CC BY
96
экспериментальные исследования в медицине и Биологии
УДК 615:616-056.22:001.18
Б.т. Беличковский
об экспресс-методе прогнозирования возможного патологического влияния наночастиц на организм
Российский государственный медицинский университет (Москва)
В связи с активным развитием, производства и применения наноматериалов появилась новая актуальная, задача — определение потенциального вреда наночастиц для. здоровья, человека. Подобный вред, по-видимому, возможен. В эксперименте на животных установлен высокий уровень задержки наночастиц в легких, а также способность проникать через аэрогематический барьер в ткани организма. При. введении в кровь они преодолевают, гематоэнцефалический барьер и. откладываются в мозгу. В модельных клеточных опытах наночастицы, особой формы. — фулероны — могут, повреждать молекулу ДНК — «расплести», разрезать.
Ключевые слова: наночастицы, оценка безопасности, хемилюминисценция
about express-method of pRoGNosiNG the possiBLE pATHoLoGicAL iNFLUENCE oF NANO-PARTiCLES on oRGANIsM
B.T. Velichkovsky
State medical university, Moskow
A new actual problem. — determining the potential harm, of nano-particles to human health, was occurred in the association with, an active development of the production, and using the nano-materials. A similar harm, appears to be possible. A high. level of the nano-particle accumulation, in the lungs as well as the ability to penetrate the aerohematic barrier in the organism, tissues has been revealed, in the experiments using the animals. In administration, into the blood they may overcome the hematoencephalic barrier and deposit in the brain. In the model cellular experiments the nano-particles of a special form — fulerones — may injure the DNA molecule, i.e. «<un.plait», cut it.
Key words: nano-particles, estimation of safety, chemiluminescence
К наноматериалам и наноструктурам относят разнообразные объекты, величина которых хотя бы в одной из трех размерностей меньше 100 нм (1 нанометр — миллиардная доля метра или 10 ангстрем). Они могут быть трехмерными (фулероны, нанокристаллы), двухмерными (нанотрубки) и одномерными (нанопленки).
По происхождению различают два вида наноструктур: природные и искусственные. К природным наноструктурам относятся вирусы малых размеров, молекулы ДНК. Искусственные наноструктуры создаются на основе современных наукоемких технологических процессов.
Крупномасштабное производство наночастиц основано на трех механизмах их образования: конденсации из газовой фазы, осаждения из коллоидного раствора и дезинтеграции твердого вещества.
Кроме полезных нанопродуктов, в ряде производств возникают побочные техногенные наночастицы. Они содержатся в дымах металлургических и химических предприятий, в выхлопных газах бензиновых и дизельных двигателей, в аэрозолях
конденсации, образующихся при газо- и электросварочных работах. К слову сказать, первичные размеры частиц табачного дыма обычных сигарет целиком располагаются в области нановеличин.
Ведущими в характеристике наночастиц являются свойства поверхности. От них зависит их стабильность и реакционная способность, полупроводниковые, магнитные, оптические и механические свойства, а также особенности биологического действия. Трудные проблемы для медицины создают как уникальные свойства, так и значительное разнообразие наночастиц.
В настоящее время наиболее широкое практическое применение имеют три их группы. В количественном отношении пальма первенства принадлежит, по-видимому, углеродным наночастицам.
Самая известная из них — фулерон. Это молекула углерода, состоящая из 60 атомов. По виду она похожа на футбольный мяч, сшитый из правильных многоугольников (рис.1).
Другая многочисленная разновидность — нанотрубки из правильных углеродных шестиуголь-
ников с соотношением длины к диаметру больше 3:1. Ту и другую разновидность углеродных наноструктур отличает механическая прочность, превышающая прочность стали, химическая инертность, электропроводность, каркасное (полое) строение с толщиной стенки в одну молекулу.
рис. 1. Фулерон.
Вторую группу, имеющую широкое коммерческое применение, составляют наночастицы оксидов металлов, преимущественно ТЮ2, ZnO, А1203. Они обладают каталитическими, полупроводниковыми и другими уникальными свойствами и используются в микроэлектронике, энергетике, химической промышленности.
Третью группу составляют композиционные наноматериалы, не содержащие ни углерод, ни металлы. Типичным представителем этой группы является многотоннажный технический продукт — аэросил, представляющий собой аэрозоль конденсации диоксида кремния, получаемый при сжигания SiCl4, либо кремнийорганических мономеров в контролируемой среде. Наночастицы аэросила имеют удельную поверхность 175 — 380 м2/г, средний эквивалентный диаметр 0,02 — 0,01 мкм (20—10 ангстрем) и отличаются значительной монодисперсностью: диаметр всех его частиц укладывается в диапазон 0,005 — 0,05 мкм (5 — 50 ангстрем). Аэросил используется как наполнитель в производстве особо прочных резиновых шин, как загуститель при получении машинного масла, а также в пищевой, фармацевтической и парфюмернокосметической промышленности.
Чрезвычайно высокая поверхностная энергия наночастиц обуславливает их почти мгновенную коагуляцию в воздухе рабочей зоны и образование крупных оседающих хлопьев. Наглядно воздушную коагуляцию наночастиц демонстрирует процесс возникновения табачного дыма, благодаря которому он и становится виден.
Для наночастиц весовой метод определения их содержания в воздухе непригоден. Любые варианты счетного метода также недостаточно информативны. Для характеристики экспозиции наночастиц в воздухе рабочей зоны наиболее приемлемой и доступной в настоящее время, по-видимому, можно
признать двухэтапную комбинацию определения весовой концентрации респирабельной фракции пыли с последующим определением суммарной поверхности отобранной пылевой навески методом адсорбции азота или другого инертного газа по БЭТ. В результате рассчитываются величины удельной поверхности витающих наночастиц на конкретном рабочем месте. Именно по этому показателю — величине удельной поверхности витающей пыли — и следует нормировать предельно допустимую концентрацию наночастиц в воздухе рабочей зоны.
В дальнейшем перспективными, вероятно, могут стать устройства прямого определения суммарной поверхности наночастиц, основанные на высокой адсорбционной способности их поверхности. Например, может быть использовано изменение стандартной концентрации светящегося газообразного эталонного вещества при прохождении через измерительную кювету прибора воздушного потока с наночастицами.
Президиум РАМН среди 5 наиболее актуальных направлений изучения нанотехнологий выделил исследования:
1) фундаментальных аспектов взаимодействия наночастиц с клеточными и субклеточными структурами организма;
2) проблемы безопасности при разработке и использовании нанотехнологий и наноматериалов.
С 1 декабря 2007 года введены в действие методические рекомендации по «Оценке безопасности наноматериалов», утвержденные руководителем Роспотребнадзора, главным санитарным врачом РФ, академиком РАМН Г.Г. Онищенко. Методические рекомендации разработаны с целью обеспечения единого научно-обоснованного подхода к оценке безопасности наноматериалов на этапах разработки, экспертизы и государственной регистрации подобной продукции.
В них для изучения взаимодействия наночастиц с биологическими макромолекулами и клеточными мембранами и для выяснения возможности проникновения через биологические барьеры рекомендованы следующие 13 методов:
— атомно-силовая микроскопия;
— сканирующая и просвечивающая электронная микроскопия;
— светооптическая флуоресцентная микроскопия;
— светооптическая конфокальная микроскопия;
— спектрометрия деполяризации флуоресценции;
— спектрометрия кругового дихроизма;
— спектрофлуориметрия;
— ЯМР-спектроскопия;
— ЭПР-спектрометрия;
— масс-спектрометрия;
— метод радиоактивных индикаторов;
— аналитическое ультрацентрифугирование;
— жидкостная хроматография высокого разрешения.
У большинства медицинских организаций профилактической направленности нет подобного оснащения, отсутствуют специалисты, умеющие эксплуатировать перечисленные приборы. Поэтому пока необходимо опираться на накопленные ранее данные и те методы исследования, которыми они в свое время были получены. Такие сведения в методических рекомендациях, к сожалению, отсутствуют. К тому же по своей структуре они ориентированы в основном на оценку наноматериалов, попадающих в организм рег os.
Для предварительной характеристики особенностей биологического влияния наночастиц на организм следует получить представление о том, каков механизм взаимодействия их поверхности с окружающей средой. Химия поверхности твердых тел вообще представляет собой одну из важнейших проблем естествознания и техники.
В ходе эволюции легкие приспособились к борьбе с возбудителями инфекции дыхательных путей и в меньшей степени оказались подготовленными к воздействию неорганических микрочастиц. При контакте возбудителя инфекции, иммунного комплекса или пылевой частицы с мембраной фагоцита так интенсивно повышается уровень потребления кислорода, что это явление получило название «дыхательного взрыва». Например, при активации макрофагов частицами кварца потре-
бление кислорода увеличивается в 4 раза, частицами угольной пыли или диоксида титана — в 1,5 раза. Практически весь дополнительно поглощенный кислород не используется ни на энергетические, ни на пластические нужды клетки.
Особая ферментная система фагоцитов, встроенная во внешнюю клеточную мембрану, НАDP•Н-оксидаза изменяет электронную структуру молекулы кислорода, превращая его в главное оружие бактерицидной защиты клетки — активные формы кислорода (АФК), а состояние длительного избыточного образования АФК — «окислительным стрессом».
В бактерицидной защите органов дыхания принимает участие и оксид азота. N0 — газ, обладающий свойствами свободного радикала, благодаря непарному электрону на внешней орбитали молекулы. Оксид азота синтезируется фагоцитами из аминокислоты аргинина ферментом N0-синтазой.
Таким образом, первичный ответ организма на действие нерастворимых частиц стереотипен и заключается в мобилизации неспецифических бактерицидных систем фагоцитов.
Об интенсивности этого процесса можно судить по уровню люминолзависимой хемилюминесцен-ции (ХЛ) фагоцитов. Принципиальная схема метода показана на рис. 3. Суспензия одних макрофагов дает лишь слабое спонтанное свечение, а взвесь корпускулярных частиц обычно не вызывает его со-
гипохлорит
ОСІ-
каталаза, пероксидаза
рис. 2. Одноэлектронный путь восстановления кислорода в организме.
Люминомегр
рис. 3. Хемолюминесцентное определение способности наночастиц активировать макрофаги.
всем. При контакте же таких частиц с макрофагами наблюдается развитие ХЛ, отражающее динамику образования свободных радикалов кислорода.
Основываясь на опыте изучения биологического действия различных субмикроскопических аэрозолей конденсации можно выделить пять типов биологически значимых межмолекулярных взаимодействий поверхности наночастицы с мембраной фагоцита.
К первой группе относятся наночастицы симметричного внутреннего строения, для которых контакт поверхности с окружающей средой обусловлен самым слабым универсальным неспецифическим межмолекулярным взаимодействием, вызываемым флуктуациями электронов в пограничном слое частицы. К этой группе относятся углеродные наночастицы с абсолютно однородной чистой поверхностью. Электростатическое взаимодействие наночастиц с клеточной мембраной обуславливает физиологичный тип активации фагоцитов. Он характеризуется постепенным нарастанием, низким уровнем и медленным затуханием хемилюминес-центного свечения клеток. Фагоцитоз подобных частиц обуславливает «гипертрофический» механизм гибели кониофага. Клетка, поглощающая большое количество таких частиц, длительное время остается жизнеспособной, подвижной и увеличивается в объеме. Происходит типичная «рабочая» гипертрофия кониофага на внутриклеточном уровне. Гипертрофированные кониофаги, естественно, нуждаются в потреблении повышенного количества кислорода. Однако с увеличением размеров клетки отношение площади её поверхности к объему прогрессивно снижается, поскольку масса клетки возрастает пропорционально кубу, а поверхность
— пропорционально квадрату линейных размеров. Поэтому в расчете на единицу массы потребление кислорода уменьшается, нарушается режим работы митохондрий, и в конце концов клетка погибает. В медицине труда указанный сценарий наблюдается при воздействии низкоцитотоксичной пыли алмаза, кристаллического кремния, эльбора и др.
На примере углеродных наночастиц наиболее наглядно прослеживается биологическое значение наноразмерности. Материал, характеризующийся электростатическим типом взаимодействия своей поверхности с мембраной фагоцитов, обладает высокой совместимостью с тканями организма, не вызывает ни воспаления, ни отторжения. Поэтому из углеродистых наноматериалов прессуются в наиболее легкие, прочные и долговечные протезы искусственных суставов, костей, зубов. Пока они дороги, но со временем станут более доступными и, по-видимому, наиболее востребованными. Однако в связи с наноразмерами эти углеродистые материалы проникают и накапливаются не только в протоплазме клетки, но и в её ядре, вызывая патологические изменения ДНК и, значит, становясь потенциальными канцерогенами.
Все современные технологии получения углеродных нанотрубок требуют применения металлических катализаторов, следы которых загрязняют
их поверхность. В состав катализаторов чаще всего входят Со, №, Бе и их сочетания. Наночастицы, содержащие в пограничном слое катионы таких металлов-аллергенов, как никель и кобальт, составляют вторую группу биологически значимых взаимодействиий. Ионы металлов-аллергенов способны покидать поверхность частиц и переходить в тканевую жидкость. Там они связываются с белковыми молекулами и, в конечном итоге, могут вызвать аллергическую реакцию. В обыденной жизни типичным примером подобного действия являются аэрозоли полиметаллических руд, обуславливающие возникновение особой формы пневмокониоза с гиперреактивными проявлениями.
Наночастицы, содержащие в пограничном слое ионы железа или других переходных металлов, составляют третью биологически значимую группу. Когда наночастицы содержат в пограничном слое ионы переходных металлов, то на таких каталитических центрах поверхности происходит вторичная трансформация бактерицидных продуктов, образованных активированными фагоцитами. При этом возникает наиболее агрессивный из всех свободных радикалов — гидроксильный радикал ОН •, который запускает цепную реакцию перекисного окисления липидов клеточных мембран и может вызвать окислительное повреждение молекул РНК и ДНК. В традиционных производствах подобным механизмом биологического действия обладают волокнистые пылевые частицы асбеста, содержащие в пограничном слое катионы железа. Все разновидности асбестовых волокон в той или иной степени являются канцерогенами.
Четвертую группу составляют наночастицы с гидратированной поверхностью, обладающей способностью к специфическим электростатическим взаимодействиям, ориентированным в пространстве за счет образования водородных связей (А-ОН-В). Классическим образцом вещества с подобной поверхностью служит кремнезем. Кварцевая пыль даже в вакууме в считанные минуты адсорбирует остаточные молекулы воды, образуя состоящую из силанольных групп ^-ОН) гидрок-силированную поверхность. Такая поверхность, покрытая силанольными группами, обуславливает химическую инертность и устойчивость кремнезема в обычных условиях земной атмосферы, но она же обуславливает его высокую фиброгенность и невысокую, но уже доказанную канцерогенность.
Последнюю группу составляют наночастицы, поверхность которых способна к межмолекулярным взаимодействиям за счет электростатического связывания, обусловленного неравномерным распределением электронной плотности на поверхности излома, создающим неориентированный в пространстве суммарный эффективный заряд частицы. Чем выше дзета-потенциал такой частицы, тем больше ее способность активировать фагоциты. Подобным действием обладает фиброгенная пыль, не содержащая свободного диоксида кремния.
Таким образом, потенциально опасным воздействием на организм обладают все пять групп. Главная
особенность заключается в том, что наноразмерность повышает цитотоксичность частиц. В основе подобной реакции лежит механизм активации фагоцитов, главным образом, макрофагов и дендритных клеток. Для активации указанных клеточных элементов необходим одновременный многоточечный контакт частиц с поверхностью клетки. Это условие и обеспечивают наноразмеры частиц. Если дело идет об аэрозолях, то химический состав, по-видимому, отступают на второй план. Литейную лихорадку, как известно, вызывает дым не только оксида цинка, но и других металлов и даже полимерных частиц.
Все наночастицы должны рассматриваться как потенциальные канцерогены. Менее вероятно их фиброгенное влияние, так как раньше, чем в ткани, накопится необходимое «пылевое депо», проявится их повышенная цитотоксичность. Об этом свидетельствуют экспериментальные исследования с аэ-росилом. Интратрахеальное введение стандартной 50-миллиграмовой дозы этого наиболее высокодисперсного конденсата диоксида кремния вызывает быструю гибель всех подопытных крыс. Введение в четыре раза меньшей дозы приводит к развитию только клеточно-пылевых узелков, которые исчезают через две недели по мере растворения и выведения из легких остатков наночастиц, оставляя после себя расширенные деформированные ацинусы с разрушенными альвеолярными стенками.
Поэтому более ожидаемо развитие в органах дыхания патологического процесса, подобного эмфиземе. В основе подобных изменений лежит деструкция легочной ткани, обусловленная действием свободных радикалов, генерируемых активированными фагоцитами. Такой процесс подобен профессиональному экзогенному фи-брозирующему альвеолиту, впервые описанному Н.К. Вознесенским у плавильщиков бронзовых сплавов, подвергающихся воздействию дыма оксида цинка на протяжении 10—15 лет. Он опасен развитием гипоксимии и легочно-сердечной недостаточности.
В настоящее время доказано, что саркоидоз, характеризующийся формированием макрофа-гальных гранулем в лимфатических узлах, легких, сердце и других тканях, могут вызывать зернистые формы микобактерий туберкулеза. Они, как и другие L-формы микробов, по размерам относятся к наноматериалам. Но неизвестна хемилюминес-центная характеристика свойств поверхности подобных форм микробов, поэтому нельзя сопоставить их со свойствами поверхности неорганических наночастиц и высказать мнение о вероятности провоцирования подобных изменений.
Несмотря на высокую биологическую активность наноматериалов, ни в коем случае не следует преувеличивать их потенциальную опасность.
В связи с тем, что огромная удельная поверхность наночастиц обуславливает их практически мгновенную коагуляцию в воздухе рабочей зоны и достаточно быстрое оседание в виде хлопьев, возникновение опасных концентраций наноматериалов представляется маловероятным. Об этом свидетельствует, в частности, опыт нашей лаборатории, исследовавшей опасность развития профессиональной патологии у рабочих французской корпорации SNECMA MOTEURS. Рабочие, занятые на армировании сопел ракет и вентиляционных лопаток турбореактивных двигателей, жаловались на воспаление слизистой глаз и раздражение кожных покровов. В связи с высокой кратностью воздухообмена в производственных помещениях запыленность воздуха весовым методом практически не определялась. У дирекции возникло подозрение о наличии в углеродистых нановолокнах каких-то неизвестных аллергенов. Исследования показали, что всё дело в высоком модуле упругости указанных волокон, превышающем прочность стали. Попадая на слизистую глаз, такая мельчайшая острая частица, не видимая не только глазом, но и аппаратурой окулиста, чисто механически ранит её и вызывает травматическое воспаление. Снабжение рабочих соответствующей спецодеждой полностью ликвидировало все жалобы и объективные изменения.
Для предприятий, производящих и использующих наночастицы любого состава и происхождения как и для производств, характеризующихся поступлением в воздух рабочей зоны высокодисперсных аэрозолей конденсации оксидов металлов, общеобменная вентиляция малоэффективна. Более рациональна местная вытяжная вентиляция в виде индивидуального бортового отсоса со скоростью всасывания 3,0 — 3,5 м/сек и сдува, отклоняющего от лица рабочего поток образующихся аэрозолей и увлекающего его в сторону воздухоприемника.
Наиболее быстрым, информативным и относительно дешевым способом выявления характера биологического воздействия наночастиц является хемилюминесцентный метод исследования. Хеми-люминометры выпускаются отечественными приборостроительными фирмами и стоят несравненно дешевле приборов, рекомендуемых Роспотребнадзором. Информация об отечественных хемилю-миниметрах имеется в Интернете. Все варианты хемилюминесцентного исследования нерастворимых микрочастиц тщательно разработаны и опубликованы, в частности, в методическом пособии «Методы определения влияния фиброгенной пыли на организм в эксперименте и клинике» (2003). Поэтому хемилюминесцентный метод следует дополнительно внести в перечень приборов, указанных в методических рекомендациях Роспотребнадзора «Оценка безопасности наноматериалов».
сведения об авторах
ВеличковскийБорис Тихонович, д.м.н., профессор, академик РАМН, Российский государственный медицинский университет, г. Москва; e-mail: borisvel@comtv.ru
