CC BY
39
*
Материалы IV Всероссийского Конгресса эндокринолфгрр
Обмен гликозаминогликанов и активность лизосомальных ферментов у больных с диабетической нефропатией
И.А. Бондарь1, В.В. Климентов',
Г.А. Пауль2, А.Б. Пупышев1, С.М. Амбросова-'
Новосибирская государственная медицинская академия', Новосибирский государственный областной клинический диагностический центр2
I
аиабетическая нефропатия (ДН) является ведущей причиной смерти больных сахарным диабетом (СД) типа 1 и третьей по частоте , е сердечно-сосудистых осложнений и опухолей) у больных СД типа 2 [4]. Доказано, что ведущая роль в формировании ДН принадлежит гипергликемии и связанными с ней метаболическими нарушениями [2]. Среди последних особое внимание привлекают изменения обмена протеоглика-нов — комплексных соединений гликозаминогликанов (ГАГ) И белков. Протеогликаны являются важнейшими биохимическими компонентами мезангия клубочков, базальных мембран и сосудистой стенки; их функциональная роль состоит в обеспечении нормальной структуры и проницаемости почечного фильтра, создании отрицательного заряда эндотелия, регуляции роста гладкомышечных клеток сосудов [14).
При СД нарушен синтез ГАГ в клубочках почек [10, 27], изменен нормальный состав ГАГ и проте-огликанов в базальных мембранах и сосудистой стенке [11, 16, 25]. Механизмы развития этих изменений и их взаимосвязь с развитием нефропатии окончательно не ясны. Данные, полученные на культурах клубочковых клеток, позволяют предполагать, что причиной изменений экспрессии про-теогликанов при СД являются гипергликемия [17] и накопление поздних продуктов гликации [5]. Не изучена роль ферментов, осуществляющих катаболизм протеогликанов — лизосомальных протеаз и гликозидаз при СД.
В данной работе мы исследовали обмен протеогликанов у больных СД типа 1 с разными стадиями нефропатии, используя косвенный неинвазивный метод, основанный на определении количества и фракционного состава сульфатированных ГАГ, экс-кретируемых с мочой. Цель работы состояла в изучении взаимосвязи экскреции ГАГ с качеством гли-кемического контроля, стадией ДН и активностью вовлеченных в катаболизм протеогликанов лизосомальных ферментов.
Объем и методы исследования
Обследовано 46 больных СД 1 типа, 25 мужчин и 21 женщина в возрасте от 16 до 50 лет (30,3+1,7 г), с длительностью заболевания от 2 мес до 28 лет (9,4±1,4 года). В состоянии декомпенсации углеводного обмена находились 40 человек. Больные, получали ГАГ-содержащие (гепарины, сулодексид), антиокси-дантные и лизосомотропные препараты.
В зависимости от наличия и выраженности ДН больные распределены на 3 группы: в 1-ю вошли больные с нормальной экскрецией белка с мочой, во 2-ю — пациенты с микроальбуминурией или протеинурией до 0,3 г/сут, в 3-ю — больные с клинически выраженной ДН (табл. 1). Контрольную группу составили 25 здоровых лиц (13 мужчин и 12 женщин) в возрасте от 15 до 50 лет.
Таблица 1
Клинико-лабораторная характеристика больных (М±т)
Показатель Группы больных
1 -я (п= 1 4) 2-я (п=20) сч т С С£ СО
Пол, мужчины/ женщины 8/6 9/1 1 8/4
Возраст, годы 30,7+4,4 32,4+2,2 30,7+3,2
Длительность СД, годы 7,1+3,3 8,9+1,6 1 5,1 +2,2**
НЬА 1с, % 11,3+1,2 11,8+0,7 11,7+1,2
Гликемия среднесуточная, ммоль/л 9,6+0,7 10,3+0,6 11,1+0,8
Креатинин крови, мкмоль/л 68,7+2,5 64,6+2,8 88,8+9,4*,**
Скорость клубочковой фильтрации, мл/мин 117,5+9,8 115,2+5,7 100,1+9,3
Антиген фактора Виллебранда в плазме крови, % 109,3+5,9 133,4+3,3* 137,7+6,2*
Примечание: звездочки - достоверные (р<0,05) различия: одна - с 1-й группой больных, две - со 2-й.
Комплекс обследования включал определение гликемии глю-козоксидазным методом, НЬА, хроматографическим методом с помощью наборов «Диабет-Тест» АО «Фосфосорб» (Россия)1 ; клубочковой фильтрации и канальцевой реабсорбции по клиренсу эн-
Диапазон нормальных показателей при определнии данным методом
4,2-8%
догенного креатинина, протеинурии с сульфосалициловой кислотой (трехкратно). У больных без явной протеинурии исследовали альбуминурию иммунохимическим полуколичественным методом с помощью тест-полосок «Микраль-Тест-П» фирмы «Boehringer Mannheim» (Австрия). Для верификации повреждения сосудистого эндотелия определяли коцентрацию антигена фактора Виллеб-ранда в плазме венозной крови ELISA-методом с использованием наборов «ASSERACHROM vWF» той же фирмы.
Экскрецию суммарных сульфатированных ГАГ определяли в утренней порции мочи с помощью раствора алцианового синего 8 GX по методу E. W Gold. (1981) в разработанной нами модификации [3]. Результат приводили к величине экскретируемого креатинина и выражали в мг ГАГ на 1 ммоль креатинина. Фракционный состав ГАГ исследовали методом электрофоретического разделения на ацетат-целлюлезных мембранах в 0,1 М барий-ацетатном буфере (рН=4,8) по С. A Pennock. (1976). У 12 человек исследование уровня ГАГ проводили дважды.
Определение активности лизосомальных ферментов: N-ацетил-ß-D-глюкозаминидазы и ß-галактозидазы в сыворотке крови проводили спектрофотометрическим методом по Barret A. L. (1972). В качестве субстратов использовали 4-нитрофенил-р-0-глюкозами-нид и 4-нитрофенил^-0-галактопиранозид соответственно.
Статистическая обработка проведена с использованием стандартных методов вариационной статистики с помощью пакета анализа Microsoft Exei. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента (с поправкой Бонферрони для множественных сравнений).
Результаты и их обсуждение
Исследование показало, что у больных СД в сравнении с контролем в среднем в 2,5 раза увеличена суммарная экскреция сульфатированных ГАГ с мочой (5,90±0,38 и 2,32±0,19 мг/ммоль креатинина соответственно, р<0,001). Этот показатель в 87% случаев превышал верхнюю границу доверительного интервала в контроле (1,39-3,25 мг/ммоль). Отмечена тенденция к возрастанию экскреции ГАГ по мере увеличения выраженности нефропатии. Наибольшие значения зафиксированы у больных с клинически явной ДН (рис. 1), что согласуется с другими данными [15, 18]. Обнаружена слабая корреляция между показателями экскрециеи ГАГ, уровнем гликогемоглобина (г=0,34, р<0,05) и среднесуточной гликемией (г=0,31, р<0,05). Исследование содержания ГАГ, проведенное с трехнедельным интервалом, показало, что краткосрочное улучшение компенсации углеводного обмена сопровождалось некоторым снижением ГАГ-урии, однако различия показателей не достигали статистической значимости (р>0,05).
Известно, что ГАГ — гетерогенная группа веществ, различающихся по структуре, локализации и функциям. В почках присутствуют 3 вида сульфатированных ГАГ: гепарансульфат, хондроитинсульфат и дерматансульфат. Гепарансульфат является одним из основных компонентов гломерулярной базальной мембраны, а хондроитинсульфат и дерматансульфат локализованы в мезангиальном матриксе. Синтез ГАГ и проте-огликанов в почечном клубочке осуществляют эпителиальные и мезангиальные клетки [21, 22].
7
ь
5
4
3
2
I
о
Контроль 1-я 2-я
Группы обследованных
Рис. 1. Экскреция с мочой сульфатированных ГАГ
(мг/ммоль креатинина) у больных СД 1 типа с различными стадиями ДН.
* - достоверное (р<0,001) различие с контролем; различия между группами больных недостоверны (р>0,05).
Для ответа на вопрос, какой вид ГАГ вносит наибольший вклад в увеличение их суммарной экскреции при СД, нами изучен фракционный состав ГАГ мочи у больных и лиц контрольной группы. У здоровых лиц основным компонентом ГАГ являлся хондроитинсульфат (рис. 2). У 6 из 25 лиц контрольной группы (24%) присутствовал также гепарансульфат в качестве минорной фракции. Дерматансульфат и кератансульфат не выявлены ни в одном случае, что, очевидно, объясняется их крайне низкой (ниже порога чувствительности метода) концентрацией в моче здоровых людей. Состав и соотношение фракций ГАГ у большинства пациентов с нормальной экскрецией белка с мочой существенно не менялись. Во всех случаях основным компонентом оставался хондроитинсульфат. Гепарансульфат присутствовал у 4 человек (28,6%), причем у 2 — в концентрации, близкой к концентрации хондроитинсульфата.
Хондроитин сульфат Гспаран сульфат Дерматан сульфат
Контроль 1-я 2-я 3-я
Группы обследованных
Рис. 2. Частота ро) выявления различных фракций ГА1 в моче у здоровых людей и у больных СД 1 типа с различными стадиями ДН.
Иная картина обнаружена у больных с начинающейся нефропатией. Появление микроальбуминурии связано со значительным увеличением экскреции ге-парансульфата. Он присутствовал в моче у 18 (90%) больных, у 11 человек (55%) становился мажорной фракцией, его экскреция приближалась к таковой хондроитинсульфата или даже превышала ее. При выраженной ДН гепарансульфат выявлен в 11 случаях из 12, у 7 больных в качестве основной фракции. Кроме того, мы обнаружили экскрецию значительного количества дерматансульфата у 5 (25%) пациентов с микроальбуминурией и у 4 (33,3%) больных с ДН.
Таким образом, увеличение концентрации ГАГ в моче у больных СД с нормоальбуминурией определяется гиперэкскрецией хондроитинсульфата, а у пациентов с микро- и макроальбуминурией — других видов ГАГ: гепарансульфата и реже дерматансульфата. Это согласуется с данными об изменении содержания этих ГАГ в различных структурах почек при СД. Индукция СД приводит к накоплению в почках животных хондроитин- и дерматансульфата [6|. Хондроитинсуль-фат-содержащие протеогликаны откладываются в субэндотелии в зонах утолщения базальной мембраны и повреждения эндотелиальной выстилки клубочковых капилляров [19]. Встраивание хондроитинсульфата в состав базальной мембраны клубочков обнаружено у больных с ДН [9]. Предполагается их роль в развитии протеинурии и гломерулосклероза.
Как свидетельствуют наши данные, у больных СД с микро- и макроальбуминурией наибольшие изменения претерпевает экскреция гепарансульфата, повышенная концентрация его в моче закономерно обнаруживается при поражениях почек, протекающих с протеинурией [13, 20]. Известно, что ге-парансульфат-содержащие протеогликаны являются основным полианионным компонентом базальной мембраны клубочков, который определяет ее отрицательный заряд и препятствует прохождению через почечный фильтр отрицательно заряженных молекул, в том числе альбумина. Поэтому снижение содержания гепарансульфата в составе гломерулярной мембраны приводит к повышению экскреции с мочой альбуминов и других белков. Дефицит гепарансульфата может способствовать пролиферации ме-зангиальных клеток и формированию микротромбов, ускоряя развитие гломерулосклероза [7]. Значение дефицита гепарансульфата доказывается тем, что содержащие его препараты (как и близкий по структуре гепарин) оказывают при ДН отчетливый антипротеинурический эффект [2, 14].
Пониженное содержание гепарансульфата в наружном и внутреннем тонком слое гломерулярной базальной мембраны при ДН обнаружено в ряде исследований [8, 23, 25]. Интересно, что количество гепарансульфата редуцировано не только в базальной мембране клубочков, но и в базальных мембранах других органов [24, 26]. Причиной может быть снижение
интенсивности биосинтеза гепарансульфата, которое наблюдается при гипергликемии [17]. Возможно также, что при СД синтезируется аномальный гепарансульфат, измененные физико-химические свойства которого затрудняют взаимодействие с другими молекулами и встраивание в состав базальных мембран. О наличии качественных аномалий биосинтеза свидетельствуют структурные изменения полисахаридных цепей гепарансульфата в почках больных диабетом [8]. Возможно, что потеря гепарансульфата является следствием повышенного распада протеогликановых комплексов базальных мембран. В пользу последнего предположения свидетельствует обнаруженное нами высокое содержание гепарансульфата, а также других видов ГАГ в моче больных СД с нефропатией. Триггером катаболизма протеогликанов и других гликопротеидов может быть повышенный уровень лизосо-мальных ферментов в кровотоке при СД [28].
В данной работе была изучена сывороточная активность двух кислых лизосомальных гликозидаз: М-аце-тил-р-О-глюкозаминидазы и р-галактозидазы, вовле-чененных в катаболизм ГАГ. Активность ферментов оказалась значительно выше у больных СД (в среднем в 1,8 и 1,7 раза; 1107+62 и 1,61+0,12 нмоль/мл/ч соот-
Ч-ацетил-р-Гї-піюкочам и нила ю
Р-галакпшиша
Контроль 1-я 2-я 3-я
Группы обследованных
Рис. 3. Активность лизосомальных гликозидаз (нмоль/мл/ч) в сыворотке крови у больных СД 1 типа с различными стадиями ДН.
Звездочки - достоверное (р<0/05) различие: одна - с контролем, две - с контролем и 1-й группой больных.
1600 1400 1200 1000 800 600 400 200
о
Контроль
1-я 2-я
Группы обследованных
48 і
ветственно, р<0,01). Ранее нами установлено, что при СД активность данных энзимов меняется разнонаправленно в сыворотке и лейкоцитах крови: повышается в сыворотке и снижается в клетках [1]. В связи с этим возрастание активности лизосомальных гликози-даз в кровотоке при СД можно объяснить частично лабилизацией мембран лизосом и выходом ферментов в цитозоль и кровеносное русло. Как видно на рис. 3, активность энзимов возрастала по мере утяжеления нефропатии и была наибольшей у больных с клинически явной ДН. Взаимосвязь ферментемии с развитием ДН подтверждают положительные корреляции активности энзимов с суточной протеинурией и уровнем мочевины и негативные — со скоростью клубочковой фильтрации (табл. 2). Обнаружена прямая взаимосвязь между активностью ферментов и концентрацией в плазме крови антигена фактора Виллебранда — маркера эндотелиального повреждения, уровень которого был повышен у больных с начинающейся и явной нефропатией (см. табл. 1).
В определенных условиях лизосомальные ферменты способны проявлять литическую активность внеклеточно [12]; допустимо предположить, что лизосомальные гликозидазы, в избытке циркулирующие в крови при СД, могут включаться в катаболизм протеогликанов эндотелия и базальных мембран и являться «медиаторами» в развитии сосудистых осложнений, в частности, нефропатии. Косвенно в пользу этого предположения свидетельствуют положительные корреляции между показателями экскре-циеи ГАГ и активностью 1Ч-ацетил-р-0-глюкозами-нидазы (г=0,46, р<0,05) и р-галактозидазы (г=0,41, р<0,05), обнаруженные нами у больных с ДН. Взаи-
мосвязь обмена протеогликанов с изменениями активности катаболических ферментов заслуживает дальнейших исследований. С учетом полученных данных представляется перспективным изучение влияния мембраностабилизирующих, лизосомотроп-ных и антиоксидантных препаратов на обмен протеогликанов и развитие нефропатии при СД.
Таким образом, формирование ДН сопровождается изменениями обмена протеогликанов. Фракционный состав ГАГ мочи изменяется на ранних (доклинических) стадиях ДН и характеризуется увеличением доли гепарансульфата и (реже) дерматансульфата в составе экскретируемых фракций. Исследование экскреции ГАГ с мочой может быть дополнительным тестом в ранней диагностике нефропатии. Полученные данные являются патогенетическим обоснованием для включения в комплекс лечения ДН препаратов ГАГ (сулодексид и гепарины).
Таблица 2
Корреляции сывороточной активности лизосомальных ферментов с другими биохимическими параметрами у больных СД
Показатель М-ацетил-ß-D- глюкозаминидаза ß-галактозидаза
Протеинурия 0,45* 0,53*
Мочевина сыворотки 0,41* 0,3*
Скорость клубочковой фильтрации -0,41 * -0,22
Антиген фактора Виллебранда 0,43* 0,53*
НЬА1 с 0,09 0,07
Гликемия среднесуточная 0,03 -0,08
Примечание: * - р<0,05.
Литература
1. Бондарь И. А., Пупышев А. Б., Климонтов В. В. // Пробл. эндокринол.
- 2000. - № 5. - С. 3-6.
2. Дедов И. И., Шестакова М. В. Диабетическая нефропатия. - М., 2000.
3. Пауль Г. А., Русова Т. В. // Клин. лаб. диагностика. - 1995. - No 2. -С. 13-14.
4. Шестакова М. В. // Материалы IV Всеросийского Конгресса эндокринологов. - С.-Пб., 2001. - С. 237.
5. Borrebak J., Prydz К., Fjeldstod К. et а1. // Diabetologia. - 2001. - Vol. 44, N 4. - P. 488-494.
6. Cadaval R., Kohlman O., Michelacci Y. // Glycobiology. - 2000. - Vol. 10, N 2. - P. 185-192.
7. Davies М., Kastner S., Thomas G. J. // Kidney Int. - 1996. - Vol. 49, Suppl. 54. - P. S55-S60.
8. Edge A. S. B., Spiro R. G. // Diabetologia. _ 2000. - Vol. 43, N 8. - P. 1056-1059.
9. Goode N. P., Shires М., Crellin D. M. et al. // Diabetologia. - 1995. -Vol. 38, N 12. - P. 1455-1465.
10. Hadad S. J., Michelacci Y. М., Schor N. // Biochim. Biophys. Acta. -1996. - Vol. 21, N 1. - P. 18-28.
1 1. Heickendorff L., Leden Т., Rasmussen L. M. // Diabetologia. - 1994. -Vol. 37, N 3. - P. 286-292.
12. Holtzman E. Lysosomes. - 2-d Ed. - New York, London, 1989.
1 3. Jadresic L. P., Filler G., Barratt Т. M. // Kidney Int. - 1991,- Vol. 40, N 2. - P. 280-284.
14. Jensen T. // Diabetes. - 1997. - Vol. 46, Suppl. 2. - P. S98-S100.
15. Kahaly G., Hansen C., Otto E. et al. // Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes.
- 1997.-Vol. 105, N3. - P. 145-151.
1 6. Karasawa R., Nishi S., Suzuki Y. et al. // Nephron. - 1997. - Vol. 76,
N 1. - P. 62-71.
17. Kasinath B. S. //Arch. Biochem. Biophys. - 1995-Vol. 318, N 2. - P. 286-294.
1 8. McAuliffe A. V., Fisher E. J., McLennan S. V. et al. // Diabet. Med. -
1996. - Vol. 13, N 8. - P. 758-763.
1 9. McCarthy K. .J, Abrahamson D. R., Bynum K. R. et al. // Kidney Int. -2000. - Vol. 58, N 6. - P. 2592-2593.
20. Stefanidis I., Heintz B., Stocker G. et al. // J. Am. Soc. Nephrol. -1996. - Vol. 7, N 12. - P. 2670-2676.
21. Thomas G. J., Jenner L., Mason R. M., Davies M. // Arch. Biochem.
Biophys. - 1990. - Vol. 278, N 1. - P. 11 -20.
22. Thomas G. J., Mason R. M., Davies M. // Biochem. J. - 1991. - Vol.
277, Pt. 1. - P. 81-88.
23. van den Born J., van Kraats A. A., Bakker M. A. et al. // Diabetologia.
- 1995. - Vol. 38, N 10. - P. 1169-1175.
24. van der Pijl J. W., Daha M. R., van den Born J. et al. // Diabetologia. -
1998. - Vol. 41, N 7. - P. 791-798.
25. Vernier R. L., Steffes M. W., Sisson-Ross S., Mauer S. M. // Kidney Int. -1992. - Vol. 41, N 4. - P. 1070-1080.
26. Yokoyama H., Hoyer P. E.; Hansen P. M. et al. // Diabetes. - 1997 -Vol. 46, N 11. - P. 1875-1880.
27. Yokoyama H., Sato K., Okudaira M. et al. // Kidney Int. - 1999. - Vol. 56, N 2. - P. 650-658.
28. Waters P. J., Flynn M. D., Corall R. J. M., Pennock C. A..// Diabetologia.
- 1992. - Vol. 35, N 10. - P 991-995. '
49
