12.
Anisimova V.A., Spasov A.A., Tolpygin I.E., Chernikov M.V., Yakovlev D.S. Sintez i farmakologicheskaya aktivnost 1-dialkil (alkil) aminoetil-2,3-digidroimidazo-[1,2-a]benz-imidazolov. Him.-farmacev. zhurn. 2010. Т. 44. № 5. S. 8-12.
8. Шепель Ф.Г., Зозуля Р.Н., Шепель Д.Ф., Макаев Ф.З. Синтез и фармакологические свойства алкиламмонийных солей ^^-малонил-бис^-аминобензойной кислоты. Хим.-фармацев. журн. 2010. Т. 44. № 9. С. 3-5.
Shepel’ F.G., Zozulya R.N., Shepel’ D.F., Makaev F.Z. Sintez i farmakologicheskie svojstva alkilammonijnyx solej N,N'-malonil-bis-n-aminobenzojnoj kisloty. Him.-farmacev. zhurn. 2010. Т. 44. № 9. S. 3-5.
9. Гашкова О.В. Синтез, свойства и биологическая активность производных ариламидов аминокарбоновых кислот: дисс. ... канд. фармац. наук. Пермь, 2009. 140 с.
Gashkova O.V. Sintez, svojstva i biologicheskaya aktivnost’ proizvodnyh arilamidov aminokarbonovyx kislot: diss. ... kand. farmac. nauk. Perm, 2009. 140 s.
10. Гашкова О.В., Панцуркин В.И., Рудакова И.П., Сыропятов Б.Я., Вахрин М.И. Синтез, острая токсичность и антиаритмическая активность четвертичных производных и минеральных солей 2'-броманилида, 3-\,\-диэтиламинопропановой кислоты. / Современное состояние и пути оптимизации лекарственного обеспечения населения: Материалы Российской научно-практической конференции ПГФА (14-я международная выставка «Медицина и здоровье», 13-15 ноября 2008 г.). Пермь. 2008. С. 218-221.
Gashkova O.V., Pancurkin V.I., Rudakova I.P., Syropyatov B.YA., Vahrin M.I. Sintez, ostraya toksichnost’ i antiaritmicheskaya aktivnost’ chetvertichnyh proizvodnyh i mineralnyh solej 2'-bromanilida, 3-N,N-dietilaminopropanovoj kisloty. / Sovremennoe sostoyanie i puti optimizacii lekarstvennogo obespecheniya naseleniya: Materialy Rossijskoj nauchno-prakticheskoj konferencii PGFA (14-ya Mezhdunarodnaya vystavka «Medicina i zdorove», 13-15 noyabrya 2008 g.). Perm. 2008. S. 218-221.
11. Калинин Д.В. Синтез, изучение физико-химических свойств и биологической активности солей ариламидов \-алкилпирролидин-2-карбоновой кислоты: автореф. дис. . канд. фарм. наук. Пермь, 2013. 24 с.
Kalinin D.V. Sintez, izuchenie fiziko-himicheskih svojstv i biologicheskoj aktivnosti solej arilamidov n-alkilpirrolidin-2-karbonovoj kisloty: avtoref. dis. ... kand. farm. nauk. Perm, 2013. 24 s.
12. Государственная фармакопея Российской Федерации: 12-е изд. / МЗ РФ. Ч. 1. М.: «Научный центр экспертизы средств медицинского применения»,
2008. 704 с.
Gosudarstvennaya Farmakopeya Rossijskoj Federacii: 12-e izd. / MZ RF. Ch. 1. M.: «Nauchnyj centr ekspertizy sredstv medicinskogo primeneniya», 2008. 704 s.
Ш
