CC BY
62
Медицинская Иммунология 2005, Т. 7, Ms 4, стр 405-410 © 2005, СПб РО РААКИ
Оригинальные статьи
ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ
КЛАРИТРОМИЦИНА
ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПСОРИАЗА
Рыбкина В.Л.
Научно-исследовательский кожно-венерологический институт МЗ Республики Казахстан
Резюме. Изучено влияние кларитромицина на процессы пролиферации и дифференцировки кератино-цитов, экспрессию кластеров дифференцировки и пролиферативную активность лимфоцитов больных псориазом in vitro. Установлено, что в культуре кларитромицин в дозе 2 мкг/мл угнетал пролиферацию керати-ноцитов больных псориазом и увеличивал степень их дифференцировки. Влияние этого препарата было опосредованным, оно осуществлялось через CD4+ лимфоциты. Кроме того, кларитромицин in vitro уменьшал количество CD25+ лимфоцитов и снижал спонтанную и ФГА - индуцированную пролиферацию лимфоцитов больных псориазом. Полученные данные создают предпосылки для включения этого препарата в схему лечения псориаза.
Ключевые слова: псориаз, лечение, кларитромицин, кератиноциты, лимфоциты.
Rybkina V.L.
THE GROUNDS OF CLARITROMYCIN USE IN THE TREATMENT OF PSORIASIS
Abstract. Claritromydn influence on the keratinocytes proliferation and differentiation and lymphocytes proliferation and clasters of differentiation expression in vitro was investigated. It was established that claritro-mycin in dose 2 mkg/ml inhibited psoriatic keratinocytes proliferation and increased its differentiation degree in culture. Claritromycin influence was mediated by CD4+ lymphocytes. Furthermore, claritromycin in vitro decreased the number of CD25+ lymphocytes and spontaneous and PHA-induced lymphocytes proliferation for psoriatic patients. These data allow to include claritromycin in the treatment regimen of psoriasis. (Med. Immunol., 2005, vol.7, № 4, pp 405-410)
Введение
Проблема поиска препаратов, целенаправленно подавляющих активность определенных регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов при псориазе остается актуальной. Большинство применяемых в настоящее время средств для лечения этой патологии (глюкокортикоиды, иммунодепрессанты) обладают мощным иммуносупрессив-ным эффектом, но они направлены практически на все звенья иммунитета, вызывая осложнения и побочные эффекты [11]. В последние годы пристальное внимание исследователей в качестве пре-
Адрес для переписки:
Рыбкиной Валентине Львовне.
456787, Челябинская обл. г. Озерск, пр. Карла Маркса 23, кв. 106.
Тел: (35171) 7-71-71 (дом), 7-46-08 (раб). E-mail: valenta5@rambler.ru
паратов, способных подавлять функции некоторых иммунокомпетентных клеток, привлекли антибиотики макролидного ряда. Данные исследователей свидетельствуют об их способности подавлять продукцию тех цитокинов, которые задействованы в патогенезе псориаза и, по мнению большинства авторов, приводят к усилению пролиферации и нарушению дифференцировки кератиноцитов, а также к возникновению воспалительных явлений. Такими цитокинами являются ^-1, ^-2, ^-8, TNFa. Кроме того, они подавляют активацию и хемотаксис полинуклеаров, при этом увеличивая синтез противовоспалительного интерлейкина 10, усиливают поглотительную и переваривающую способность нейтрофилов и макрофагов и активность естественных киллеров [8,
9, 12]. Такие свойства макролидов и кларитроми-цина в частности могут оказать положительный эффект при лечении псориаза, поскольку воздей-
ствуют на основные звенья развития псориатичес-кого процесса.
Целью данного исследования явилось изучение влияния кларитромицина на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов и на пролиферативную активность и экспрессию кластеров диф-ференцировки лимфоцитов in vitro у больных псориазом.
Материалы и методы
Объектом исследования были кератиноциты пораженной (PP) и не пораженной (PN) кожи 140 больных псориазом и i00 клинически здоровых людей (NN), а также лимфоциты их периферической крови. Культивирование кератиноцитов проводилось по методу [10]. Пролиферативная активность кератиноцитов оценивалась прямым подсчетом клеток, митотической активности, определением содержания ДНК [6, 7]. Метаболическая активность оценивалась по включению Н3-тимиди-на (Sigma, США) с помощью ß-счетчика. Степень дифференцировки кератиноцитов определяли по способности кератиноцитов экспрессировать ин-волюкрин [1]. Процент живых клеток определялся с помощью трипанового синего (Sigma, США), он составил 95%. Чистоту выделения субпопуляций проверяли с помощью реакции непрямой мембранной иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител против кластеров дифферен-цировки CD4+- лимфоцитов (Sigma, США). Она приближалась к 90-95%. Каждый вариант опыта дублировался в 3-х лунках. В контрольных лунках инкубировались только кератиноциты (вариант а), в опытных - кератиноциты с добавлением CD4+ -лимфоцитов (вариант б) и кератиноциты с добавлением CD4+ лимфоцитов и кларитромицина (вариант в). Концентрация лимфоцитов в лунках составила 2х106 кл/мкл,кератиноцитов - Зх102 кл/ мкл. Соотношение эпителиальных и лимфоидных клеток в культуре соответствовало их соотношению в пораженных участках кожи больных псориазом в прогрессирующей стадии [3]. Объем смешанной культуры составлял 200 мкл. Инкубация проводилась в течение 3-х суток при 37оС в атмосфере, содержащей 5% СО . Для того, чтобы исключить увеличение включения радиоактивной метки за счет лимфоцитов в отдельных лунках инкубировались CD4+- лимфоциты с предварительно обработанными митомицином С (Sigma, США) аутологичными кератиноцитами. Аутологичные кератиноциты из пораженных и непораженных участков кожи получали из биоптатов путем механической обработки и трипсинизации (трипсин фирмы Sigma, США) эпидермиса с последующей инкубацией их в течение 30 мин при 37°С мито-мицином С в концентрации 50 мкг/мл.
Накануне определения в лунки добавляли 3Н тимидин (Sigma, США) 5,0 мккю/мл. Радиоактивность определялась на ß-счетчике. При оценке митотической активности кератиноцитов под влиянием CD4+ лимфоцитов из показателей радиоактивности смешанной культуры лимфоцитов и ке-ратиноцитов вычитали показатели радиоактивности лимфоцитов и убитых кератиноцитов. Аналогичная процедура проводилась и при определении ДНК в культурах клеток. Исследовалось влияние 2-х концентраций кларитромицина, соответствующих концентрациям этого препарата в сыворотке крови при применении 250 и 500 мг кларитро-мицина - i и 2 мкг/мл [8]. Проводилось 2 варианта опыта: один для изучения прямого влияния кла-ритромицина на процессы пролиферации и диф-ференцировки кератиноцитов и второй для выявления опосредованного СD4+ лимфоцитами влияния этого препарата. В опыте в качестве фактора, опосредующего влияние кларитромицина, использовались СD4+лимфоциты, поскольку именно они признаются триггерным фактором в развитии псо-риатического процесса [2, 3].
Поскольку концентрация кларитромицина i мкг/мл не оказывала существенного влияния на процессы пролиферации и диффференцировки ке-ратиноцитов, данные по ее исследованию не приводятся, и все указанные в статье результаты получены при исследовании концентрации 2 мкг/мл.
При изучении влияния кларитромицина на пролиферативную активность лимфоцитов и экспрессию ими кластеров дифференцировки лимфоциты выделяли из крови по методу [4] и инкубировали в RPMI 1640 (Sigma, США) c добавлением 10% ЭТС (Sigma, США) и 2 мкг/мл кларитро-мицина в течение суток. Контрольную пробу инкубировали в аналогичной среде без добавления кларитромицина. Затем исследовали пролиферативную активность лимфоцитов в ответ на ФГА (Murex Biotech LTD, Великобритания) и экспрессию кластеров дифференцировки лимфоцитов с использованием моноклональных антител фирмы Sigma (США) в опытных и контрольных пробах по методу [1].
Математическая обработка полученных результатов проводилась методами параметричесой статистики на персональном компьютере с использованием программы «Statistica 5,0». Значимыми считали результаты при р<0,05.
Результаты
Из приведенных в таблице i данных видно, что добавление кларитромицина к чистой культуре ке-ратиноцитов не приводило к изменению их пролиферации и дифференцировки. При инкубации кератиноцитов пораженной и не пораженной кожи
больных псориазом совместно с CD4+ лимфоцитами резко повышалась их пролиферативная активность и снижалась степень их дифференцировки. В контрольных лунках, где инкубировались кератиноциты и CD4+ лимфоциты здоровых людей изменений в пролиферативной активности и степени дифференцировки кератиноцитов не произош-
ло. В тех лунках, в которых к культуре эпидермальных кератиноцитов и CD4+-лимфоцитов больных псориазом был добавлен кларитромицин, снизилось число кератиноцитов, содержание ДНК, число митозов, что свидетельствует об ингибирующем влиянии кларитромицина на пролиферацию кера-тиноцитов в этом варианте опыта. Снижалась так-
Табл.1. ВЛИЯНИЕ КЛАРИТРОМИЦИНА НА ПРОЦЕССЫ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЕРАТИНОЦИТОВ, ИНКУБИРОВАВШИХСЯ С АУТОЛОГИЧНЫМИ CD4+ -ЛИМФОЦИТАМИ БОЛЬНЫХ ПСОРИАЗОМ
Критерии оценки пролиферации и дифференцировки кератиноцитов NN (n=1OO) PN (n=240) PP (n=240)
a) 15,0±1,6 32,4±2,5 24,3±1,9
1. Количество кератиноцитов в культуре х104 клеток б) 15,9±1,4 33,1 ±1,9 25,0±1,7
в) 17,9±1,9 156±13* 161 ±14*
г) 16,6±2,0 37,2±2,5** 29,4±3,0**
а) 89±7 81 ±8 94±8
б) 87±9 84±9 92±9
2. Включение радиоактивной метки, имп/мин
в) 93±8 160±9* 233±19*
г) 89±7 88±8** 90±9**
a) 5,6±0,4 6,9±0,5 7,8±0,5
б) 6,1±0,5 7,0±0,7 7,9±0,7
3.Количество ДНК ^/лунку
в) 5,9±0,6 52,8±0,9* 83,6±1,7*
г) 6,2±0,7 8,3±0,8** 8,7±0,9**
a) 21 ±2 28±2 34±3
б) 23±2 31 ±3 35±4
4. Число митозов S/1000 кл
в) 25±3 43±3* 59±4*
г) 24±5 30±3** 33±3**
a) 41 ±3 33±2 27±3
5. Число инволюкрин-положительных клеток б) 42±2 32±3 29±3
на 100кл в) 40±3 21 ±1 * 18±2*
г) 45±4 32±3** 28±3**
Примечание:
NN - кератиноциты кожи здоровых людей,
PN - кератиноциты непораженных участков кожи больных псориазом,
PP-кератиноциты пораженных участков кожи больных псориазом.
Графа а - данные культур клеток без добавления лимфоцитов, б - данные культур клеток с добавлением кларитромицина, в - данные культур клеток с добавлением лимфоцитов, г - данные культур клеток с добавлением лимфоцитов и кларитромицина.
* - результаты статистически достоверно отличаются от таковых без добавления лимфоцитов, ** - результаты отличаются от таковых без добавления кларитромицина.
Табл. 2. ИММУНОФЕНОТИПИРОВАНИЕ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ ПСОРИАЗОМ
МоноклонАТ Псориаз (n=240) Клинически здоровые люди (n=100)
% абс кл/мкл % абс кл/мкл
а) 57,7±3,2 1731 ±136* 59,1 ±3,1 1064±108
CD3
б) 53,9±3,0 1617±111 58,7±3,2 1057±100
а) 38,2±1,6 1146±94* 38,4±2,9 691±63
CD4
б) 37,5±1,7 1125±100 38,8±2,6 698±61
а) 20,5±1,3 615±52* 20,8±1,4 374±25
CD8
б) 21,5±1,7 645±51 21,7±1,9 390±20
а) 2,0±0,2 2,0±0,2 2,0±0,2 2,0±0,2
CD4/CD8
б) 2,0±0,1 2,0±0,1 2,0±0,1 2,0±0,2
а) 12,1 ±1,1* 363±29* 7,0±0,7 126±10
CD20
б) 12,3±1,7 369±31 7,3±0,8 126±11
а) 4,4±0,7* 132±11* 0,2±0,03 3,6±0,2
CD25
б) 0,3±0,05** 9,0±0,9** 0,2±0,03 3,6±0,1
Примечание: строка а - результаты без кларитромицина, б - с кларитромицином,
* - результаты статистически достоверно отличаются от показателей здоровых людей,
** - результаты статистически достоверно отличаются от таковых без воздействия кларитромицина.
Табл. 3. ВЛИЯНИЕ КЛАРИТРОМИЦИНА НА ПРОЛИФЕРАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ БОЛЬНЫХ ПСОРИАЗОМ IN VITRO
Условия инкубации Больные псориазом (n=240) Клинически здоровые (n=100)
Спонтанная ФГА-индуц. Спонтанная ФГА-индуц.
С кларитро-мицином 4,1 ±0,3** 23,8±0,2** 1,0±0,1** 40,3±0,3**
Без кларитро-мицина 10,6±1,3* 46,3±2,1* 1,8±0,1 68,9±0,5
Примечание:
* - показатель отличается статистически достоверно от такового у клинически здоровых людей,
** - показатель статистически достоверно отличается от такового без добавления кларитромицина
же метаболическая активность этих кератиноци-тов, о чем свидетельствовало снижение включения радиоактивной метки. Степень дифференцировки псориатических кератиноцитов в этой системе увеличивалась, как показывают данные по определению количества инволюкрин-положительных ке-ратиноцитов.
В культурах, состоявших из смеси лимфоидных и эпидермальных клеток здоровых людей, изменений от добавления кларитромицина не было.
Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что в контрольных пробах лимфоцитов больных псориазом относительное
количество CD3+, CD4+, CD8+- лимфоцитов статистически достоверно не отличалось от показателей клинически здоровых людей, абсолютное их содержание было повышено. Регуляторный индекс у больных псориазом не отличался от такового у клинически здоровых людей. Абсолютное и относительное содержание В-лимфоцитов было повышено. Резко увеличено было абсолютное и относительное содержание активированных лимфоцитов, имеющих рецепторы к IL-2 (CD25+).
Приведенные результаты позволяют сделать вывод об отсутствии влияния кларитромицина на экспрессию кластеров дифференцировки CD3,
CD4, CD8, CD20, как у больных псориазом, так и у клинически здоровых людей in vitro. После инкубации лимфоцитов больных псориазом с кла-ритромицином экспрессия CD25+ снизилась до показателей клинически здоровых людей. У клинически здоровых людей исследованные показатели не претерпели сколько-нибудь значительных изменений под влиянием кларитромицина.
Установлено, что спонтанная пролиферация лимфоцитов у больных псориазом в контрольной пробе была повышена (табл.3). ФГА-индуцирован-ная пролиферация лимфоцитов у этих больных была снижена. Добавление кларитромицина к культуре лимфоцитов приводило к уменьшению спонтанной и ФГА - индуцированной пролиферации лимфоцитов как у больных псориазом, так и у клинически здоровых людей.
Обсуждение
Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод, что пролиферативная и метаболическая активность кератиноцитов снижалась, а степень дифференцировки увеличивалась под действием кларитромицина. Однако, очевидно, что это влияние было опосредованным, поскольку в чистых культурах кератиноцитов не проявлялось, а сказывалось только в смешанных культурах с CD4+ лимфоцитами, где пролиферативная активность кератиноцитов была увеличена, а степень дифференцировки снижена. Механизм влияния кларитромицина на пролиферацию и дифферен-цировку кератиноцитов, вероятнее всего, связан с подавлением синтеза цитокинов лимфоидными клетками, что подтверждается исследованиями ряда авторов [8, 9, ІІ, І2].
Кроме того, кларитромицин in vitro снижал экспрессию рецепторов к IL-2 на лимфоцитах больных псориазом, снижал пролиферативную активность лимфоцитов у больных псориазом и клинически здоровых людей. Причиной снижения пролиферативной активности лимфоцитов могло быть снижение синтеза IL-2 лимфоцитами, поскольку кларитромицин способен ингибировать синтез IL-2 как in vivo, так и in vitro [8, 9, 12].
CD25+-лимфоциты - это субпопуляция лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы к IL-2. Это маркер активированных лимфоцитов. Высок процент активированных CD25+DR+ - клеток в пораженной коже больных псориазом [3]. Как известно, именно активированные Т-лимфоциты признаются в настоящее время триггерным фактором в развитии псориаза, поэтому снижение их количества у больных псориазом под влиянием кла-ритромицина in vitro можно считать благоприятным явлением. Снижение экспрессии рецепторов к IL-2 прерывает патогенетическую цепь цито-
кинных взаимодействий при псориазе, приводящих к нарушению процессов пролиферации и дифференцировки клеток эпидермиса. Известно, что пролиферация лимфоцитов у больных псориазом в местах поражения усилена [5]. Снижение пролиферативной активности лимфоцитов в очагах поражения больных псориазом при применении кларитромицина также может оказать благоприятное влияние на состояние кожного процесса.
Поскольку кларитромицин оказывает положительное влияние на основные патогенетические звенья псориаза: снижает содержание активированных лимфоцитов, пролиферативную активность лимфоцитов, пролиферативную активность кератиноцитов, повышает степень их дифференци-ровки in vitro, этот препарат может быть включен в схему лечения псориаза.
Список литературы
1. Иммунологические методы/ под ред. Г. Фри-меля М.: Медицина, І987. -3І4 с.
2. Adamicova K., Fetisovova Z., Qngel P. Quantitative changes in CD4+ and CD8+ T-lymphocyte in skin of patients with psoriasis treated with cyclospo-rine A// Cesc Patol, 200i.-Vol. 37.- №4.- P. 154 -i57.
3. Bos J.D. Immunocompetent cells in psoriasis: in situ immunophenotyping by monoclonal antibod-ies// Arch Dermatol Res.-i983.- Vol.-275.- P.i8i-i89.
4. Boyum A: Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood//Scand. J. Сііп. Lab. Invest. - І988. - Vol. 2.- N3.- P. 77-89.
5. Œang J.I., Smith L.R., Froning K.J. Persistence of T - cell clones in psoriatic lesions // Arch Dermatol. - І997. - Vol. 133.- № 6.- P. 703 -709.
6. Liu S.C, Eaton M.G., Karasek M. Growth characteristics of human epidermal keratinocytes from newborn foreskins in primary and serial cultures// In vitro, 1979.- Vol.i5.- P. 8І3-82І.
7. Leyra A., Jr.KelleyW.N. Measurement of DNA in cultured human cells //Anal biochem. -І974. - Vol. 62.- №5. - P. І73-І79.
8. Mac Leod CM. Novel claritromycin research// Macrolides in the new Millenium: international consensus conference. - 2000. - P. 35-39.
9. Morikawa С. J. daritromycin influence on inflammatory cytokines roduction // J.Invest.Dermatol. - І998. - Vol.i3. - N7 P. І4-І8.
10. Rheinwald T.G., Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells // Сєіі. - І975. - Vol. 6.- № 2. - P. 33І - 344.
11. Spuls PI, Bossuyt PM, van Everlingen JJ, Witcamp L, Bos JD The development of practice
guidelines for the treatment of severe plaque form psoriasis// Arch Dematol. - 1998. -Vol. -134.-P.1591-1596.
12. Takeshita K., Yamagishi I., Harada M. Immu-
nological and anti-inflammatory effects of clarythto-mycine: inhibition of interleukin 1 production of murine peritoneal macrophages// Drugs Exp. Clin.Res.-1989. -Vol. 15. -P. 527-533.
поступила в редакцию 26.12.2004 принята к печати 27.01.2005
