CC BY
14
ВЕСТНИК МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ 17. ПОЧВОВЕДЕНИЕ. 2023. Т. 78. № 2 LOMONOSOV SOIL SCIENCE JOURNAL. 2023. Vol. 78. No. 2
УДК 631.4
DOI: 10.55959/MSU0137-0944-17-2023-78-2-94-105
О ВЫБОРЕ ИНДИКАЦИОННЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ДЛЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО НОРМИРОВАНИЯ НЕФТЕПРОДУКТОВ В КАШТАНОВЫХ ПОЧВАХ
Е. И. Ковалева*, С. Я. Трофимов, С. А. Шоба
МГУ имени М.В. Ломоносова, факультет почвоведения, 119991, Россия, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 * E-mail: katekov@mail.ru
В условиях модельного эксперимента изучен отклик микробного сообщества почв на разный уровень нефтяного загрязнения по показателям: базальное дыхание (БД), углерод микробной биомассы (Смик), потенциальная денитрификация (ДНФ), метаногенез, активность каталазы. Почвы представлены светло-каштановой (Haplic Kastanozems Sodic) и лугово-каштановой (Gleyic Kastanozems Chromic) сухостепной зоны Ставропольского края, различающимися степенью гумусированности, засоленности и содержанием физической глины. Внесение сырой нефти через 30 сут. увеличивало интенсивность дыхания и вызывало рост Смик за счет активизации нефтеокисляющих микроорганизмов в анаэробных зонах почв. ДНФ изменялась в С-К и Л-К почвах разнонаправленно, что, вероятно, связано с разной степенью гумусированности почв и их засоленностью. Каталазная активность была чувствительным показателем для нормирования НП в С-К почве, но засоление было определяющим фактором в ее активности в Л-К почве. Биотестирование с использованием малощетинковых червей Eisenia fétida показало неспособность тест-объектов к выживанию в почвах каштанового ряда. Значимым индикатором, не зависящим от природных факторов в почвах каштанового ряда, является БД и связанные с ним показатели субстрат-индуцированного дыхания (СИД), Смик. Каталазная активность и ДНФ имеют ограничения по фактору засоления.
Ключевые слова: нефть, почвы сухостепного ряда, активность дыхания, ферментативная активность, экологические нормативы, функции почв.
Введение
Процессы урбанизации, растущая потребность в энергии за счет ископаемых энергоресурсов оказывают влияние на состояние экосистем, приводя к ухудшению их функционирования и деградации, в первую очередь почвенного покрова. Увеличение нефтедобычи привело к нарастающему загрязнению почв, увеличению площадей загрязненных земель. Это обосновало необходимость разработки соответствующих технологий ремедиации загрязненных земель и экологических нормативов, при достижении которых восстанавливается функционирование экосистем. Экологическое нормирование установлено в рамках Федерального закона «Об охране окружающей среды»; для оценки уровня загрязненности почв нефтепродуктами (Приказ 574) устанавливается допустимое остаточное содержание нефти в почве (ДОСНП) — определенное по аттестованным в установленном порядке методикам содержание в почве нефти и продуктов ее трансформации после проведения рекультивационных и иных восстановительных работ, при котором: исключается возможность поступления нефти и продуктов ее трансформации в сопредельные среды и на сопредельные территории, допускается вовлече-
ние земельных участков в хозяйственный оборот по основному целевому назначению. Нормативы ДОСНП предназначены для оценки эффективности рекультивационных работ.
В этом аспекте важным остается вопрос разработки оценочного аппарата, включающего набор чувствительных показателей для оценки качества почвы и принятия решений в области эколого-экономической политики. До настоящего времени отсутствуют единые указания по выбору чувствительных показателей для нормирования нефтеза-грязнения в почвах с учетом их характеристик и свойств.
В данной работе сделана попытка выбора информативных индикационных показателей для оценки функционирования почв каштанового ряда с разным уровнем засоления и нефтезагрязнения (в модельном эксперименте).
Объекты и методы исследования
Объекты исследования. Исследовались каштановые почвы засушливой зоны юго-восточной части Ставропольского края, в Терско-Кумской низменности: Haplic Kastanozems Sodic светло-каштановые (С-К) и Gleyic Kastanozems Chromic лугово-каштановые слабозасоленные (Л-К) [Клас-
Таблица 1
Содержание НП в почвах после внесения сырой нефти, г^кг"1
Почва Вариант
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Доза внесения нефти, г-кг-1 0 0,5 1 2 3 5 7 9 10 20
Светло-каштановая Haplic Kastanozems Chromic Содержание НП через 30 дней после внесения нефти, г-кг-1
0,21 0,40 0,81 1,50 2,46 3,80 5,40 6,80 8,00 16,80
Доза внесения нефти, г-кг-1 0 0,5 1 2 3 5 7 - 10 20
Лугово-каштановая Gleyic Kastanozems Chromic Содержание НП через 30 дней после внесения нефти, г-кг-1
0,16 0,58 1,03 1,55 2,36 4,30 5,80 - 7,30 15,34
сификации почв, 1977; WRB, 2015]. Пробы почв отбирались на не загрязненных нефтью земельных участках площадью 10x10 м2 методом конверта с глубины 0-20 см.
Дизайн эксперимента. Для оценки изменения отдельных свойств почв в условиях нефтяного загрязнения проводился модельный эксперимент в лабораторных условиях. В эксперименте использована сырая нефть, добываемая в Ставропольском крае. В почвы вносили дозы сырой нефти (от 1,0 до 30,0 г-кг-1), основываясь на экспертном заключении об их возможной сорбционной способности к нефтепродуктам (НП) с учетом содержания влаги в почве. Почвы инкубировали при температуре 25±1°C, влажности почв 25% в течение 30 дней. Схема эксперимента с почвами представлена в табл. 1. Вариант 1 является контрольным, без внесения нефти в почву.
Методы исследования. Химические методы. В исходных образцах почв определяли гранулометрический состав [ГОСТ 12536-2014], pHH2O [ГОСТ 26423-85], содержание органического вещества почвы бихроматным методом [ГОСТ 26213-91], подвижный Р2О5 [ГОСТ 26205-91], обменный К2О [ГОСТ 26205-91], азот аммония и нитратов [ГОСТ Р 53219-2008]; обменные Na [ГОСТ 26950-86], Ca, Mg [ГОСТ 26487-85]; катионный состав в водном экстракте: НСО3, Cl, SO4 [РД 52.18.572-96], Ca, Mg, [ГОСТ 26428-85], Na, плотный осадок [ГОСТ 2642385], содержание нефтепродуктов [ПНДФ 16.1:2.2.2298]. Состав образца нефти исследован ГХ-МС с использованием системы, состоящей из газового хроматографа Agilent 7890В и квадрупольного масс-спектрометрического детектора 5977 А.
Биологические методы. Из биоиндикационных функциональных и структурно-функциональных показателей определяли активность дыхания, потенциальную денитрификацию (ДНФ), метано-генез. Активность каталазы оценивали газометрическим методом [Galstian, 1974] и выражали в мл 02-г-1-мин-1. Параметры почвенного дыхания (микробное базальное дыхание (БД), субстрат-индуцированное дыхание (СИД)) определяли в соответствии с Андерсоном и Домшем [Ander-
son, Domsch, 1978]. Углерод микробной биомассы рассчитывали по формуле: Смик (мкг-г-1 почвы) СИД (мкг-г-1 почвы час-1) х 40,04 + 0,37. Удельную активность дыхания (микробный коэффициент) qCO2 (мкгС02-Смг-1 Смик-ч-1) рассчитывали как отношение БД/Смик [Anderson, Domsch, 1985].
Определение потенциальной активности дени-трификаторов проводилось с добавлением глюкозы. Анализ газа (закиси азота) выполнен на газовом хроматографе «Кристалл-2000» с детектором электронного захвата. Потенциальная активность метаногенов определена кинетическим методом по выделению газообразного метана в инкубируемых закрытых сосудах [Степанов, Лысак, 2002].
Тестирование на почвенной мезофауне проведено с использованием малощетинковых червей из семейства дождевых — Eisenia fetida; в качестве контроля использовали искусственную почву (на сухую массу, 105°С): 10% сфагнового мха (pH 5,5-6,0, без видимых растительных остатков, тонко растертый и сухой); 20% каолиновой глины (с содержанием каолинита около 30%); 0,3-1,0% карбоната кальция (СаСО3, пудра, аналитической чистоты) для доведения исходного pH почвы до 6,0±0,5; 70% воздушно-сухого кварцевого песка (тонкий песок с более 50% частиц размером 50-200 мкм), а также исходную не загрязненную НП почву.
Статистическая обработка результатов. Эксперименты проводили в 3-5 повторностях с расчетом средних арифметических и стандартных отклонений. Стандартные отклонения и корреляции были рассчитаны с использованием программного пакета STATISTICA версии 8 (Statsoft Inc.). Перед выполнением статистического анализа нормальность данных проверялась с помощью критерия Колмогорова - Смирнова, и преобразование данных применялось в тех случаях, когда они не были распределены нормально. Результаты сравнивались с использованием критерия минимальной значимой разницы Tukey's на уровне вероятности 0,05. Анализ главных компонент (РСА) выполнен в программе XLSTAT by Addinsoft.
Таблица 2
Основные физико-химические характеристики почв
Почвы Почвенные частицы, <0,01 Я & Органическое вещество, % + H Z Z о1 Z Z d РТ о Плотный остаток 1 й О ад о о H О 1 (Я 1 й о ад
мм ед. рн % мг^кг-1 % обменные почвы, ммоль400 г-1 водная вытяжка почвы, ммоль400 г-1
Светло-каштановая Haplic Kastano-zems Chromic 13,13 8,7 0,94 2 28 13 448 0,039 0,1 8,1 0,6 0,02 0,004 0,03 0,10 0,38 0,19
Лугово-каштановая Gleyic Kastano-zems Chromic 56,87 8,7 3,95 3 26 >60 600 0,134 1,5 16,1 3,1 0,04 0,018 0,03 0,90 0,44 0,19
Результаты
Свойства почв. Свойства изученных исходных, не загрязненных НП почв, рассматриваемых в качестве контрольных вариантов в эксперименте, приведены в таблице 2. Уровень содержания гумуса в С-К супесчаной почве очень низкий. Количество подвижного фосфора в почве определено как очень низкое, а содержание обменного калия — как очень высокое. Л-К почва — тяжелосуглинистая, высоко гумусированная; ее обеспеченность подвижным фосфором — средняя, обменным калием — очень высокая. Содержание аммонийного азота в обеих почвах соответствует низкому уровню. Согласно величине плотного остатка С-К почва характеризовалась как незасоленная, тогда как Л-К почва — слабозасоленная, хлоридно-сульфатного типа засоления; тип солености по соотношению катионов: магний-кальциевый.
Характеристика сырой нефти. Характеристика сырой нефти, используемой в эксперименте, представлена на хроматограммах (рис. 1 А, Б). В составе нефтяных фракций преобладает насыщенная — 69,1%, доля ароматической составляет 11,9%, асфальтенов и смол — 19% (табл. 3). В составе насыщенной фракции доминируют алканы с длиной цепи С12-С26.
Биологические показатели. Изменение значений показателей активности дыхания С-К почв приведены на рис. 2. В образце без внесения нефти (контрольный вариант) величина БД составляла 0,06 мкг С-С02-г-ч-1 (рис. 2А). При содержании НП 16,8 г-кг-1 БД превышало фоновые значения в 12 раз. СИД в образцах почв также нарастало с повышением концентрации НП в почве (рис. 2Б). Величина qCO2 С-К почвы, не загрязненной НП, составляла 4,44 мкг С-С02-мг-1 Смик-1^ч-1; при содержании НП 16,8 г-кг-1 достоверно отличалась от контрольного варианта в четыре раза.
Потенциальная активность ДНФ в незагрязненной С-К почве составляла 200 нг ^^0-г-1-ч-1
Таблица 3
Содержание алканов в образце сырой нефти
Алкан с, г-кг-1 нефти
С8 1,44
С9 2,05
С10 3,84
С11 11,11
С12 23,22
С13 27,97
С14 32,11
С15 35,28
С16 31,90
С17 35,34
Пристан (Pr) 7,39
С18 30,31
Фитан (Ph) 5,50
С19 29,01
С20 28,44
С21 26,91
С22 25,10
С23 24,11
С24 21,28
С25 21,29
С26 17,81
С27 14,11
С28 8,50
С29 6,85
С30 4,03
С31 2,35
С32 2,23
С33 0,69
IC8-C40+Pr+Ph 480,15
Counts vs Acquisition Time (min)
Рис. 1. Хроматограмма сырой нефти А. Хроматограмма образца насыщенной фракции по полному ионному току, Б. Масс-хроматограмма образца насыщенной фракции по m/z 85 (распределение алканов)
т 50 2 40
¿5 30
20
¿1
4
А Изменение активности дыхания в зависимости от концентраций НП в С-К почве
0.2 0.4 0.8 1.5 2.5 3.8 5.4 6.8 8.0 16.8
Содержание нефтепродуктов в почве, г кг"1
Б Изменение углерода микробной биомассы в зависимости от концентраций НП в С-К почве
г
т
-1 1- 1 и
0.2 0.4 0.8 1.5 2.5 3.8 5.4 6.8 8.0
Содержание нефтепродуктов в почве, г кг-1
В Изменение активности метаногенеза в зависимости от концентраций НП в С-К почве
Г Изменение потенциальной активности денитрификации в зависимости от концентраций НП в С-К почве
Рис. 2. Зависимость активности дыхания и связанных показателей с уровнем содержания НП в светло-каштановых почвах
и резко возрастала (2,3 раза) при содержании НП 16,8 г-кг"1 почвы (рис. 2). Уровень метаногенеза в исследованных образцах почв варьировал в диапазоне от 0,02 до 0,11 нг С-СН^г-Ч-1.
0,21 0,4 1,5 2,5 3,8 5,4 6,8 8 16,8 Содержание нефтепродуктов, гкг-1
Рис. 3. Изменение активности каталазы от содержания НП в вариантах опыта светло-каштановых почв
Изменение активности дыхания Л-К почв приведено на рисунке 4. Величина БД в не загрязненной нефтью почве составила 0,34 С-С02 г-1-ч-1. При содержании 15,4 мг-кг-1 НП в почве БД было в семь раз выше фонового значения. Наблюдалась интенсификация СИД почвы с увеличением содержания НП, достигая максимальных значений в почве при содержании НП 5,38 г-кг-1. Аналогичная тенденция зафиксирована для углерода микробной массы — максимум в почве при концентрации НП 5,38 г-кг-1. Величина qCO2 Л-К почвы, не загрязненной НП, составляла 4,6 мкг С-С02-мг-1 Смик-1^ч-1; с увеличением НП варьировала ненаправленно; при концентрации НП 15,4 г-кг-1 достоверно отличалась от контрольного варианта в 2 раза.
Концентрации НП в почвах достоверно не влияли на процесс метаногенеза (рис. 3В), однако наблюдалась тенденция его увеличения (0,10-0,15 нг С-СН4-г-1-ч-1) при содержании НП до 15 г-кг-1. Уровень ДНФ в образце загрязненной почвы с содержанием НП 15,34 г-кг-1 был наименьшим по сравнению
90
80
70
Ю 60
0
0.16
0.14
0.12
>Т 0.10
0.08
V 0.06
I 0.04
0.02
0.00
16.8
12
10
8
6
4
2
0
о
и
7.30 15.34
Содержание нефтепродуктов, г-кг"1
А Изменение активности дыхания в зависимости от концентраций НП в Л-К почве
1 БД I СИД
0.18 0.16 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02
0.16 0.58 1.03 1.55 2.36 4.30 5.80 7.30
Содержание нефтепродуктов, г-кг"1
Б Изменение углерода микробной биомассы в зависимости от концентраций НП в Л-К почве
з
7
6
5
4
3
2
0
0.20
0.00
В Изменение активности метаногенеза в зависимости Г Изменение потенциальной активности денитрификации
от концентраций НП в Л-К почве в зависимости от концентраций НП в Л-К почве
Рис. 4. Зависимость активности дыхания и связанных показателей с уровнем содержания НП в лугово-каштановых почвах
Таблица 4
Содержание нитратных и аммонийных форм азота (п=3) в светло-каштановой почве с разными концентрациями НП
с другими нефтезагрязненными образцами почв и контрольным вариантом (рис. 3Г). Содержание ка-талазы варьировало от 5,2 до 11,2 мл О2т-1^мин-1, не имея выраженного тренда распределения с увеличением концентрации НП в Л-К почве (рис. 4).
Биотестирование как в С-К, так и Л-К исходных не загрязненных НП образцов почв с использованием Eisenia fetida показало гибель более 50 и 65% тест-объектов соответственно, поэтому результаты тестирования далее не учитывались в оценке уровня загрязнения почв НП.
Обсуждение
Оценка изменений функционирования почв каштанового ряда по биологическим показателям. Активность дыхания. В С-К почвах, так же как и в Л-К почвах, БД возрастало с увеличением содержания НП и свидетельствовало об интенсификации микробной деятельности. Выявлена достоверная корреляция НП с БД (R = 0,99, p<0,05). Первые достоверные изменения БД в С-К почве на-
Содержание НП в почве, ркг-1 Содержание азота
(N-NH„+), мг^кг-1 (N-NO3-), мг^кг-1
0,21 2±1 28±3
0,4 3±1 32±2
1,5 3±1 22±2
2,5 3±1 9±1
3,8 3±1 11±1
5,4 3±1 13±1
6,8 4±1 11±1
8,0 3±1 9±1
16,8 8±1 6±1
0,2 1 1,6 2,4 4,3 5,8 7,3 15,3 Содержание нефтепродуктов, гкг-1
Рис. 5. Изменение активности каталазы в зависимости от содержания НП в вариантах опыта лугово-каштановых почв
блюдались при содержании 0,4 г-кг-1 НП в почвах, при содержании НП 6,8 г-кг-1 БД увеличивалось в 15 раз по сравнению с контрольным образцом. В Л-К почвах изменения БД фиксировались при 0,58 г-кг-1 НП. Установлена достоверная корреляционная связь БД с Смик (для С-К почвы R = 0,65, для Л-К почвы R100 = 0,87, р<0,05). БД достоверно коррелировало с азотом нитратов и аммонийным азотом: в С-К почве как R = -0,89, R = 0,67 соответственно, р<0,05; в Л-К почве как R = -0,84, и R = 0,81 соответственно, р<0,05. С увеличением концентрации НП в почвах уменьшалось содержание азота нитратов (табл. 5), в Л-К почве не так интенсивно, как это наблюдалось в С-К почве с низким уровнем содержания гумуса. Интенсификация процессов азотопо-требления микроорганизмами в почвах в условиях
Таблица 5
Содержание нитратных и аммонийных форм азота в лугово-каштановой почве с разными концентрациями НП
Содержание азота
НП, мг кг-1 (N^4+), (N-N0^),
мг-кг-1 мг-кг-1
0,16 3±1 26±2
0,58 3±1 25±2
1,03 3±1 25±3
1,55 4±1 26±2
2,36 5±1 25±
4,30 4±1 23±3
5,80 4±1 22±3
7,30 4±1 21±3
15,40 4±1 19±3
нефтезагрязнения является доказанным фактом [Эркенова и др., 2016].
СИД в С-К и Л-К почвах увеличивалось с нарастанием в них концентрации НП. В С-К почве наибольшие величины фиксировались при содержании 2,5-3,8 г-кг-1 НП, в Л-К почве — при содержании НП 5,8-7,5 г-кг-1, при которых, очевидно, максимально активизировались нефтеокисляющие микроорганизмы. Это подтверждается наибольшими значениями Смик (рис. 2Б, 4Б). Смик в Л-К почве была в 10 раз выше, чем в С-К, что может быть связано с наибольшей сорбционной способностью Л-К почвы по отношению к НП, обусловленной ее высокой гу-мусированностью и тяжелосуглинистым составом. При концентрации НП в почве 15,34 г-кг-1 значения СИД в Л-К почве возвращались к величинам, характерным для почвы с содержанием НП 4,3 г-кг-1. Смик в С-К и Л-К почвах имела достоверную обратную корреляцию с содержанием азота нитратов ^ = -0,76; R = -0,73 соответственно, р<0,05). Выявлена корреляционная зависимость между НП и Смик для Л-К почвы как R = 0,87; С-К почвы как R = 0,62, р<0,05.
Величина qCO2 возрастала с увеличением содержания НП в обеих изученных почвах, что свидетельствует о нарушении функционирования почвы в условиях нефтезагрязнения и согласуется с литературными данными [Благодатская, Ананьева, 1996]. В изученных почвах нарушения более выражены в С-К почве, нежели в Л-К, что объясняется их разным гранулометрическим составом, содержанием органического вещества, а следовательно, сорбционной способностью и устойчивостью. Подобные наблюдения с существенным увеличением значений qCO2 фиксировались при загрязнении дизельным топливом конструктоземов ^азепеу е! а1., 2013). Установлена достоверная связь qCO2 и НП, БД (С-К почва R=0,66; 0,65 соответственно, р<0,05; Л-К почва R = 0,61; 0,65 соответственно, р<0,05).
Результаты оценки почв с разным уровнем неф-тезагрязнения показали, что БД и связанные с ним оценочные показатели являются достаточно стабильными и информативными.
Потенциальная активность ДНФ и метаноге-нез. В эксперименте со С-К почвами при концентрации НП на уровне 16,8 г-кг-1 активность ДНФ достоверно была выше более чем в 3 раза по сравнению с контролем, что может свидетельствовать о значительном вкладе нитратного дыхания в С-К почвах и согласуется с данными по содержанию азота нитратов в почвах (табл. 4). Интенсификация активности ДНФ в нефтезагрязненных почвах может указывать на формирование анаэробных условий при содержании НП на уровне 16,8 г-кг-1 и изменение в функционировании почв. Слабощелочная реакция, оптимальная температура, недостаток кислорода в условиях нефтезагрязнения благоприятствовали развитию ДНФ, что согласуется с литературными
14
12
х 10
8
6
4
2
0
данными [Умаров и др., 2007]. С.А. Благодатский [2011] описывал ДНФ как анаэробный рост микроорганизмов на растворимых соединениях углерода с использованием окисленных форм азота в качестве акцепторов электронов.
Активность ДНФ в контрольном варианте Л-К почвы достоверно отличалась по величине от контрольного варианта С-К почвы: эмиссия закиси азота была в 5 раз выше, нежели в С-К. Прежде всего различия активности ДНФ в почвах были связаны с высокой гумусированностью Л-К почв по сравнению со С-К (табл. 3), что подтверждается исследованиями авторов [Умаров, 1986]. Кроме того, засоление почв, выявленное в Л-К почве, может влиять на процессы ДНФ, согласно исследованиям О.В. Меняйло (1996), которыми показано, что для широкого ряда засоленных почв закись азота является доминирующим продуктом ДНФ. Автором установлено, что преобладание эмиссии N20 над ее потреблением в засоленных почвах обусловлено ингибированием солями фермента ^О-редуктазы у денитрифицирующих бактерий. В более ранних работах [Кромка и др., 1991] на солончаках впервые было обнаружено явление торможения ДНФ на стадии образования закиси азота (N20). Установлено, что засоление подавляет активность ДНФ ^ео е! а1., 2008] и уменьшает численность денитрифицирующих бактерий [М1ао е! а1., 2015; Guo, 2021]. Вен-Жи Зенг и др. [2013] показано, что степень засоления почвы влияла на скорость ДНФ и имела пороговое значение (ЕС1:5 = 1,13 дС-м-1) (0,05-0,07 мг-л-1). При уровне засоления ниже порогового значения ДНФ нарастала; когда уровень засоления почвы превышал пороговое значение, ДНФ снижалась. Степень засоления в исследованной нами Л-К почве была относительно близкой к пороговой, установленной Вен-Жи Зенг и др. [2013], что также объясняет измеренные величины ДНФ. Анализ главной компоненты в работе Хьюбин и др. [2012] выявил, что содержание обменного натрия является ключевым фактором потенциальной ДНФ наряду с органическим веществом, нитратами и денитрифицирующими бактериями.
Поступление НП в почвы изменяло потенциальную активность ДНФ, но с разной направленностью: в С-К ДНФ увеличивалась, тогда как в Л-К потенциальная активность ДНФ снижалась с увеличением содержания НП (рис. 4Г) с минимальными величинами при содержании НП 15,4 г-кг-1. При низких концентрациях НП (до 1 г-кг-1) активность микроорганизмов в почве достоверно не отличалась от контрольного варианта. Концентрации НП выше 1 г-кг-1 вызывали достоверное изменение процесса дыхания (БД, СИД, ДНФ) по сравнению с незагрязненной НП почвой. С одной стороны, снижение активности ДНФ можно объяснить поступлением НП, интенсификацией деятельности нефтеокисляющих микроорганизмов, что подтверждалось увеличени-
ем Смик (рис. 4Б). Эффективность роста микроорганизмов и доля активной биомассы, как показано С.А. Благодатским [2011], зависят от доступности азота для микроорганизмов. С другой стороны, в Л-К почве обратная закономерность получена для метаногенеза по сравнению с направленностью ДНФ: с увеличением концентрации НП в почве увеличивался метаногенез. Максимальная скорость выделения метана фиксировалась при содержании НП 15,4 г-кг-1 почвы, что могло свидетельствовать о развитии анаэробных условий, протекании процессов биодеструкции нефтяных углеводородов с перестройкой в составе микробиоты. Выявлена корреляционная зависимость содержания НП, БД с ме-таногенезом ^ = 0,87; 0,87 соответственно; р<0,05). Установлена связь метаногенеза с нитратами ^ = 0,72; р<0,05) и ионом аммония ^ = 0,78; р<0,05). Эта зависимость может объясняться окислением метана нитратами, как показано в ряде работ [Raghoe-Ьага^ и др., 2006; Поздняков и др., 2011], а также описана моделью анаэробного окисления метана нитратами ^ауШп, 2019]. Кроме того, как указывали Поздняков и др. [2011], анаэробное окисление метана сопряжено не только с сульфатредукцией, но и ДНФ. Вероятно, вышеперечисленные факты объясняют направленность процессов ДНФ и ме-таногенеза в Л-К почве при нефтяном загрязнении. Различия в ДНФ и метаногенезе в С-К и Л-К почвах связаны с характеристиками почв.
Достоверных изменений в протекании процесса метаногенеза в С-К почвах с увеличением НП не выявлено, однако наблюдались широкие флуктуа-ционные изменения.
Активность каталазы. Активность каталазы, участвующей в расщеплении перекиси водорода, характерна для почв и определяется жизнедеятельностью преимущественно аэробных микроорганизмов [Наплекова, 1983]. Между тем указывалось [Семиколенных, 2001], что разложение перекиси водорода может осуществляться не только ферментом каталазой, но и присутствующими в почвах катализаторами абиотической природы, в том числе органическими соединениями. Мы наблюдали достоверную отрицательную корреляцию между содержанием НП и каталазной активностью = -0,77, р<0,05) в С-К почве, подобно той, которую фиксировали в экспериментах с таежными почвами [Коуа1еуа е! а1., 2021]: активность каталазы закономерно снижалась при увеличении концентрации НП. Показано [Шорина, 2011], что свежее нефтяное загрязнение (1-5%) способствовало увеличению ка-талазной активности в слое черноземов 0-20 см, свидетельствующему о запуске механизмов деток-сикации загрязнителя. В нашем случае низкие концентрации НП (2,5-3,8 г-кг-1) в С-К почвах увеличивали каталазную активность почти на 50% (р<0,05) по сравнению с контрольной почвой. Концентрации НП, равные 8,0 и 16,8 г-кг-1, снижали активность
каталазы в С-К более чем на 30 и 80% соответственно по сравнению с контрольной почвой, что может свидетельствовать о формировании локальных зон с анаэробными условиями в нефтезагрязненных почвах, поскольку активность каталазы коррелирует с метаболической активностью аэробных организмов ^Ыут е! а1., 2004]. Вероятно, различия в характере интенсивности дыхания биоты в условиях нефтезагрязнения были также обусловлены разными характеристиками почв.
Корреляционный анализ не выявил достоверной связи между содержанием НП и активностью каталазы в Л-К почвах. Можно предположить, что в почвах каштанового ряда даже слабое засоление подавляло активность каталазы и данный показатель не являлся информативным для оценки нефтеза-грязненных почв.
Анализ главных компонент. Анализ, проведенный методом главных компонент (АГлК) (рис. 6), демонстрирует закономерности изменения функционирования микроорганизмов в условиях нефтезагрязнения и природного стресса. АГлК выявил два вектора (главные компоненты ГлК): F1 — 59,6% и F2 — 20,3% и подтвердил влияние свойств почв, а также концентраций НП на биологические показатели, разделив почвы на четыре группы (рис. 6). Группа 1: Л-К почвы, в которых концентрации НП выше 4,30 г-кг-1, с положительными нагрузками на ГлК1 и ГлК2. Эту группу почв объединяет сходство, связанное с изменением концентрации аммонийного азота и активности почвенных микроорганизмов (по показателям БД, Смик, метаногенез). Группа 2: Л-К почвы с концентрациями НП ниже 2,46 г-кг-1 с положительными нагрузками на ГлК1 и отрицательными нагрузками на ГлК2. Эта группа почв форми-
руется по почвенным характеристикам, таким как содержание гумуса, гранулометрический состав, а также факторам природного происхождения — обменным натрием, магнием, кальцием, хлоридами, которые влияют на ДНФ, каталазную активность и потребление азота нитратов. Группа 3: с отрицательными нагрузками на ГлК1 и ГлК2, в которую вошли С-К почвы, содержание НП в которых не превышает 1,5 г-кг-1, и, очевидно, эти почвы функционируют без существенных изменений от естественного состояния. Группа 4: С-К почвы с содержанием НП выше 2,5 г-кг-1 с отрицательными нагрузками на ГлК1 и ГлК2. Группировка этих почв основана на сходстве параметров, связанных с изменением свойств почв по биологическим показателям (БД, Смик, метано-генез) и агрегирующихся по показателю qC02 в результате поступления НП в почву, т. е. превышением пороговых значений для С-К почвы в естественных условиях.
Пороговые концентрации НП в С-К и Л-К почвах. Предельный уровень содержания НП в почвах устанавливался на основании оценки изменения активности дыхания для С-К и Л-К почв и с учетом изменения каталазной активности для С-К почвы. Предельный уровень содержания НП, при котором происходят изменения биотического отклика, зависит от свойств почвы, а именно от ее сорбци-онной способности, в том числе степени гумусиро-ванности и гранулометрического состава. Первые достоверные изменения в С-К почве наблюдались при 0,4 г-кг-1, в Л-К слабозасоленной почве — до 1,6 г-кг-1, которые можно рассматривать как изменение в функционировании почвы и трактовать как норматив качества почв. Пороговая концентрация НП (условно величина ДОСНП) для С-К почвы установ-
Б|рЫ (ахеэ Г1 аЫ Г2: 79.89 %)
-НЯ-
гм
СК19
СК18 0ЬБ17 СК16* • СК15* СК14 V
qCO2
СК13 » СК12 СК11
СК10
БД
Огенез ЛК9
сиД ЛК8 Смик •
ЛК6 . ЛК7
ЛК5
- гпян ЛК4
ЛК2 . гран
ЛК3 С СаМд № Сорг
N"N03
-2
1
-1 0
Р1 (59.60 %) • АсШе variables • АсШе observations
Рис. 6. Биплот для Л-К и С-К почв в эксперименте с разными дозами внесенной нефти
6
4
2
0
2
3
4
лена как 2,5 г-кг-1; для Л-К слабозасоленной почвы — 4,3 г-кг-1. При превышении пороговых концентраций НП, установленных по изученным показателям, функционирование экосистемы нарушается и требуется проведение рекультивационных работ.
Почвенная мезофауна в экологическом нормировании. Использование почвенной мезофауны для оценки экологического состояния и нормирования загрязнения в почвах является важным подходом, поскольку почвенные беспозвоночные животные выступают ключевыми компонентами природных экосистем [Добровольский, Никитин, 1990]. В Российской Федерации аттестована «Методика измерения токсичности почв по реакциям энхитреид» [ФР.1.39.2014.18039] с использованием двух видов энхитреид — Enchytraeus albidus и/или Enchytraeus crypticus. Также введены в действие национальные стандарты ГОСТ 33042—2014 «Методы испытаний химической продукции, представляющей опасность для окружающей среды. Тест на репродуктивность дождевых червей (Eisenia fetida/Eisenia andrei)» для оценки влияния химикатов в почве и ГОСТ 330362014 «Методы испытаний химической продукции, представляющей опасность для окружающей среды. Определение острой токсичности для дождевых червей» для определения острой токсичности химических веществ на дождевых червях. В перечисленных методиках в качестве контрольного варианта используется искусственная почва, а не естественная. Однако тестирование почв с использованием некоторых рекомендуемых представителей почвенной мезофауны не всегда согласуется с возможностью их выживания в почвах, связанных с исходными характеристиками. Так, дождевые и земляные черви не являются обитателями почв засушливых зон (степи, сухой степи, полупустынной), поэтому не пригодны как тест-объекты для почв. Следовательно, отдельные типы естественных почв без загрязнения не являются благоприятной средой для указанной почвенной биоты. Это касается и низких концентраций НП, которые, как правило, не вызывают токсического действия на живые организмы. Между тем в качестве контроля предлагается использовать искусственную почву (субстрат), которая не позволяет оценить выживаемость почвенной мезофауны в естественных (не загрязненных) почвах. Так, наши эксперименты с С-К и Л-К почвами показали гибель более 50% животных в не загрязненной НП почве. Ранее было показано, что исходные свойства почв (содержание органического вещества, гранулометрический состав, рН, влажность) влияют на способность выживания энхитреид [Ковалева и др., 2017].
Заключение
Выявлено изменение процессов функционирования почв в условиях нефтезагрязнения: с увеличением содержания НП увеличиваются активность дыхания, Смик нефтеокисляющих микроорганиз-
мов, интенсифицируются процессы самоочищения почв. Показано подавление активности каталазы в почвах с признаками засоления и отсутствие ее связи с концентрациями НП. Активность ДНФ и метаногенез в почвах в условиях нефтяного загрязнения изменялись разнонаправленно.
Результаты исследований нефтезагрязненных почв каштанового ряда и их незагрязненных аналогов в лабораторном эксперименте выявили неоднозначность применения ряда показателей. Установлено ограничение использования: активности каталазы, ДНФ, почвенной мезофауны (Eisenia fetida) как показателей для экологического нормирования НП в почвах засоленного ряда. Уже при слабом засолении (0,13%) почв каштанового ряда показатели: активность каталазы и ДНФ являются не информативными и не могут служить надежными индикаторами, отражающими состояние окружающей среды.
Активность дыхания (БД, Смик) может применяться в качестве индикационного показателя для оценки нефтезагрязненных почв. В нашей работе активность дыхания рассматривается как биоце-нотическая функция экосистемы, которая реагирует на нефтяное загрязнение. БД является одним из ключевых критериев функции почвы при регулировании газового режима атмосферы. Активизация нефтеокисляющих микроорганизмов в почве в условиях загрязнения — пусковой механизм самовосстановления биоты почв как биоценотической функции почв.
Метод главных компонент может служить дополнительным инструментом для верификации установленных пороговых значений НП, выбора наилучших индикаторов, не зависящих от естественных факторов.
Информация о финансировании работы
Исследование выполнено в рамках Программы развития Междисциплинарной научно-образовательной школы Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова «Будущее планеты и глобальные изменения окружающей среды»; государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (тема № 121040800147-0 «Почвенные информационные системы и оптимизация использования почвенных ресурсов»).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Благодатская Е.В., Ананьева Н.Д. Оценка устойчивости микробных сообществ в процессе разложения поллютантов в почве // Почвоведение. 1996. № 11.
2. Благодатский С.А. Микробная биомасса и моделирование цикла азота в почве: Автореф. дис.... д-ра биол. наук. Пущино, 2011.
3. ГОСТ 26423-85 Почвы Методы определения удельной электрической проводимости, рН и плотного остатка водной вытяжки.
4. ГОСТ 26428-85 Почвы Методы определения кальция и магния в водной вытяжке.
5. ГОСТ 26487-85 Почвы Определение обменного кальция и обменного (подвижного) магния методами ЦИНАО.
6. ГОСТ 26950-86 Почвы Метод определения обменного натрия.
7. ГОСТ 26205-91 Почвы Определение подвижных соединений фосфора и калия по методу Мачигина в модификации ЦИНАО.
8. ГОСТ 26213-91 Почвы Методы определения органического вещества.
9. ГОСТ 33036-2014 «Методы испытаний химической продукции, представляющей опасность для окружающей среды. Определение острой токсичности для дождевых червей».
10. ГОСТ Р 53219-2008 Качество почвы Определение содержания нитратного азота, аммонийного азота и общего азота в воздушно-сухих почвах с помощью хлорида кальция в качестве экстрагирующего вещества.
11. ГОСТ 33042—2014 «Методы испытаний химической продукции, представляющей опасность для окружающей среды. Тест на репродуктивность дождевых червей (Eisenia fetida/Eisenia andrei)».
12. ГОСТ 12536-2014 Грунты Методы лабораторного определения гранулометрического (зернового) и микроагрегатного состава.
13. Добровольский Г.В., Никитин Е.Д. Функции почв в биосфере и экосистемах. М., 1990.
14. Классификация и диагностика почв СССР / Под ред. В.В. Егорова, Е.Н. Иванова, В.М. Фридланд. 1977.
15. Ковалева Е.И., Яковлев А.С., Николаенко М.Г. и др. Экологическая оценка нефтезагрязненных почв с использованием энхитреид // Почвоведение. 2017. № 3.
16. Кромка М., Степанов А.Л., Умаров М.М. Восстановление закиси азота микробной биомассой в почвах // Почвоведение. 1991. № 8.
17. Меняйло О.В. Особенности процесса денитрифи-кации в засоленных почвах: Автореф. дис.... канд. биол. наук. М., 1996.
18. Наплекова Н.Н., Булавко Г.И. Ферментативная активность почв, загрязненных соединениями свинца // Почвоведение. 1983. № 7.
19. ПНДФ 16.1:2.2.22-98 «Методика измерения массовой доли нефтепродуктов в почве и донных отложениях методом ИК-спектрометрии. Количественный химический анализ почв». 2005.
20. Поздняков Л.А., Степанов А.Л., Манучарова Н.А. Анаэробное окисление метана в почвах и водных экосистемах // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 17. 2011. № 1.
21. Приказ Министерства природных ресурсов Российской Федерации от 12 сентября 2002 г. № 574 «Об утверждении временных рекомендаций по разработке и введению в действие нормативов допустимого остаточного содержания нефти и продуктов ее трансформации в почвах после проведения рекультивационных и иных восстановительных работ».
22. РД 52.18.572-96 Определение массовой концентрации хлорид-, сульфат-, нитрат-, нитрит-ионов в пробах питьевой воды и в пробах почв (водных вытяжек) методом ионной хроматографии. Методика выполнения измерений.
23. СемиколенныхА.А. Каталазная активность почв северной тайги (Архангельская область) // Почвоведение. 2001. № 1.
24. Степанов А.Л., Лысак Л.В. Методы газовой хроматографии в почвенной микробиологии. М., 2002.
25. Терехова В.А. Биотестирование экотоксичности почв при химическом загрязнении: современные подхо-
ды к интеграции для оценки экологического состояния (обзор) // Почвоведение. 2022. № 5.
26. Умаров М.М., Кураков А.В., Степанов А.Л. Микробиологическая трансформация азота в почве. М., 2007.
27. Умаров М.М. Ассоциативная азотфиксация. М., 1986.
28. ФР.1.39.2014.18039 Методика измерений токсичности почв по реакциям энхитреид.
29. Шорина Т.С. Влияние нефтяного загрязнения на свойства черноземов оренбургского предуралья и пути их восстановления: Автореф. дис.... канд. биол. наук. Уфа, 2011.
30. Эркенова М.И., Толпешта И.И., Трофимов С.Я. и др. Изменение содержания нефтепродуктов в загрязненной нефтью торфяной почве верхового болота в условиях полевого эксперимента с использованием извести и удобрений // Почвоведение. 2011. № 11.
31. Anderson J.P.E., Domsch K.N. A physiological method for quantitative measurement of microbial biomass in soil // Soil Biol. Biochem. 1978. № 10.
32. Anderson T.H., Domsch K.H. Maintenance requirements of actively metabolizing microbial populations under in situ conditions // Soil Biol. Biochem. 1985. № 17.
33. FAO. World Reference Base for Soil Resources. Rome, 2015.
34. Galstian A.S. Enzymatic activity of soils // Geoderma. 1974. № 12.
35. Gamzaeva R.S. IOP Conf. Ser.: Earth Environ. Sci. 2021. https://doi.org/: 10.1088/1755-1315/723/5/052023
36. Guo J., Zhou Y., Guo H. et al. Saline and alkaline stresses alter soil properties and composition and structure of gene-based nitrifier and denitrifier communities in a calcareous desert soil // BMC Microbiol. 2021. № 21.
37. Huibin Y., Yonghui S.B.X., Erdeng D. et al. Denitrifi-cation potential and its correlation to physico-chemical and biological characteristics of saline wetland soils in semi-arid regions // Chemosphere. 2012. Vol. 89, № 11.
38. Kovaleva E.I., Trofimov S.Ya., Zhongqi Ch. Impact of oil contamination on ecological functions of peat soils from West Siberia of Russia // Journal of Environ. Quality. 2021. Vol. 50, № 1.
39. Miao Y., Liao R., ZhangX. et al. Metagenomic insights into salinity effect on diversity and abundance of denitrifying bacteria and genes in an expanded granular sludge bed reactor treating high-nitrate wastewater // Chem. Eng. Journal. 2015.
40. Raghoebarsing A.A., Pol A., van de Pas-Schoonen K.T. et al. A microbial consortium couples anaerobic methane oxidation to denitrification // Nature. 2006. Vol. 440.
41. Seo D.C., Yu K., Delaune R.D. Influence of salinity level on sediment denitrification in a Louisiana estuary receiving diverted Mississippi River water // Arch Agron Soil Sci. 2008. 54(3).
42. Shiyin L., Lixiao N., Panying P. et al. Effects of pesticides and their hydrolysates on catalase activity in soil // Bulletin of environmental contamination and toxicology. 2004. Vol. 72.
43. Vasenev V.I., Ananeva N.D., Ivashchenko K.V. The effect of pollutants (heavy metals and diesel fuel) on the respiratory activity of constructozems (artificial soils) // Russian Journal of Ecology. 2013. Vol. 44, № 6.
44. Vavilin V.A. Anaerobic oxidation of methane by nitrate: the kinetic isotope effect // Environment dynamics and global climate change. 2019. Vol. 10.
45. Zeng W.-Z, Xu C., Wu J.-W. et al. of salinity on soil respiration and nitrogen dynamics // Ecol Chem Eng S. 2013. Vol. 20, № 3.
Поступила в редакцию 24.01.2023 После доработки 21.02.2023 Принята к публикации 01.03.2023
ВЕСТНИК МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ 17. ПОЧВОВЕДЕНИЕ. 2023. Т. 78. № 2 LOMONOSOV SOIL SCIENCE JOURNAL. 2023. Vol. 78. No. 2
THE CHOICE OF INDICATORS FOR THE ECOLOGICAL RATIONING OF PETROLEUM PRODUCTS IN CHESTNUT SOILS
E. I. Kovaleva, S. Ya. Trofimov, S. A. Shoba
The response of the microbial community of soils to different levels of oil contamination in a model experiment was studied according to indicators: basal respiration (BR), basal induced respiration (SIR), carbon of microbial biomass (Cmic), potential denitrification (DNF), methanogenesis, catalase activity. The soils are represented by light chestnut (Haplic Kastanozems Sodic) and meadow-chestnut (Gleyic Kastanozems Chromic) dry-steppe zone of the Stavropol area, differing in the organic matter content, salinity and the content of physical clay. The intensity of BR increased after 30 days of the crude oil input into the soils and caused the growth of Cmic due to the activation of oil-oxidizing microorganisms in anaerobic zones of soils. DNF varied in light chestnut and meadow-chestnut soils not directly, that was probably due to the level of organic matter content in soils and their salinity. Catalase activity was a sensitive indicator for the petroleum hydrocarbons in light chestnut soil, but salinity was the determining factor in its activity in meadow chestnut soil. Biotesting with the use of worms Eisenia fetida showed the inability of test organisms to survive in non-contaminated chestnut soils. A significant indicator that did not depend on natural factors in chestnut soils was BR and related indicators. Catalase activity and DNF have limitations on the salinity factor.
Keywords: oil, dry-steppe soils, respiration activity, enzymatic activity, environmental standards, soil functions.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Ковалева Екатерина Игоревна, канд. биол. наук, ст. науч. сотр. кафедры географии почв факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова, e-mail: katekov@mail.ru
Трофимов Сергей Яковлевич, докт. биол. наук, профессор кафедры химии почв факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова, e-mail: strofimov@inbox.ru
Шоба Сергей Алексеевич, чл.-корр. РАН, докт. биол. наук, зав. кафедрой географии почв факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова, e-mail: s.a.shoba1945@gmail.com
