CC BY
56
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Коллектив авторов, 2013
УДК: 618.3-06:616.45-008.1-053.1 ]-07
ОБНАРУЖЕНИЕ, АНАЛИЗ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЭКДИСТЕРОИДОВ ТРАВЫ МЯГКОВОЛОСНИКА ВОДНОГО И ВОЛДЫРНИКА ЯПОНСКОГО
С.В. Дармограй, Н.С. Фурса, Н.С. Ерофеева
Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, г. Рязань Ярославская государственная медицинская академия, г. Ярославль
При хроматографировании спиртовых извлечений травы мягковолосника водного и волдырника японского ТСХ выявлен разнообразный набор экдистерои-дов, доминирующие компоненты которых идентифицированы с экдистероном и полиподином В при сравнении с заведомо известными образцами и ВЭЖХ.
Ключевые слова: мягковолосник водный, волдырник японский, экдистероиды.
Объектами углубленных исследований в последние годы являются трава мягковолосника водного (Myosoton aquaticum ^.) Moench) и волдырника ягодного (Cucubalus baccifer L.) [1-4, 8-13, 15]. По жизненной форме они являются многолетними травянистыми растениями, произрастающими в Европейской части РФ, на Кавказе, в Западной Сибири, на Дальнем Востоке [6, 7]. В химическом отношении трава волдырника изучена
в большей мере, чем мягковолосника. В обоих растениях содержатся сапонины, гидроксикоричные кислоты, флавоноиды. Так, в траве волдырника обнаружены моногидрат 3-гидрокси-5,7,4'-триметокси-флавона и 5,7,4'-тригидроксифлавон [13, 15], а мягковолосника - разнообразные гликофлавоноиды апигенина, являющиеся ротационными изомерами, некоторые из них приведены в таблице 1 [6].
Таблица 1
Структурные формулы ротационных изомеров С-моногликозидов апигенина травы
мягковолосника водного
витексин
изовитексин
В траве волдырника выявлены многие природные соединения, в частности 4-гид-роксибензойная кислота и 4-гидроксибен-зальдегид [13], азотсодержащие соединения (кукубалактам, 6-метоксипиперидин-2-он, птеролактам, 4-гидроксибензопропаниловая кислота) [11, 15], производные кукубалуге-нина А [8], разнообразный набор сескитер-пеноидов, представленных, кукубалолом, кукубадполом, кукубалдиолом, кукубалак-тоном, друммондолом и его 11-0-Р-0-глюкопиранозидом, 5,7(Е)-мегастигмадиен-3в, 4а, 9в-триолом [10, 12]. Из природных соединений, характерных для гвоздичных, содержатся экдистероиды (экдистерон, 24(28)-экдистерон, 22-дезоксиэкдистерон, 25-гидроксипанустерон, рубростерон, 3-^-О-Р^-глюкопиранозид 2,22-дидезоксиэкди-стерона) [9].
В последние годы в траве обоих растений нами идентифицировано до 20 аминокислот, обнаружены свободные и связанные сахара, определено более 60 различных макро-, микро- и ультрамикроэлементов [3, 4].
Из приведенных данных видно, что химический состав мягковолосника вод-
ного недостаточно изучен, хотя его сырьевые ресурсы значительные. Он представляет собой многолетние травянистое растение, высотой 20-70 см, в верхней части железисто-опушенное, в нижней - голое. Его стебель приподнимающийся, простой или чаще на верху ветвистый. Листья яйцевидные, 3-6 см длиной и 1-4 см шириной, верхние - сидячие, нижние - на коротких черешках. Соцветия - раскидистый полузонтик, прицветники зелёные, листовидные; цветоножки 1-2, 5 см длиной, лепестки белые в 1,5-2 раза длиннее чашечки, коробочки немного длиннее чашечки. Семена тёмно-коричневые, округло-почковидные, плоские. Цветёт в июне-ноябре [7].
Следует отметить, что виды семейства гвоздичных в настоящее время вызывают пристальный интерес как источники экдистероидов, обладающих разнообразными фармакологическими свойствами [3-5]. Вместе с тем неоднозначно трактуется их обнаружение. Так, наличие этих соединений в недалеком прошлом отрицалось в траве мягковолосника водного [5]. Положительное решение этого вопро-
са позволит не только обозначить более определенно его положение в семействе гвоздичные. Оно имеет несомненную практическую значимость, заключающуюся в возможном более осмысленном применении этого растения в медицине.
Подобная ситуация сложилась и для видов волдырника. Не так давно наличие в них экдистероидов тоже ставилось под сомнение [5, 14]. Вместе с тем еще в 1987 году сообщалось о выделении из травы волдырника ягодного экдистерона, поли-подина В, о наличии других минорных экдистероидов [1]. В дальнейшем упомянутые данные не только были подтверждены, но и указывалось на выделение ряда новых природных соединений [8-13, 15]. Кроме того, в 2009 году мы сообщили о наличии экдистероидов в траве волдырника японского (Cucubalus japonicus L.). Наряду с этим не предпринималось сравнительное исследование экдистероидов мягковолосника водного, волдырника японского и в. ягодного. Тем более не приводились убедительные данные об обнаружении этих соединений.
Цель исследования: провести обнаружение, анализ качественного состава и идентификацию отдельных экдистероидов травы мягковолосника водного и волдырника японского.
Материалы и методы
Надземную часть мягковолосника водного собрали в окрестностях г. Рязани в июне 2009 года, волдырника японского
- на Дальнем Востоке.
Хроматографическое изучение спиртовых извлечений из них провели ТСХ на пластинках «ЗППЫ UV 254» в системах хлороформ : спирт (1:2), (1:3), (1:5) и н-бутанол : кислота уксусная : вода (4:1:5, верхний слой), с последующей обработкой хроматограмм 1% кислотой ванилин-серной. В качестве достоверных образцов служили экдистерон, и полиподин В, выделенные из смолёвки татарской.
Подготовку проб для анализа проводили следующим образом. Навеску сырья 2-3 г заливали 30 мл 96 % спирта этилового, настаивали при комнатной температуре в течение суток, извлечение
сливали, а сырьё повторно извлекали подобным образом ещё раз. Объединённые извлечения упаривали досуха, остаток обрабатывали 20 мл воды очищенной, фильтровали, фильтрат упаривали досуха, остаток растворяли в 20 мл 96 % спирта этилового, добавляли 10 г алюминия оксида. Этот порошок наносили на колонку с алюминия оксида (30 г) и вещества с колонки элюировали 70 % спиртом этиловым. Элюат использовали для хроматографирования.
После обработки хроматограмм 1 % раствором ванилина в кислоте серной, экдистероиды проявлялись при дневном свете в виде бурых с зеленоватым оттенком пятен; в УФ-свете они флуоресцировали голубым с различными оттенками цветом. Такими же цветами флуоресцируют и различные фенолкарбоновые кислоты, что затрудняет детектирование экдистероидов. Однако при выдерживании хроматограмм в течение 2-3 суток фенолкарбоновые кислоты практически обесцвечивались, а экдистероиды (экди-стерон, полиподин В и др.) приобретали светло-лиловую окраску в УФ-свете. Изложенное позволяет объяснить, почему во многих случаях из-за трудности обнаружения их наличие в отдельных видах отрицалось, хотя они в них содержались.
При проведении исследований использовали так же жидкостный хроматограф Surveyor MSQ фирмы Thermo Finnigan (США). Условия хроматографирования: колонка Waters Xterra MS C18.
3.5 um 2,1х30 mm; навеска образца 0,5-1 мг, растворитель для образца 50 % ДМСО, 50 % ацетонитрила; подвижная фаза: А - 0,01 % раствор кислоты муравьиной, В - ацетонитрил. Температура колонки 25 °С. Скорость подвижной фазы -
1.5 мл в минуту. Время анализа - 4,5 мин.
Градиент.
мин. А % В %
0,0 100 0
0,1 100 0
2,1 5 95
2,5 5 95
2,6 100 0
4 100 0
Детектирование осуществлялось с использованием диодной матрицы (PDA) «Agilent» в диапазоне длин волн 190-800 нм; масс-спектрального детектора - метод ионизации - APCI (химическая ионизация при атмосферном давлении, регистрация положительных и отрицательных ионов); детектора по светорассеиванию (ELSP).
Для детализации некоторых вопросов использовали также жидкостный хроматограф Waters Acquity UPLC (США) с обращено-фазовой колонкой BEH C18 1,7
1 2 3
О
0 0 О 0
? о
Рис.1. Схема хроматограммы спиртового извлечения травы мягковолосника водного.
Система растворителей: хлороформ: спирт (3:1).
1 2 з
о
о
о
о
о
о
um 2,1х50 mm; УФ-детектором (Photodiode Array Extended Lambda Detectors). Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,03 % ТФУ с использованием программы градиента; длина волны: 242 нм.
Результаты и их обсуждение Качественное обнаружение экдисте-роидов в траве мягковолосника водного, волдырника японского и в. ягодного провели с использованием ТСХ. Результаты исследований отражены на рисунках 1-4.
1 2 3
О
О
о
о
Рис. 2. То же. Система растворителей: н-бутанол: кислота уксусная : вода (4:1:5; верхний слой).
1 2 3
о
0 0 о о о
о
о
о
О
Рис. 3. Схема хроматограммы спиртового Рис. 4. Схема хроматограммы спиртового
извлечения травы волдырника японского. извлечения травы волдырника ягодного.
Система растворителей: хлороформ: спирт (3:1) Система растворителей: хлороформ : спирт (3:1)
Примечание: 1 - анализируемый экстракт, 2 - экдистерон, 3 - полиподин В.
Из приведенных выше схем хрома- и полиподина В, которые удалось детек-
тограмм следует, что в траве каждого из тировать визуально,
анализируемых растений содержалось не
Дальнейшее изучение экдистероидов
менее 7-8 соединений экдистероидной объектов исследования проводили с ис-
структуры, с преобладанием экдистерона пользованием ВЭЖХ-МС. Результаты
представлены на
рисунках
5-9.
Рис. 5. Хроматограмма спиртового извлечения Мягковолосника водного
Рис. 6. Масс-спектр пика на хроматограмме со временем удерживания 1,48 мин.
Из анализа качественного состава эк-дистероидов следует, что оба вида содержали по несколько экдистероидных соединений, идентификацию мажорных компонентов которых проводили с помощью хроматографии в тонком слое в сравнении с эталонными экдистероидами, полученными в нашей лаборатории, а также в лаборатории гликозидов Института химии растительных веществ (г. Ташкент). Вместе с тем (рис. 5) видно, что добиться чёткого разделения пиков экдистероидных соединений не удалось, так как несколько веществ представлены одним растянутым неровным пиком. В масс-спектре (рис. 6) присутствовал молекулярный ион экдисте-
рона 481,57 m/z. Кроме того, наличие пиков с m/z 445,05; 303,08; 226,03 позволило предположить, что эти пики принадлежали продуктам распада экдистерона, полипо-дина В, интегристерона А, экдизона и др., а пики с m/z 519,82; 562, 76; 595,68; 651,58; 726,00; 813,70 дали основание полагать, что они соответствуют гликозилирован-ным или этерифицированным формам эк-дистероидов.
В другом случае, идентификация мажорных экдистероидов нами предпринята с помощью ВЭЖХ при сопоставлении с временем удерживания эталонных веществ - экдистерона и полиподина В (рис. 7-9).
SAMPLE 2 Myosoton aquaticum.
Навеска травы 1.0528 г. Влажность 3.335 %. Объём элюата 20 мл. Содержание экдистерона - 0,019 %. Содержание полиподина В - 0,049 %.
Retention Time (min)
No. Name tR Peak : Area (Y units mrea Percent Asymmetry Resolutio
1 Ecdysterone 6.231 20265.840 2.804 1.069 0.840
2 Polypodine B 6.551 49380.074 6.832 0.924 1.155
SAMPLE 3 Ecdysterone 0.004 мг в 4 мл MeOH
No. Name tR Peak Area (Y units Area Percent Asymmetry Resolution Plate Number
1 unknown 1.086 2070.193 0.097 1.033 3.805 4958.460
2 unknown 1.353 3709.888 0.175 1.405 25.589 4756.152
3 Ecdysterone 6.273 2047416.000 96.420 0.947 5.755 6721.409
4 unknown 8.226 29157.697 1.373 1.007 28.066 7792.162
5 unknown 14.446 41082.941 1.935 1.060 672236.563
SAMPLE 4 Polypodine B 0.0015 мг в 1 мл MeOH
No. Name ГО <D Q_ 9= Area (Y units mrea Percent Asymmetry Resolution Plate Nui
1 unknown 1.085 3614.734 0.116 1.190 4.215 6043.7
2 unknown 1.358 3406.249 0.110 0.938 9.405 5405.1
3 unknown 2.258 4954.642 0.159 1.047 15.147 5907.7
4 unknown 4.425 1834.627 0.059 0.989 2.015 11023.:
5 unknown 4.931 4440.231 0.143 1.000 0.477 3478.8
6 unknown 5.071 7925.210 0.255 0.751 4.941 6456.2
7 Polypodine B 6.478 2941715.750 94.609 1.011 3.398 6683.0
8 unknown 7.645 15595.992 0.502 0.993 26.067 6837.9
Концентрации этих соединений в спиртовом экстракте мягковолосника водного нами рассчитаны известным образом по площадям пиков.
Следует отметить, что состав экди-стероидов травы волдырника ягодного и в. японского (рис. 3 и 4) если не в полной мере идентичен, то довольно близок.
Выводы
1. В результате проведенных исследований установлено наличие разнообразного набора экдистероидов с доминированием экдистероида и полиподина В в траве мягковолосника водного (Myosoton aquaticum (Ъ.) Моепск) и волдырника японского (Cucubalus ]аротсш (Miq.) Worosch.).
2. Богатый состав природных соединений, представленный сахарами, заменимыми и незаменимыми аминокислотами, флавоноидами, макро-, микро- и ультрамикроэлементами, а также экдисте-роидами указывает на реальные предпосылки использования травы мягковолос-ника и волдырника в качестве сырья для разработки и создания новых лекарственных препаратов со специфическими фармакологическими свойствами.
Литература
1. Дармограй В.Н. Экдистероиды некоторых видов растений семейства гвоздичных / В.Н. Дармограй // Ресурсо-ведческое и фармакогностическое изучение лекарственной флоры СССР: науч. тр. ВНИИФ. - М., 1987. - Т. 25. -С. 111-114.
2. Дармограй В.Н. Экдистероиды волдырника ягодного (СисиЬа1ш baccifer Ъ.) / В.Н. Дармограй, Н.С. Фурса, С.В. Дармограй // Успехи современного естествознания. - 2006. - № 5. - С. 95-98.
3. Дармограй С.В. Изучение элементного состава, свободных и связанных сахаров травы волдырника ягодного и мяг-коволосника водного / С.В. Дармограй,
Н.С. Фурса // Рос. медико-биол. вестн. им. акад. И.П. Павлова. - 2010. - № 1.
- С. 148-155.
4. Дармограй С.В. Определение экологической чистоты, заменимых и незаменимых аминокислот в траве волдырника и мягковолосника / С.В. Дармо-
грай, Н.С. Фурса // Рос. медико-биол. вестн. им. акад. И.П. Павлова. - 2008.
- № 4. - С. 130-136.
5. Зибарева Л.Н. Скрининг видов семейства Caryophyllaceae на присутствие фитоэкдистероидов / Л.Н. Зибарева, Л.Дайнен, В.И. Ерёмина // Раст. ресурсы. - 2007. - Т. 43, вып. 4. - С. 66-74.
6. Растительные ресурсы СССР: Цветко-
вые растения, их химический состав, использование. Семейства
Magnoliaceae-Limoniaceae / под ред. Ал.А. Федорова. - Л.: Наука, 1985. - Т.
I. - 460 с.
7. Флора Восточной Европы / под ред. Н.Н. Цвелёва. - М.; СПб., 2004. - Т.
II. - 536 с.
8. Cucubalugenin A, a new triterpenoid from Cucubais baccifer / Y.X. Cheng [et al.] // Fitoterapia. - 2001. - Vol. 72, № 7.
- P. 848-849.
9. Phytoecdysterones from Cucubais baccifer (Caryophyllaceae) / Y.X. Cheng [et al.] // Acta Botanica Sinica. - 2001. -Vol. 43, № 3. - P. 316-318.
10. Crystal structure of cucubaldiol a novel norsesquiterpenoid incorporating a bycyclo-[2.2.2]-octane ring system from Cucubais baccifer (Caryophyllaceae) / Y.X. Cheng [et al.] // Helv. Chin. Acta. -2001. - Vol. 84, № 8. - P. 2343-2346.
11. Cucubalactamand brachystemnin E, two new compounds from Caryophyllaceae / Y.X. Cheng [et al.] // Heterocycles. -2001. - Vol. 55, № 10. - P. 1943-1949.
12. New norsesquiterpenoids from Cucubais baccifer / Y.X. Cheng [et al.] // Planta medica. - 2002. - Vol. 168, № 1. - P. 91-94.
13. Chemical constituents from Cucubais baccifer / Y.X. Cheng [et al.] // Zhongcaoyao. - 2002. - Vol. 33, № 5. -P. 397-398.
14. Screening results of plants for phytoecdysteroids / S. Imai [et al.] // Chem. Pharm. Bull. - 1969. - Vol. 17. -P. 335-339.
15. Yu Q.L. 3-yedroxy-5,7,4'-trimetoxyfla-vone monohydrate from Cucubais baccifer L. / Q.L. Yu, H.Q. Duan, W.Y. Gao // Acta Crystallogr. - 2006. - Vol. 62. - P. 2910-2911.
DISCLOSURE, ANALYSIS AND IDENTIFICATION OF ECDYSTEROIDS IN MYOSOTON AQUATICUM AND CUCUBALUS JAPONICUS
S. V. Darmogray, N.S. Fursa, N.S. Erofeeva
By means of TLS of Myosoton aquaticum (L.) Moench. and Cucubalus japonicus L. herb ethanolic extracts a diverse assortment of ecdysteroids was revealed and their dominant components were identified with ecdysterones and polypodin B by the comparison with certainly known standards and HPLC-MS.
Key words: myagkovolosnik water, voldyrnik Japanese, ecdysteroids.
Дармограй С.В. - ассист. кафедры фармакогнозии с курсом ботаники ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России.
E-mail: [email protected].
