CC BY
53
УДК 582.717:57.082.261
03.00.00 Биологические науки
ОБ ОСОБЕННОСТЯХ НАЧАЛЬНОГО ЭТАПА КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ БАДАНА ТОЛСТОЛИСТНОГО (BERGENIA CRASSIFOLIA L.) IN VITRO В ЯКУТИИ
Дарханова Валентина Гаврильевна научный сотрудник, SPIN - код: 1643-9942 e-mail: darhana@mail.ru ФГБУНИнститут биологических проблем криолитозоны СО РАН, Россия, 677980, Якутск, пр. Ленина, 41
Строева Наталья Семеновна
научный сотрудник, SPIN - код: 8391-7960
e-mail: natali.stroeva.62@mail.ru
ФГБУН Институт биологических проблем
криолитозоны СО РАН, Россия, 677980, Якутск,
пр. Ленина, 41
Барашкова Наталья Владимировна
д.с-х.н., г.н.с., SPIN - код: 5657-2879
e-mail: BNW-07@yandex.ru
ФГБУН Институт биологических проблем
криолитозоны СО РАН, Россия, 677980, Якутск,
пр. Ленина, 41
Наряду с традиционными способами сохранения растений ex situ все большее значение приобретает использование биотехнологических методов. Данная работа посвящена разработке и совершенствованию методов культуры изолированных тканей и органов редкого вида камнеломковых (Saxifragaceae) - бадана толстолистного Bergenia crassifolia (L.) для использования в системе сохранения и воспроизводства растительных ресурсов. В результате проведенных исследований были получены растения - регенеранты из семян бадана толстолистного. Впервые в условиях Якутии проводятся сохранение и размножение бадана толстолистного методом in vitro
Ключевые слова: БАДАН ТОЛСТОЛИСТНЫЙ, BERGENIA CRASSIFOLIA, КУЛЬТУРА IN VITRO, ЭКСПЛАНТ, ФИТОГОРМОНЫ, МЕХАНОАКТИВИРОВАННЫЕ ВЕЩЕСТВА ХВОИ ПИХТЫ
Doi: 10.21515/1990-4665-121-050
UDC 582.717:57.082.261 Biological sciences
SPECIAL ASPECTS OF THE INITIAL STAGE OF BERGENIA CRASSIFOLIA L. CLONAL MICROREPRODUCTION IN VITRO IN YAKUTIA
Darkhanova Valentina Gavrilyevna researcher, RSCI SPIN-code: 1643-9942 e-mail: darhana@mail.ru
FGBUN Institute for biological problems of cryolithozone SB RAS, Russia, 677980 Yakutsk, 41 Lenin av.
Stroeva Natalya Semenovna researcher, RSCI SPIN-code: 8391-7960 e-mail: natali.stroeva.62@mail.ru FGBUN Institute for biological problems of cryolithozone SB RAS, Russia, 677980 Yakutsk, 41 Lenin av.
Barashkova Natalia Vladimirovna
Dr.Sci.Agr, head researcher, SPIN-code: 5657-2879
e-mail: BNW-07@yandex.ru
FGBUN Institute for biological problems of
cryolithozone SB RAS, Russia, 677980 Yakutsk, 41
Lenin av.
Along with traditional ways, the biotechnological methods become more significant in contribution to plant conservation in situ. The work is dedicated to elaboration and advancement of the method of isolated tissues and organs culture for conservation and reproduction of the badan, Bergenia crassifolia L., the rare species of Saxifrgaceae family. The conducted study yielded the regenerated plants of B. crassifolia from seeds. For the first time, we have performed conservation and reproduction of B. crassifolia in vitro under conditions of Yakutia
Keywords: BADAN, BERGENIA CRASSIFOLIA, IN VITRO CULTURE, EXPLANT, PHYTOHORMONES, MECHANICALLY ACTIVATED SUBSTANCES OF ABIES NEEDLES
Введение
Bergenia crassifolia (L.) Tritsch. бадан толстолистный - многолетнее растение семейства камнеломковых - Saxifragaceae.
Бадан толстолистный распространен на юге Сибири, Монголии и в Северном Китае в лесном и альпийском поясах на высоте до 2000 м над уровнем моря. В Якутии проходит северо-восточная граница ареала. Встречается в бассейне р. Алдана на горных затененных склонах, на каменистых осыпях и в трещинах скал. Редкий вид, внесен в «Красную книгу Республики Саха (Якутия)» (2000) [1] имеет статус IV категории редкости. Размножается семенами и корневищами. Корневище мясистое, с многочисленными корневыми мочками, сильно разветвленное, ползучее. Семена до 2 мм длиной, многочисленные, гладкие, продолговатые, гранистые, черные. Cемена созревают в июле-начале августа.
В Европе бадан очень неприхотлив в культуре, и его часто выращивают как декоративное растение в садах, парках и, как лекарственное, на плантациях. Как лекарственное сырье используют корневища, которые заготавливают осенью или ранней весной. При сборе необходимо оставлять 10-15% растений и часть корневищ для восстановления популяции [2]. В условиях культуры слабоустойчив, не самовозобновляется и поражается вредителями, размножение семенами несколько затруднено, сеянцы развиваются медленно [3]. Впервые в условиях Якутии изучаются особенности морфогенеза in vitro бадана толстолистного для массового размножения и ускорения интродукции.
Целью данной работы является клональное микроразмножение бадана толстолистного методом in vitro для получения и использования в интродукции и реинтродукции в условиях криолитозоны.
Материал и методы В качестве первоначальных эксплантов служили семена бадана толстолистного Bergenia crassifolia (L.), произрастающего в коллекционном питомнике Ботанического сада ИБПК СО РАН. Исходные образцы растений бадана толстолистного были собраны в 1963 г. на побережье оз. Байкал (Иркутская обл.) [4].
При разработке метода клонального микроразмножения растений за основу были взяты этапы размножения, предложенные Н.В. Катаевой и В. А. Аветисовым [5]. Работа в асептических условиях, приготовление и стерилизация питательных сред была проведена согласно рекомендациям Р.Г. Бутенко, Ф.Л. Калининым и др. [6,7].
В качестве первичного экспланта использовали семена бадана толстолистного Bergenia crassifolia (L.). Семена стерилизовали мыльным раствором в течение 30 минут, затем промывали проточной и дистиллированной водой. Следующий этап исследований проводили в ламинар-боксе в стерильных условиях. В качестве дезинфицирующих средств использовали 0,1 % раствор сулемы, 70%-ный раствор этанола. В ходе эксперимента установлен оптимальный режим стерилизации семян бадана толстолистного с учетом плотности семенной кожуры. Влияние различных режимов стерилизации на получение жизнеспособных, менее инфицированных семян удалось достичь при использовании комбинации дезинфицирующих растворов - последовательном выдерживании семян в 0,1% раствор сулемы (в течение 15 мин), 70%-ный раствор этанола (в течение 5 мин). Для проращивания семян бадана толстолистного в условиях in vitro использовали безгормональную питательную среду Гамборга В5 с половинным составом 1/2В5. Семена растений помещали в коническую колбу объемом 150 мл (рис.1).
Растения культивировали при 16 часовом фотопериоде с люминесцентным освещением 1-3тыс.лк., при комнатной температуре до 260С и при относительной влажности воздуха 70%. Всходы растений бадана толстолистного Bergenia crassifolia (L.) появились через 2 недели. Проростки без признаков угнетения роста, полученные из семян растений бадана, являются благоприятным материалом для введения в культуру.
Рис. 1. Асептические семена бадана на среде 1/2В5
Для дальнейшего микроразмножения бадана в качестве эксплантов использовали непосредственно конус нарастания (апекс), который вновь дезинфицировали 0,1% раствором сулемы в течение 3 минут и промывали автоклавированной дистиллированной водой.
Для стимулирования регенерационных процессов использовали фитогормоны: 6 - бензиламинопурина (БАП) в концентрации 0,5 - 1 мг/л; нафтилуксусной кислоты (НУК) в концентрации 0,5 - 1 мг/л с использованием питательной среды Гамборга В5. Также применили высокоэффективный нетоксичный регулятор роста антистрессового действия нового типа (нанобиокомпозит), полученный в Институте химии твердого тела и механохимии СО РАН методом механохимической обработки растительного сырья [8, 9]. Препарат представляет порошковую композицию, действующим началом которой являются тритерпеновые кислоты [10, 11].
Навеску механоактивированного вещества хвои пихты (МПН) в концентрации 100 мг/л добавляли в горячие агаризованные питательные
среды и после тщательного перемешивания среды разливали в колбы с последующим автоклавированием в обычном режиме.
Результаты работы
Морфогенез высшего растения - это определенная материальная структура, созданная под влиянием условий внешней среды с наследственно закрепленными признаками посредством сложных физиологических взаимодействий между органами, тканями, клетками, разделенными в пространстве и времени [12].
При изучении особенности морфогенеза бадана толстолистного Bergenia crassifolia (L.) in vitro как редких и исчезающих видов растений флоры Якутии установлено, что практически на всех разработанных питательных средах добавлением фитогормонов наблюдалась регенерация растений бадана (табл.).
Таблица
Характеристика роста и развития регенерантов бадана толстолистного в зависимости от типа питательной среды (период инкубации 30 дней)
Показатель морфогенеза Питательные среды
1/2В5 1/2В5+БАП0,5 мг/л+НУК0,5 1мг/л 1/2В5+БАП1 мг/л+НУК 1 мг/л 1/2В5 + МПН 100 мг/л
Количество эксплантов, шт. 20 20 20 20
Частота развития, % 90 85 85 100
Среднее число листьев на эксплант, шт. 7 5 4 8
Высота экспланта, см 2,52 1,62 0,97 2,74
Частота ризогенеза, % 100 92 87 100
Среднее число корней на эксплант, шт. 3 4 2 4
Длина корней, см 0,87 1,03 0,53 1,92
Исследования показали, что действие стимуляторов роста на корнеобразование и рост листа растений бадана зависит не только от способности их к укоренению, но и от целого ряда других условий (интенсивность света, продолжительность дня, температура и т.д.). Следует отметить, что при увеличении концентрации фитогормонов как НУК, так и БАП до 1 мг/л снижается развитие корневой системы и рост листа растений бадана.
Наиболее эффективной средой по всем параметрам (увеличение частоты и ускорение образования корней и листьев) при культивировании бадана является питательная среда Гамборга 1/2В5 с добавлением МПН в концентрации 100 мг/л. Под действием МПН частота ризогенеза бадана толстолистного повысилась до 100% и способствовала дальнейшему росту и развитию растений (рис. 2). При этом число листьев на экспланте бадана достигало до 8 штук и число корней до 4 штук со средней диной 1, 98 см и с высотой экспланта до 2,74 см.
Рис. 2. Укоренившиеся растения бадана толстолистного перед высадкой в почву (среда Гамборга В5 +МПН100 мг/л)
Наиболее ответственным моментом при клональном микроразмножении любой культуры является перенос растений в
нестерильные условия, т.е. высадка их в почвенный субстрат. Разработанная питательная среда Гамборга В5+МПН100 мг/л позволяет стимулировать активность роста и развития корневой системы и листьев бадана толстолистного Bergenia crassifolia (L.). Подросшие растения-регенеранты бадана с хорошо развитой корневой системой пересаживали в почвенный субстрат (рис.3). В качестве субстрата использовали смесь: торф, песок и дерновая земля в соотношении (1:1:2). Растения высаживали в стаканчики с емкостью 0,2 л. Именно на данном этапе отмечается наибольший процент гибели пробирочных растений. Адаптацию растений-регенерантов бадана проводили при комнатной температуре t=25°C, освещенности 3 тыс. лк. и влажности воздуха 70%. Для регуляции влажности воздуха использовали пищевую пленку с постепенным ее перфорированием. Выход адаптированных растений составил 50-70%.
Рис. 3. Адаптация растения-регенеранта в почвенной среде.
Выводы
В процессе проведения исследований установили, что в качестве первоначальных эксплантов необходимо использовать стерильные семена бадана толстолистного Bergenia crassifolia (L.). Для дальнейшего микроразмножения in vitro используются асептические проростки.
Наиболее интенсивный рост растений бадана происходит в весенне-летний период в питательной среде Гамборга 1/2В5 с добавлением МПН в концентрациях 100 мг/л и сахарозы 40 мг/л. Полученные данные свидетельствуют о перспективности применения метода микроклонального размножения редких и исчезающих видов растений, в том числе бадана толстолистного Bergenia crassifolia (L.).
Работа выполнена в рамках НИР VI.52.1.11. «Разнообразие растительного мира таежной зоны Якутии: структура, динамика, сохранение» № госрегистрации 01201282190.
Список литературы
1. Красная книга Республики Саха (Якутия). Т. 1. Редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды растений и грибов / Мин-во охраны природы РС (Я), Департамент биологических ресурсов. Якутск: НИПК «Сахаполиграфиздат», 2000. 256 с.
2. Атлас лекарственных растений. М.: Изд-во мед. Лит.. 1962. 702 с.
3. Атлас ареалов и ресурсов лекарственных растений СССР/ Отв. Ред. Зайко Л.Н., Шрегер А.И. М.: ГУГК, 1980. 340 с.
4. Кадастр интродуцентов Якутии. Растения природной флоры Якутии / Н.С. Данилова, С.З. Борисова, А.Ю. Романова и др. М.: МАИК «Наука/Интерпериодика». 2001. 167 с.
5. Катаева Н.В., Аветисов В.А. «Клональное размножение в культуре ткани». Культура клеток растений. М.: Наука, 1981. С. 137-149.
6. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. - М: Наука, 1964. 272 с.
7. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев:Наукова думка. 1980. 320 с
8. Oleg Lomovsky, Kirill Korolyov, Young Soon Kwon // Proceedings of the 7-th Russian-Korean International Symposium on Science and Technology "K0RUS-2003", Ulsan, Republic of Korea, 2003. Vol. 1.
9. Королев К.Г., Ломовский О.И., Рожанская О.А., Васильев В.Г. // Химия природных соединений [K.G. Korolev, O.I. Lomovskii, O.A. Rozhanskaya, V.G. Vasil'ev //Chem. Natural compounds], 2003. 39:4.
10. Шевцов С.А. Тритерпеноиды из видов Abies. V: Строение и спектральные свойства
основных 9ß-ланостановых кислот хвои пихты сибирской / С.А. Шевцов, В.А. Ралдугин
// Химия природ. соед. 1988. № 3. С. 364-371.
11. Патент № 2244426. МПК A01N65/00, A61K35/78, C07C51/41. Препарат, содержащий водрастворимые соли тритерпеноых кислот и способ его получения. Ломовский О.И., Королев К.Г.; заявитель и патентообладатель Институт химии
твердого тела и механохимии СО РАН (ИХТТМ СО РАН) (RU). № 2003125160/15. Заявлено 11.08.2003. Опубл.: 20.01.2005, БИ № 2.
12. Рожанская О.А. Соя и нут в Сибири: культура тканей, сомаклоны, мутанты. Новосибирск: юпитер, 2005. 155с
Reference list
1. Krasnaja kniga Respubliki Saha (Jakutija). T. 1. Redkie i nahodjashhiesja pod ugrozoj ischeznovenija vidy rastenij i gribov / Min-vo ohrany prirody RS (Ja), Departament biologicheskih resursov. Jakutsk: NIPK «Sahapoligrafizdat», 2000. 256 s.
2. Atlas lekarstvennyh rastenij. M.: Izd-vo med. Lit.. 1962. 702 s.
3. Atlas arealov i resursov lekarstvennyh rastenij SSSR/ Otv. Red. Zajko L.N., Shreger A.I. M.: GUGK, 1980. 340 s.
4. Kadastr introducentov Jakutii. Rastenija prirodnoj flory Jakutii / N.S. Danilova, S.Z. Borisova, A.Ju. Romanova i dr. M.: MAIK «Nauka/Interperiodika». 2001. 167 s.
5. Kataeva N.V., Avetisov V.A. «Klonal'noe razmnozhenie v kul'ture tkani». Kul'tura kletok rastenij. M.: Nauka, 1981. S. 137-149.
6. Butenko R.G. Kul'tura izolirovannyh tkanej i fiziologija morfogeneza rastenij. - M: Nauka, 1964. 272 s.
7. Kalinin F.L., Sarnackaja V.V., Polishhuk V.E. Metody kul'tury tkanej v fiziologii i biohimii rastenij. Kiev:Naukova dumka. 1980. 320 s
8. Oleg Lomovsky, Kirill Korolyov, Young Soon Kwon // Proceedings of the 7-th Russian-Korean International Symposium on Science and Technology "K0RUS-2003", Ulsan, Republic of Korea, 2003. Vol. 1.
9. Korolev K.G., Lomovskij O.I., Rozhanskaja O.A., Vasil'ev V.G. // Himija prirodnyh soedinenij [K.G. Korolev, O.I. Lomovskii, O.A. Rozhanskaya, V.G. Vasil'ev //Chem. Natural compounds], 2003. 39:4.
10. Shevcov S.A. Triterpenoidy iz vidov Abies. V: Stroenie i spektral'nye svojstva
osnovnyh 9ß-lanostanovyh kislot hvoi pihty sibirskoj / S.A. Shevcov, V.A. Raldugin
// Himija prirod. soed. 1988. № 3. S. 364-371.
11. Patent № 2244426. MPK A01N65/00, A61K35/78, C07C51/41. Preparat, soderzhashhij vodrastvorimye soli triterpenoyh kislot i sposob ego poluchenija. Lomovskij O.I., Korolev K.G.; zajavitel' i patentoobladatel' Institut himii tverdogo tela i mehanohimii SO RAN (IHTTM SO RAN) (RU). № 2003125160/15. Zajavleno 11.08.2003. Opubl.: 20.01.2005, BI № 2.
12. Rozhanskaja O.A. Soja i nut v Sibiri: kul'tura tkanej, somaklony, mutanty. Novosibirsk: jupiter, 2005. 155s
