Обнаружение этанола в крови и моче методом статического парофазного газохроматографического анализа Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

38

ОБМЕН ОПЫТОМ

© Д.С. Сопин, Н.В. Захарченко, 2014 УДК 340.67:543.544

Д.С. Сопин, Н.В. Захарченко

ОБНАРУЖЕНИЕ ЭТАНОЛА В КРОВИ И МОЧЕ МЕТОДОМ СТАТИЧЕСКОГО ПАРОФАЗНОГО ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

Северо-Казахстанский филиал РГКП «Центр судебной медицины» МЗ Республики Казахстан

(директор - М.А. Картов)

Описан метод определения этанола в биологических образцах. В работе проведена оценка метрологических характеристик метода.

Ключевые слова: этанол, газовая хроматография.

DETECTION OF ETHANOL IN THE BLOOD AND URINE BY STATIC HEADSPACE GAS CHROMATOGRAPHIC ANALYSIS

D.S. Sopin, N.V Zakharchenko

The method of the determination of the ethanol in biological samples is described. In the work the metrological characteristics of the method are shown.

Key words: ethanol, gas chromatography.

Цель работы: подобрать оптимальные условия для осуществления метода на имеющемся оборудовании; проверить такие параметры, как правильность, прецизионность, линейность, предел количественного определения, предел детектирования, специфичность, время установления фазового равновесия.

Отбор образцов, транспортировка, хранение образцов осуществляли согласно инструкции [4].

Оборудование, калибровочные растворы, реактивы, вспомогательные материалы:

Оборудование: Газовый хроматограф «Кристалл Люкс 4000М» с детектором ионизации в пламени; приставка для статического парофазного анализа HTA 2000H; программа обработки хроматографических данных «NetChrom v2.1».

Калибровочные растворы этилового спирта в дистиллированной воде с концентрациями: 0,3, 1,0, 2,0, 4,0, 6,0%о. Внутренний стандарт: 1% н-пропанол в дистиллированной воде. Для приготовления калибровочных растворов и раствора внутреннего стандарта использовали реактивы с известным содержанием компонентов и соответствующей чистотой [5-7].

Применяли вспомогательное оборудование с установленными метрологическими характеристиками [8-9].

Калибровочные растворы и раствор внутреннего стандарта использовали в день приготовления.

Суть метода: Метод основан на принципе определения этилового спирта в парогазовой фазе хроматографическим методом с термостатированием анализируемых проб [2, 12,13].

Процедура: Измерение без внесения внутреннего стандарта. 0,5 см3 крови (мочи) и 5,0 см3 дистиллирован-

ной воды помещали в стеклянные флаконы емкостью 20 см3, герметично укупоривали и исследовали. На хроматограммах регистрировали наличие либо отсутствие пиков этанола и н-пропанола.

Измерение с внутренним стандартом. В стеклянные флаконы с объемами 20 см3 помещали по 0,5 см3 крови (мочи, калибровочного раствора), затем добавляли по 0,5 см3 1% раствора н-пропанола и по 5,0 см3 дистиллированной воды, герметично укупоривали и исследовали. Коэффициент пересчета для крови, мочи, калибровочных растворов - 1. Проводили по два измерения для каждого образца. За окончательный результат принимали среднее арифметическое значение двух измерений.

Условия газохроматографического разделения и пробоподготовки. Приставка для парофазного анализа: температура термостата - 90°С; температура шприца - 90°С; время термостатирования - 6 мин.; время встряхивания образца - 0,5 мин.; объем забора пробы - 1 см3; скорость забора пробы - 10 см3/мин.; скорость ввода пробы - 50 см3/мин. Газовый хроматограф: колонка капиллярная кварцевая - Rtx-BAC PLUS 1 30 m x 0.53 mm x 3.0 цт; температура термостата колонок - 100°С; температура испарителя - 150°С; температура детектора - 200°С; давление на капиллярной колонке - 0,3 атм.; расходы газов гелий, водород, воздух 30, 60, 500 см3/мин. соответственно.

Установление времени равновесного распределения. В доступной литературе отражено многообразие параметров (время и температура термостатирования) для достижения равновесного распределения между двумя фазами.

Установление равновесного распределения проводили в опыте: хроматографировали 4 % раствор этанола с

39

раствором внутреннего стандарта, пробоподготовка и условия хроматографического разделения указаны в тексте.

Время термостатирования варьировали в интервале 3-15 минут. Проводили две повторности измерения для каждого параметра «временя термостатирования». Функцию зависимости устанавливали: площадь пика на хроматограмме от времени термостатирования образца.

Считали, что установлению равновесия соответствует - максимальное значение площади пика при определенном времени термостатирования.

Нами были подобраны и опробованы оптимальные параметры: время термостатирования - 6 мин. при температуре - 90°С.

Линейность градуировочного графика. Линейность устанавливали на основании результатов испытаний, которые пропорциональны концентрации анализируемого вещества в образце в пределах методики (0,3-6,0%о). Для подтверждения линейности использовали параметры: коэффициент детерминации, фактор отклика [1].

Критерии приемлемости. Диапазон считали линейным, если коэффициент детерминации между рядом полученных значений будет не ниже 0,995 [15]. Допустимые колебания значений фактора отклика в пределах 2-3% от значения, соответствующего средней концентрации [1].

Правильность [10, 11] устанавливали путем применения аналитического метода к анализируемому объекту с использованием стандарта известной степени чистоты. Правильность оценивали на основе 9 результатов определений на 3 уровнях концентраций в пределе аналитической области.

Для оценки правильности использовали значения процента восстановления - отношение измеренного содержания этанола к заданному содержанию этанола.

Критерий приемлемости: процент восстановления при использовании концентраций 80, 100, 120% скорректированный на 100%, считали приемлемым в пределах от 90-110% [14].

Прецизионность устанавливали по результатам 6 определений при анализе 2% раствора этанола с раствором внутреннего стандарта.

Для оценки прецизионности использовали показатели: среднее квадратичное отклонение и коэффициент вариации [10, 11].

Измерения проводили в идентичных объектах, в одной и той же лаборатории, одним и тем же оператором, с использованием одного и того же оборудования и реактивов, в пределах короткого промежутка времени.

Таблица 1

Некоторые параметры метода

Параметр

Линейность

- линейный диапазон

- коэффициент детерминации Правильность

0,3-6,0 %о 0,9991

- процент восстановления

103,3,101,7,104,7%

Прецизионность

- стандартное отклонение

- коэффициент вариации Предел обнаружения

0,00591

0,28

0,05%о

Предел количественного определения

0,1%о

Критерий приемлемости. Коэффициент вариации параллельных определений для 6 измерений считали приемлемым: не более 5%.

Специфичность. Для подтверждения специфичности метода использовали показатель разрешения [3].

Критерий приемлемости: разрешение пика определяемого компонента с любым соседним пиком пробы должно быть более 1,0 [3].

Предел обнаружения и предел количественного определения рассчитывали на основе величин: стандартное отклонение относительно линии регрессии и углового коэффициента градуировочной зависимости. Обе величины были определены в концентрационном диапазоне, близком к пределу обнаружения (0,3-1,0%) [1]

Предел обнаружения и предел количественного определения составили 0,05 и 0,1 % соответственно.

Обсуждение результатов. В ходе эксперимента установлены специфические параметры аналитического метода сопоставимые и не превышающие критерии приемлемости (см. таблицу 1).

Метод позволяет достоверно определять этиловый спирт в крови и моче в присутствии метанола, изо-пропанола, изо-бутанола, н-бутанола. Однако, в присутствии н-пропанола в образцах достоверно установить концентрацию этанола невозможно.

Литература:

1. Аналитическая химия: в 2 томах. /Г. Кристиан; пер. с англ. — М.:БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. — Т. 1. — 623 с.

2. Савчук С.А., Веденин А.Н. «Обнаружение и количественное определение летучих токсичных веществ и гликолей в биологических объектах методами газовой хроматографии и хромато-масс-спектрометрии». Пособие для врачей клинической лабораторной диагностике. — М., 2003.

3. Царев Н.И., Царев В.И., Катраков И.Б. Практическая газовая хроматография: Учебно-методическое пособие для студентов химического факультета по спецкурсу «Газохроматографические методы анализа». — Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2000. — 156 с.

4. Приказ министра здравоохранения Республики Казахстан от 20 мая 2010 года Ns 368 Об утверждении Инструкции по организации и производству судебно-медицинской экспертизы.

5. ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная.

6. ГОСТ 5962-67 Этанол ректификат.

7. ТУ 2632-106-44493179-07 н-пропанол.

8. ГОСТ 20292-74ЕМерные пипетки.

9. ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная.

10. ГОСТР ИСО 5725 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

11. РМГ 76-2004 ГСИ. «Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа».

12. Kristoffersen L., Stormyhr L-E., Smith-Kielland A. Headspace gas chromatographic determination of ethanol: the use of factorial design to study effects of blood storage and headspace conditions on ethanol stability and acetaldehyde formation in whole blood and plasma // Forensic Sci Int. — 161: 151-157 (2006).

13. Zelda Penton. Headspace Measurement of Ethanol in Bloodby Gas Chromatographywith a Modified Autosample // CLIN. CHEM. 31/3, 439-441 (1985).

14. Society of Forensic Toxicologists/American Academy of Forensic Sciences, Forensic Toxicology Laboratory Guidelines, 2006.