CC BY
298
О ВЛИЯНИИ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА НА ФИЗИОЛОГИЮ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ
УДК 577.539.199 DOI: 10.17816/RCF14442-51
© О.А. Зейналов1, С.П. Комбарова1, Д.В. Багров2, М.А. Петросян3, Г.Х. Толибова3, А.В. Феофанов2, К.В. Шайтан2
10ОО «НПК «СКиФФ», Москва, Россия;
2МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия;
3ФГБНУ «НИИАГиР им. Д.О. Отта, Санкт-Петербург, Россия
Ключевые слова:_
нанотехнологии; наночастицы серебра; характеризация наночастиц; просвечивающая электронная микроскопия; биобезопасность; биосистемы; лабораторные мыши; физиологические параметры; первичный контроль; показатели поведения животных; морфологические и биохимические параметры крови.
Список сокращений_
ПВП — поливинилпирролидон; АСТ — аспартатаминотрансфераза; АЛТ — аланинаминотрансфераза; ЩФ — щелочная фосфатаза.
Резюме_
Благодаря уникальным свойствам серебра в настоящее время во всем мире возрос интерес к разработкам и применению се-ребросодержащих препаратов. При переходе серебра в нано-форму его специфические свойства значительно усиливаются.
Поступила в редакцию 20.09.2016 Принята к печати 14.11.2016
Наночастицы серебра оказываются в несколько раз более активными, чем другие его формы и известные антибиотические и биоцидные препараты. Одновременно наноразмер способствует тому, что наночастицы могут легче проникать через защитные барьеры живых организмов и попадать непосредственно в органы и ткани. Чтобы быть уверенными в безопасности серебросодержащей нанопродукции для здоровья человека и окружающей среды, необходимо исследовать влияние наноча-стиц серебра на живые организмы. В данной работе представлены экспериментальные данные по изучению влияния наносе-ребра (на примере таких серебросодержащих препаратов, как повиаргол и арговит) на лабораторных мышей. Испытуемые препараты охарактеризованы с помощью метода просвечивающей электронной микроскопии. Установлено, что для целей первичного экспресс-мониторинга патологических состояний, вызванных наночастицами серебра, могут быть использованы показатели периферической крови, подтвержденные биохимическим анализом сыворотки крови млекопитающих.
ABOUT THE iNFLUENCE OF SiLVER NANOPARTiCLES ON LiViNG ORGANiSMS PHYSiOLOGY
© O.A. Zeinalov1, S.P. Kombarova1, D.V. Bagrov2, M.A. Petrosyan3, G.H. Tolibova3, A.V. Feofanov2, K.V. Shaitan2
1 Research and Production Company "SK&FF" Ltd., Moscow, Russia;
2Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia;
3 Ott Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology, Department of Pathomorphology, Laboratory of Pharmacology, Saint Petersburg, Russia
For citation: Reviews on Clinical Pharmacology and Drug Therapy, 2016;14(4):42-51 Received: 20.09.2016
Accepted: 14.11.2016
♦ Keywords: nanotechnology; silver nanoparticles; characterization of nanoparticles; transmission electron microscopy; biosafety; biosystems; laboratory mice; pathological conditions; primary monitoring; indicators of animal behavior; morphological and biochemical parameters of blood.
♦ Abstract. The production and properties of silver-containing products currently attract increasing attention due to the unique properties of silver. Specific properties of silver are considerably amplified when it is dispersed to the form of nanosized particles. Silver nanoparticles are several times more active than its other forms and many antibiotic and biocidal products. At the same time nanoparticles
can more easily penetrate the protective barriers of living organisms and get directly into their tissues and organs. To be assured of safety of silver nanoproducts for human health and environment, it is necessary to study the influence of silver nanoparticles on the physiology of living organisms. This paper presents experimental data on effect of two nanosilver preparations (poviargol and argovit) on laboratory mice. Investigated preparations were characterized by transmission electron microscopy. It was established that morphological express control of peripheral blood and biochemical analysis of blood serum of living organisms can serve for purposes of primary monitoring of the pathological conditions caused by silver nanoparticles.
ВВЕДЕНИЕ
Бурное развитие нанотехнологий способствует прогрессу в промышленности, науке, технике, медицине, защите окружающей среды, сельском хозяйстве и других отраслях.
Стратегические прогнозы, опубликованные Global Industry Analysts Inc. [38] и Национальным исследовательским университетом «Высшая школа экономики» [11], показывают наметившуюся в последнее время тенденцию устойчивого роста исследований, разработок и внедрения различных наночастиц и наноматериалов в основном благодаря быстро растущему интересу к ним со стороны медицины и электронной промышленности.
Среди более чем 800 наименований потребительских нанотоваров наибольшим спросом в мире пользуется продукция, в состав которой входят на-ночастицы серебра (235 наименований), на втором месте — фуллерены (71), далее список продолжают нанопорошки оксида титана (38), оксида цинка (29) и др. Доходы от нанометаллов, в том числе наносеребра, в 2016 году должны приблизиться к 3 млрд долл. США [11, 38].
Серебро с давних времен находит применение во многих отраслях. Его используют в электрических контактах и проводящих пастах в электронике. Бактерицидные, фунгицидные и вирулицидные свойства серебра сделали его особенно удобным и эффективным для использования в медицине в качестве естественной альтернативы антибиотикам; в косметологии — в качестве лечебно-профилактических добавок к косметическим средствам; в космической индустрии — для обеззараживания воды, воздуха и выращивания растений; в клининговой отрасли — для антибактериальной очистки жилых домов, офисов, автомобилей, бассейнов, саун и т. п.; в экологии — для обеззараживания и очистки воздуха, воды и других загрязнений [2, 11, 38, 43].
В настоящее время во всем мире возрос интерес к разработкам и применению серебросодержащих препаратов в медицине и ветеринарии. Это обусловлено чрезвычайно ценным комплексом терапевтических свойств, присущих серебру: широким спектром противомикробного и противовирусного действия, иммуномодулирующими свойствами, отсутствием устойчивости к нему у большинства патогенных микроорганизмов, низкой токсичностью, отсутствием данных об аллергенных свойствах. Препараты серебра уже находят широкое применение для профилактики и лечения различных инфек-ционно-воспалительных и опухолевых заболеваний, особенно микст-инфекций [2, 10, 43].
Предполагается, что при переходе серебра в на-ноформу его уникальные свойства значительно усиливаются. Так, наночастицы серебра становятся не только очень хорошими катализаторами химических реакций, но и непосредственно участвуют в них. Усиление антимикробного и вирулицидного дей-
ствия серебра в виде наночастиц объясняют их повышенной реакционной способностью. В диапазоне 1-100 нм они оказываются в десятки и сотни раз более активными, чем другие известные биоцидные и антибиотические препараты [3, 10, 14].
В наноразмерном диапазоне частицы серебра потенциально могут легче проникать в клетки и распределяться внутри живых организмов, например, при дыхании могут попасть из легких непосредственно в систему кровообращения. Они могут также взаимодействовать путем адгезии с клеточными мембранами с образованием токсичных активных форм кислорода, которые вызывают различные нарушения клеток. Кроме того, они способны генерировать апоптогенные факторы, приводящие к некрозу клеток [19, 22, 23, 26-28, 30, 35, 37, 39].
Рядом авторов отмечена возможность распределения наночастиц серебра по всему организму, но главным образом они аккумулируются в коже, печени, селезенке, почках, надпочечниках и легких. Количество серебра, депонированного в различных тканях, прямо пропорционально кровоснабжению соответствующего органа [16, 20, 27, 39, 42].
Постоянное потребление серебра приводит к необратимому накоплению его в подкожных слоях и слизистых оболочках, что способствует усиленной выработке меланина и изменению цвета кожи и слизистых [16, 24, 43]. Это заболевание известно как аргирия (практически необратимая пигментация кожи) и/или аргироз (окрашивание глаз). Остается необъясненным факт совершенно разной реакции на употребление серебросодержащих препаратов — от ее отсутствия до тяжелого аргироза. Venugopal et а1. [39] указывают на аргирию как способ детоксикации серебра в живых организмах путем аккумулирования его в тканях в основном в виде безопасных комплексов с белками или в виде сульфидов серебра.
В исследовательской работе Рапуа1а et а1. [29] показано, что 5 пациентов из 26 обследованных рабочих промышленного предприятия в Хайдарабаде (Индия), занимающегося переработкой промышленных серебросодержащих отходов, пострадало от генерализованной аргирии, а 15 — от аргирозов, 10 человек жаловались на желудочно-кишечные расстройства и некоторую гиперчувствительность. Эти симптомы полностью коррелировали с повышенным содержанием серебра в крови и аккумулированием его в базальных мембранах и эластичных волокнах кожи. Появление подобных негативных реакций подтверждает необходимость ограничения прямых контактов человека с серебром и его соединениями и проведения тщательных исследований его влияния на живые организмы.
Известно также, что при длительном использовании серебросодержащих препаратов возможно появление других неблагоприятных симптомов, таких как гипертензия, диабет, заболевания желудочно-кишечного тракта, гипертрофия простаты и др. [17, 28, 29, 39, 41, 42].
Таким образом, попадая различными путями и накапливаясь в организме человека или животных, серебро в определенных дозах может оказывать токсическое воздействие на различные органы и ткани. Особенно опасны наночастицы серебра, наиболее активные по сравнению с обычными формами серебра. Степень такой опасности пока невозможно оценить, исходя лишь из знаний о токсичности серебра в макроформе. Поэтому, несмотря на впечатляющие перспективы применения нанотехно-логий и на уникальные физико-химические свойства наночастиц, особенно наносеребра, материалы на их основе вызывают опасения в отношении биологической совместимости и возможных негативных последствий взаимодействия с биологическими системами. Детальное изучение этих взаимодействий и, в частности, исследование влияния наночастиц серебра на физиологию живых организмов, может стать основой при разработке критериев гигиенического нормирования безопасных условий в процессе исследований, производства и применения наноматериалов нового поколения.
Целью данной работы явилась оценка влияния препаратов, содержащих высокие дозы наночастиц серебра, на поведение экспериментальных животных, морфологические и биохимические показатели крови.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Экспериментальную работу проводили на мышах (самцах) массой 25-35 г при соблюдении стандартных правил содержания лабораторных животных [4, 7-9].
Для исследований использовали 60 экспериментальных животных, из которых было сформировано две группы: опытная и контрольная (по 30 голов в группе). Каждая группа была разделена на две подгруппы. В опытной группе животные получали соответствующий подгруппе препарат наносе-ребра. Параллельно животные контрольной группы получали в подгруппах соответственно дистиллированную воду или ПВП в сопоставимых с подопытными подгруппами объемах и дозах.
Контрольная группа: дистиллированная вода — Milli-Q (контроль 1); поливинилпирролидон (ПВП) — Мм 12 600, 92 масс.% (ООО «АК Синтвита» [44]) (контроль 2). ПВП является инертным стабилизатором наночастиц в исследуемых препаратах на-носеребра. ПВП широко используется в медицине (гемодез, энтеродез, йодопирон и др.). По степени воздействия на организм человека в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 ПВП относится к 4-му классу опасности — веществам малоопасным.
Подопытная группа (препараты наносеребра): - повиаргол — нанопорошок зеленовато-коричневого цвета, в состав которого входит 7,5-8,5 % высокодисперсное металлическое серебро,
стабилизированное ПВП (ИВС РАН, г Санкт-Петербург) [5]; - арговит — водный концентрат зеленовато-бурого цвета с содержанием серебра 10 мг/мл, стабилизированный ПВП (ООО НПЦ «Вектор-Вита», г Новосибирск) [43].
Повиаргол — препарат серебра в виде нанопо-рошка. Это позволило проверить с его помощью влияние большей суточной дозы наносеребра на экспериментальных животных. Водную суспензию повиаргола (50 мг/мл) готовили за сутки до использования. Ежесуточная доза составляла 500 мкг/г животного в объеме 0,3 мл (дробно по 0,15 мл с интервалом в 40-50 мин). Введение осуществляли в течение трех суток. Учитывая необходимость прохождения препарата через зонд при внутрижелу-дочном введении, приготовление суспензий более высокой концентрации из-за повышенной вязкости было нецелесообразно. Нужно отметить, что в связи с высокой вязкостью и большим объемом введение препаратов животным было затруднено и проводилось в два этапа.
Ежесуточная доза арговита составляла 100 мкг/г животного в объеме 0,3 мл. Так как арговит представляет собой водный концентрат, дозу выбирали с учетом максимально возможного объема жидкости, который можно ввести мышам перорально в течение суток. Введение препарата осуществляли двукратно по 0,15 мл в течение пяти суток.
Для подопытных животных, которым были назначены препараты наносеребра, контролем служили подгруппы, получающие ПВП или дистиллированную воду. Дозу ПВП рассчитывали по его массовой доле (92 %) в повиарголе. С целью лучшего растворения водный раствор полимера готовили за сутки до использования. Введение ПВП осуществляли ежедневно в объеме 0,3 мл (дробно по 0,15 мл с интервалом в 40-50 мин) в течение пяти суток. Во второй контрольной подгруппе дистиллированную воду вводили мышам в сопоставимых объемах. Все препараты вводили животным в виде водных суспензий ежедневно per os в желудок с использованием металлического зонда.
Состояние кожных покровов оценивали визуально. По завершении исследования прижизненно осуществляли забор периферической крови мышей. Для биохимических исследований крови на следующий день после каждого введения препаратов трех животных выводили из эксперимента путем декапи-тации.
С целью выявления развития возможной эндогенной интоксикации изучали показатели поведения, а также гематологические и биохимические параметры крови экспериментальных животных [13, 15]. Методы исследований приведены в предыдущей нашей работе [4].
Показатели поведения животных (внешний вид, поведение, симптомы интоксикации, потребление пищи и воды, учет гибели животных и др.)
оценивали во всех экспериментальных группах от момента введения исследуемого вещества до завершения опыта.
Гематологические показатели исследовали, как описано выше [4].
Окрашивание мазков проводили по методу Романовского - Гимзы с использованием автоматической системы для окраски гематологических мазков Hema-Tek (Bayer Diagnostics, Германия).
На окрашенных мазках анализировали лейкоцитарную формулу (морфологическое исследование форменных элементов крови проводили методом Меандра), а также регистрировали количество тромбоцитов с помощью автоматического счетчика клеток ABX Micros 60 (Франция).
Для общеклинического анализа крови (лейкоциты, эритроциты, гемоглобин, тромбоциты) использовали автоматизированный гематологический анализатор ABX Micros 60 (Франция).
Биохимические показатели крови анализировали в день забора крови с применением диагностических наборов фирмы Konelab/Thermo Fisher Scientific (Финляндия) на аппарате Vitalab Flexor (Голландия) [4].
В результате тотального забора крови после декапитации животных полученную сыворотку крови использовали для анализа таких показателей, как:
• аспартатаминотрансфераза (АСТ — AST IFCC, colorimetric Konelab[TM]);
• аланинаминотрансфераза (АЛТ — ALT IFCC, colorimetric Konelab[TM]);
• щелочная фосфатаза (ЩФ — Alkaline Phoshatase SCE, colorimetric Konelab[TM]);
• креатинин (Creatinine Jaffe, colorimetric Konelab[TM]);
• мочевина (Urea, colorimetric Konelab[TM]);
• белок общий (Total protein, colorimetric Konelab[TM]).
Характеризация наночастиц серебра проводилась методом просвечивающей электронной микроскопии [21].
Для определения размеров и формы наночастиц использовали просвечивающий электронный микроскоп LEO912 AB OMEGA, работающий при ускоряющем напряжении 100 кВ. Наночастицы исследовали на сетках, покрытых формваром.
Обработку изображений осуществляли с помощью программы ImageJ. Для быстрого получения большой выборки использовалась пороговая фильтрация [21, 40], которая позволяет отделить частицы от фона, на котором они находятся. Перед выполнением пороговой фильтрации из изображения удаляли фон (устраняли неоднородность засветки экрана), шумы удаляли медианной фильтрацией и сглаживанием. При определении размеров каждую частицу аппроксимировали эллипсом, принимая за размер полусумму его осей. Для описания формы наночастиц вычисляли их формфактор как отношение длин осей эллипса.
Статистическая обработка экспериментальных данных в ходе выполнения работы проводилась путем вычисления средних арифметических и их доверительных интервалов при р < 0,05. Для оценки достоверности результатов использовали параметрический критерий статистической обработки данных по методу Стьюдента с применением пакета прикладных программ Microsoft Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На основе анализа результатов большинства исследований в области токсикологии металлов нельзя констатировать отрицательное влияние серебра на здоровье человека, так как обычное его использование не превышает допустимых физиологических норм. Согласно рекомендациям EPA (USA) допустимая суточная доза серебра (RfD), не вызывающая некроза клеток, составляет 5 мкг на 1 кг массы тела в сутки [42]. Несмотря на это, медики и экологи обеспокоены тем, что широкое распространение и использование такого мощного антимикробного средства, как наносеребро, может не только иметь отдаленные серьезные последствия для здоровья людей, но и оказать отрицательное влияние на состояние окружающей среды в целом. Даже в природной форме серебро может быть токсично для рыб, водорослей, некоторых растений, грибов, ракообразных, гетеротрофных и хемолитотрофных бактерий. В экологическом плане серебро может отрицательно влиять на процессы денитрификации почв, вызывая гибель важных почвенных бактерий, приводя к эутрофикации рек, озер и других водных систем [29, 43].
Исследованиями Kiruba Daniel [20], Borm and Kreyling [17], Красовского и др. [6], Rungby and Danscher [32, 33] и др. установлено, что как ионы, так и наночастицы серебра могут проникать через гематоэнцефалический барьер и накапливаться в нейронах и глиальных клетках головного и спинного мозга. Экспериментально пока не доказано токсическое воздействие серебра на периферическую нервную систему, хотя депозиты сульфида серебра обнаруживаются и в области кожных нервов [25].
Braydich-Stolle et al. [18] подтвердили, что наночастицы серебра в концентрации от 10 мкг/мл и выше приводят к изменениям типа некроза или апоптоза клеток, главным образом за счет значительного снижения функций митохондрий и подвижности клеток.
Как показали Seung-heon et al. [34] и Shin et al. [36] наночастицы серебра могут оказывать значительное токсическое влияние на деление клеток и экспрессию цитокинов периферическими монону-клеарными клетками крови.
Senjen в своей работе [41] продемонстрировал, что потребление внутрь коллоидного серебра (суспензии серебра в виде микро- или наночастиц)
может вызывать неврологические нарушения, желудочно-кишечные расстройства, нарушения функции почек, головные боли, усталость и пигментацию кожи. В некоторых случаях у пациентов дополнительно к вышеприведенным физиологическим нарушениям снижался уровень ночного зрения. Последующие офтальмологические исследования показали взаимосвязь между снижением уровня зрения в темноте и накоплением серебра в роговице.
Таким образом, когда речь идет о серебре, особенно в форме наносеребра, нельзя забывать об опасности возникновения для человека различных заболеваний, в том числе аргирии (аргирозов), а для окружающей среды — эутрофикации водоемов. Чтобы избежать возникновения побочных эффектов от использования наночастиц серебра, необходимо определить допустимые нормы их потребления и разработать специальные экспресс-методы их детекции в живых организмах и окружающей среде.
Ранее на примере наночастиц оксидов металлов нами была продемонстрирована возможность использования методов клинической лабораторной диагностики для первичного контроля возможных патологических изменений в живых организмах под влиянием наночастиц. При этом в качестве критерия оценки функциональных свойств животных были выбраны гематологические и биохимические параметры крови [4]. В данной работе подобный подход апробирован для наночастиц серебра, как наиболее распространенной составляющей наноматериалов.
До настоящего времени встречались лишь отдельные работы, в которых отмечалось влияние на-носеребра на показатели крови или мочи [20, 26, 29, 31, 34, 36]. Так, Rosenman et а1. [31] обследовали персонал, занятый в производстве драгоценных металлов. Среди 27 рабочих у 96 % оказался повышенный уровень содержания серебра в моче (диапазон 9,5-52,0 мкг/л, чаще — 11,3 мкг/л), а у 92 % рабочих — повышенный уровень содержания сере-
бра в крови (диапазон 0,05-6,2 мкг/100 мл, чаще — 1,0 мкг/100 мл). Примерно 30 % рабочих (8 из 27 человек) имели симптомы респираторных раздражений, носовых кровотечений и т. д. Аккумуляция серебра в роговой оболочке глаз наблюдалась в 5 из 8 случаев (63 %). У 4 пациентов было обнаружено увеличение содержания N-ацетил-р^ глю-козаминидазы и снижение уровня креатинина. Эти показатели коррелировали с повышенным содержанием серебра в крови и возрастом обследованных рабочих, подтвердив неблагоприятное влияние серебряной пыли на почечную функцию [40].
Однако из-за недостатка опытных данных пока трудно определить, действительно ли наносере-бро может оказывать негативное влияние на почки и другие органы и ткани живых организмов. Это могут быть артефакты, связанные, в частности, с влиянием поверхностно-активных стабилизаторов наночастиц серебра, побочного влияния которых трудно избежать в экспериментах in vivo [12, 28, 29, 41].
Первоначальным этапом данной работы по изучению влияния на живые организмы высоких доз наночастиц серебра являлась характеризация их методом просвечивающей электронной микроскопии [21, 40].
Характеризация наночастиц в препарате повиаргол
Как показано на рис. 1, в повиарголе обнаружены две фракции наночастиц: мелкие, со средним размером 2,0 ± 0,6 нм, и единичные крупные, размеры которых лежат в диапазоне 5-100 нм. Распределение мелких наночастиц по размерам представлено на рис. 2 (число частиц n = 267). Для более крупных частиц распределение по размерам построено не было, потому что для них не удалось набрать выборку, достоверно перекрывающую весь диапазон размеров.
Частицы препарата имели преимущественно сферическую или эллиптическую форму, форм-фактор составил 1,3 ± 0,3.
80-, 706050403020100-
Рис. 1. Наночастицы серебра в препарате повиаргол
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 Размер наночастиц, нм
Рис. 2. Распределение мелких частиц препарата повиаргол по размерам
Рис. 3. Наночастицы серебра в препарате арговит
'• '1..........г
20 30 40 50 60
Размер наночастиц, нм Рис. 4. Распределение наночастиц препарата арговит по размерам
Характеризация наночастиц в препарате арговит
Типичное изображение наночастиц серебра в препарате арговит представлено на рис. 3, распределение частиц по размерам — на рис. 4. Средний размер равен 35 ± 11 нм, что существенно больше, чем в повиарголе. Средний формфактор составил 1,2 ± 0,3.
Влияние наночастиц серебра на лабораторных животных В результате наблюдения за общим состоянием животных в опытных подгруппах после введения им изучаемых серебросодержащих препаратов каких-либо отклонений в поведенческих реакциях не наблюдалось. Признаков общего угнетения и внешнего проявления токсикоза у экспериментальных мышей отмечено не было. Животные не проявляли беспокойства, их внешний вид был опрятный, шерсть ровной, гладкой, блестящей, потребление воды и пищи в норме. Однако у всех подопытных животных через 3-4 ч после введения препаратов на-
блюдали изменение стула. Консистенция кала — неоформленная, цвет — темно-серый. По-видимому, это связано с окраской исследуемых препаратов и не является значимым отклонением.
На основании полученных результатов можно заключить, что поведение животных не может использоваться в качестве показателя патологических отклонений на начальных стадиях проявления токсического действия наночастиц на живые организмы.
Регистрацию изменений морфологических параметров периферической крови и биохимических показателей сыворотки крови во всех опытных подгруппах проводили ежесуточно в сравнении с контрольными животными, находящимися в тех же условиях эксперимента. Результаты гематологических исследований периферической крови мышей представлены в табл. 1 и на рис. 5, 6; результаты биохимического анализа сыворотки крови — на рис. 7, 8.
Осмотр кожных покровов подопытных животных, проведенный перед их вскрытием, изменения цвета кожи (аргирии) не выявил.
■ Таблица 1. Лейкоцитарная формула периферической крови контрольных и подопытных животных после введения испытуемых препаратов
Группа животных, препарат Дни опыта Морфологический состав периферической крови
нейтрофилы, % моноциты, % эозинофилы, % лимфоциты, %
палочкоядерные сегментоядерные
Контроль 1 Дистиллир. вода 1-5 1,4 ± 0,2 18,0 ± 2,7 1,5 ± 0,2 0,7 ± 0,1 63,0 ± 4,0
Контроль 2 ПВП 1-5 1,2 ± 0,2 18,0 ± 3,3 1,6 ± 0,2 0,6 ± 0,1 65,0 ± 4,5
Подопытная подгруппа Повиаргол 1 1,0 ± 0,1 22,0 ± 3,5 2,5 ± 0,3 0 53,0 ± 4,0
2 2,0 ± 0,3 33,0 ± 4,2 2,0 ± 0,3 0 55,4 ± 4,5
3 1,0 ± 0,1 22,2 ± 3,0 2,0 ± 0,2 0 56,6 ± 5,0
Подопытная подгруппа Арговит 1 1,0 ± 0,1 10,9 ± 1,5 1,4 ± 0,2 0 73,7 ± 6,5
2 1,0 ± 0 9,8 ± 1,2 1,2 ± 0,1 2 ± 0,2 65,9 ± 6,7
3 3,0 ± 0,3 17,7 ± 2,.6 2,1 ± 0,3 1 ± 0,1 56,5 ± 5,0
4 1,0 ± 0 21,5 ± 3,2 1,3 ± 0 0 74,3 ± 6,5
5 1,0 ± 0,1 23,6 ± 3,5 1,8 ± 0,2 0 57,1 ± 4,5
а 20 15
1 День 1
Арговит 1 День 2 И День 3
Повиаргол ! День 4 ЕЛ! День 5
б 12 10 8
День 1
Арговит День 2 День 3
Повиаргол День 4 День 5
Рис. 5. Общеклиническое исследование крови экспериментальных животных после введения испытуемых препаратов (гемоглобин, эритроциты)
При введении повиаргола у одного из самцов на третий день эксперимента произошла асфиксия в результате аспирации легких жидкостью. В этой же подгруппе на четвертый день эксперимента (суммарная доза составила 1500 мкг/г животного) имел место один летальный случай, что, по-видимому, также связано с введением большого объема препарата. В остальных подгруппах гибели животных не наблюдалось.
Гематологические исследования показали, что в обеих экспериментальных группах у животных отмечался умеренный тромбоцитоз (контроль — 1090 ± 110 х 103/мм3). Кроме того, в первые дни введения серебросодержащих препаратов, так же как и в большинстве экспериментов с введением мышам наночастиц оксидов металлов [4], зарегистрировано уменьшение содержания лимфоцитов (табл. 1). Это может свидетельствовать о начальной стадии токсического процесса. Количество эозинофилов в мазках крови находилось в пределах нормы, что указывает на отсутствие аллергической реакции (см. табл. 1). У всех групп экспериментальных животных наблюдалась полихромазия. Эти показатели также совпадают с данными для животных, подвергнутых экспозиции высоких доз наночастиц оксидов металлов [4].
Повиаргол. На следующий день после введения первой дозы повиаргола (500 мкг/г животного в сутки) произошло увеличение количества тромбоцитов и снижение лейкоцитов, которое сохранилось при повторном введении препарата (рис. 6). При этом
в сыворотке крови подопытных животных зарегистрирован рост уровней креатинина, мочевины, АЛТ, АСТ и ЩФ (см. рис. 7, 8), что может быть следствием возможного гепатотоксического действия препарата наносеребра.
Увеличение активности аминотрансфераз может указывать на наличие цитолитического синдрома, а изменения показателей азотистого обмена могут расцениваться как потенциальное проявление почечной недостаточности.
Арговит. Ежесуточная доза арговита (100 мкг/г животного в сутки) была в 5 раз ниже (из-за жидкой формы препарата) по сравнению с повиарголом. Несмотря на это, оба препарата в первые два дня введения оказывали на мышей сходное влияние. Низкий уровень лейкоцитов наблюдался практически на протяжении всего периода эксперимента (контроль — 18,2 ± 1,9 х 103/мм3). Причем на второй и четвертый дни падение лейкоцитов было наиболее значительным (см. рис. 6). Это коррелировало с пропорциональным снижением сегментоядерных нейтрофилов (см. табл. 1). Данные изменения могут быть следствием возможного угнетения работы иммунной системы организма в результате интоксикации экспериментальных животных. К пятому дню отмечалось выраженное (более чем в два раза) снижение количества тромбоцитов (см. рис. 6), что может быть вызвано либо снижением продукции кровяных пластинок в красном костном мозге, либо увеличением скорости их разрушения или использования.
День 1
Арговит День 2
День 3
Повиаргол 1 День 4 1 День 5
День 1
Арговит День 2 День 3
Повиаргол День 4 День 5
Рис. 6. Общеклиническое исследование крови экспериментальных животных после введения испытуемых препаратов (лейкоциты, тромбоциты)
б
Арговит Повиаргол Арговит Повиаргол Арговит Повиаргол
01 День 1 Э День2 (ШДеньЗ ШДень4 ЕЭДеньБ ИДень1 ВДень2 ШДеньЗ ШДень4 ЕЭДеньБ 0День1 @День2 ШДеньЗ НДень4 ЩЗДеньБ
Рис. 7. Биохимическое исследование крови экспериментальных животных после введения испытуемых препаратов; -контроль
б
а
в
Первая доза арговита (1-е сутки — 100 мкг/г животного) вызвала также повышение активности ЩФ и содержания креатинина в сыворотке крови (см. рис. 7, 8). При повторном введении отмечалось резкое увеличение активности АЛТ (в 2,9 раза), АСТ (в 2,7 раза) и повышение уровня мочевины (в 1,3 раза), что свидетельствует об умеренной ги-перферментемии.
Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что на начальных этапах введение высоких доз наносеребра не отражается на поведении животных. Значительно больше информации удается получить при использовании методов клинической лабораторной диагностики, таких как гематологические и биохимические анализы крови (см. табл. 1, рис. 5-8). В частности, для целей первичного мониторинга патологических состояний, вызванных наночастицами, можно рекомендовать морфологический экспресс-контроль периферической крови живых организмов. При этом для наночастиц серебра, так же как и для наночастиц оксидов металлов [4], чувствительными оказались показатели красной крови. В дополнение к этому наблюдали изменения в лейкоцитарной формуле (см. табл. 1, рис. 6).
Изменения параметров периферической крови подтвердились результатами биохимического анализа сыворотки крови мышей, подвергнутых действию наносеребра. Отклонения отмечались
в спектрах показателей азотистого обмена (креа-тинин, мочевина) и отдельных ключевых ферментов (АЛТ, АСТ и ЩФ), что может свидетельствовать о начальных стадиях почечной и/или печеночной недостаточности.
ВЫВОДЫ
В целом проведенные клинические и биохимические исследования крови экспериментальных мышей, подвергнутых экспозиции высоких доз на-ночастиц серебра, продемонстрировали отклонения основных показателей крови от референсных значений, что согласуется с данными предыдущих исследований [4, 12, 28, 29]. На основании этого выбранные гематологические и биохимические параметры крови могут быть рекомендованы как диагностические биомаркеры для первичной оценки воздействия на биосистемы наноматериалов, содержащих наночастицы серебра. Эти методы отличает доступность, высокая информативность и воспроизводимость, что особенно актуально при обследовании персонала, занятого в наноинду-стрии, а также для накопления фактического материала, описывающего взаимосвязи между типами наночастиц, способами их проникновения в живые организмы и диагностированием рисков для здоровья человека.
а 14 -г
Арговит Повиаргол
0 День 1 В День 2 1 День 3 И День 4 И День 5
Рис. 8. Показатели мочевины и креатинина в крови эю -контроль
Арговит Повиаргол
^День 1 а День 2 ШИДень 3 И День 4 ШДень 5
животных после введения испытуемых препаратов;
ЛИТЕРАТУРА
1. Арговит ТУ 9310-13-00008064-00 [Argovit TU 9310-1300008064-00. (In Russ.)]
2. Благитко Е.М., Бурмистров В.А., Колесников А.П., и др. Серебро в медицине. — Новосибирск: Наука-Центр, 2004. — 256 с. [Blagitko EM, Burmistrov VA, Kolesnikov AP, et al. Silver in medicine. Novosibirsk: Nauka-Tsentr; 2004. 256 р. (In Russ.)]
3. Глушкова А.В., Дулов С.А., Радилов А.С. Опасность наночастиц и программа превентивных действий // Токсикологический вестник. — 2010. — Т. 105. — № 6. — С. 15-18. [Glushkova AV, Dulov SA, Radilov AS. Risk of nanoparticles and the program of preventive action. Tok-sikologicheskii vestnik. 2010; 105(6):15-18. (In Russ.)]
4. Зейналов О.А., Комбарова С.П., Багров Д.В., и др. О влиянии наночастиц оксидов металлов на физиологию живых организмов // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. — 2016. — Т 14. — № 3. — С. 24-33. [Zeinalov OA, Kombarova SP, Bagrov DV, et al. About the influence of metal oxide nanopa rticles on living organisms physiology. Obzory po klinicheskoi farma-kologii i lekarstvennoi terapii. 2016;14(3):24-33. (In Russ.)]
5. Копейкин В.В., Панарин Е.Ф., Сантурян Ю.Г., и др. Патент № 2088234 RU (13) C1 от 27.08.1997. [Kopeikin VV, Panarin EF, Santuryan YuG, et al. The patent No. 2088234 RU (13) C1 from 8/27/1997. (In Russ.)]
6. Красовский Г.Н., Юрасова О.И., Чарыев О.Г., и др. О распределении ртути и серебра в организме // Гигиена и санитария. — 1980. — Т. 1. — С. 69-71. [Kra-sovsky GN, Yurasov OI, Charyev OG, et al. About distribution of silver and mercury in the body. Gigiena isanitariya. 1980;1:69-71. (In Russ.)]
7. Методические указания МУ 1.2.2520-09. 1.2. Гигиена, Токсикология, Санитария. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов. — М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотреб-надзора, 2009. [Methodical instructions MU 1.2.252009. 1.2. Hygiene, Toxicology, Sanitation. Toxicological and hygienic assessment of safety of nanomaterials. Mops-cow: Federal'nyi tsentr gigieny i epidemiologii Rospotreb-nadzora; 2009. (In Russ.)]
8. Методические указания МУ 1.2.2635-10. 1.2. Гигиена, Токсикология, Санитария. Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов. — М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Рос-потребнадзора, 2010. [Methodical instructions MU 1.2.2635-10. 1.2. Hygiene, Toxicology, Sanitation. Medico-biological assessment of safety of nanomateri-als. Moscow: Federal'nyi tsentr gigieny i epidemiologii Rospotrebnadzora; 2010. (In Russ.)]
9. Общая токсикология / Под ред. А.О. Лойта. — СПб.: ЭЛБИ-СПб., 2006. — 224 с. [The general toxicology. Ed by A.O. Loit. Saint Petersburg: ELBI-SPb; 2006. 224 p. (In Russ.)]
10. Пиотровский Л.Б. Наномедицина как часть нано-технологий // Вестник Российской академии медицинских наук. — 2010. — № 3. — С. 41-46. [Piotrovskiy LB. Nanomedicine as part of the nanotechnology. Vestnik Rossi-iskoiakademiimeditsinskikhnauk. 2010;3:41-46. (In Russ.)]
11. Прогноз научно-технологического развития России: 2030. Новые материалы и нанотехнологии / Под. ред. Л.М. Гохберга, А.Б. Ярославцева. — М.: Министерство образования и науки Российской Федерации, Национальный исследовательский университет «Высшая школа экономики», 2014. — 52 с. [Forecast of scientific and technological development in Russia: 2030. New materials and nanotechnologies. Ed by L.M. Gokhberg, A.B. Yaroslavtsev. Moscow: Ministerstvo obrazovaniya i nau-ki Rossiiskoi Federatsii, Natsional'nyi issledovatel'skii univer-sitet "Vysshaya shkola ekonomiki"; 2014. 52 p. (In Russ.)]
12. Рамайя Л.К., Орджоникидзе К.Г., Егорова Е.М., Рубанович А.В. Генотоксические эффекты наночастиц серебра при воздействии на млекопитающих in vivo // Acta Naturae. 2009. — Т. 3. — С. 109-112. [Ramaiya LK, Ordzhonikidze KG, Egorova EM, Rubanovich AV. Genotox-ic effects of silver nanoparticles in vivo studies on mammals. Acta Naturae. 2009;3:109-112. (In Russ.)]
13. Справочник. Медицинские лабораторные технологии: в 2 т. / Под ред. А.И. Карпищенко. — Т. 1. — СПб.: Интермедика, 1998; Т. 2. СПб.: Интермедика, 1999. [Reference book. Medical laboratory technologies. In 2 vol. Ed by A.I. Karpishchenko. Vol. 1. Saint Petersburg: Intermedika; 1998. Vol. 2. Saint Petersburg: Intermedika; 1999. (In Russ.)]
14. Хамидулина Х.Х., Давыдова Ю.О. Международные подходы к оценке токсичности и опасности наночастиц и наноматериалов // Токсикологический вестник. — 2011. — № 6. — С. 53-57. [Khamidulina KhKh, Davydo-va YuO. International approaches to the evaluation of the toxicity and hazards of nanoparticles and nanomaterials. Toksikologicheskiivestnik. 2011;(6):53-57. (In Russ.)]
15. Энциклопедия клинических лабораторных тестов / Под ред. Н. Тица. — М.: Лабинформ, 1997. — 960 с. [The encyclopedia of clinical laboratory tests. Ed by N. Tits. Moscow: Labinform; 1997. 960 p. (In Russ.)]
16. Armitage S, White M, Wilson H. The determination of silver in whole blood and its application to biological monitoring of occupationally exposed groups. Ann Occup Hyg. 1996;40(3):331-338. doi: 10.1093/annhyg/40.3.331.
17. Borm P, Kreyling W. Toxicological hazards of inhaled nanoparticles — potential implications for drug delivery. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 2004;4(5):521-551. doi: 10.1166/jnn.2004.081.
18. Braydich-Stolle L. In vitro cytotoxicity of nanoparticles in mammalian germline stem cells. Toxicological Sciences. 2005;88(2):412-419. doi: 10.1093/toxsci/kfi256.
19. Cheng L, Jiang X, Wang J, et al. Nano-bio effects: interaction of nanomaterials with cells. Nanoscale. 2013;5(9):3547. doi: 10.1039/c3nr34276j.
20. Daniel S, Tharmaraj V, Sironmani T, Pitchumani K. Toxic-ity and immunological activity of silver nanoparticles. Applied Clay Science. 2010;48(4):547-551. doi: 10.1016/j. clay.2010.03.001/.
21. DaPonte J, Sadowski T, Broadbridge C, et al. Characterization of nanoparticles by computer imaging particle analysis. Nanomaterials Synthesis, Interfacing, and Integrating in Devices, Circuits, and Systems II. 2007. doi: 10.1117/12.734966.
22. Donaldson K, Stone V. Current hypotheses on the mechanisms of toxicity of ultrafine particles. Ann Ist Super Sanita. 2003;39(3):405-410.
23. Donaldson K, Stone V, Tran C, et al. Nanotoxicology. Occupational and Environmental Medicine. 2004;61(9): 727-728. doi: 10.1136/oem.2004.013243.
24. Greene RM, Su WPD. Am Fam Physician. 1987;36:151-154.
25. Lansdown A. Critical observations on the neurotoxicity of silver. Critical Reviews in Toxicology. 2007;37(3):237-250. doi: 10.1080/10408440601177665.
26. Li N, Sioutas C, Cho A, et al. Ultrafinep pollutants induce oxidative stress and mitochondrial damage. Environ Health Perspect. 2002;111(4):455-460. doi: 10.1289/ ehp.6000.
27. Nel A, Xia T, Madler L, Li N. Toxic potential of materials at the nanolevel. Science. 2006;311(5761):622-627. doi: 10.1126/science.1114397.
28. Oberdörster G, Oberdörster E, Oberdörster J. Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles. Environ Health Perspect. 2005;113(7):823-839. doi: 10.1289/ehp.7339.
29. Panyala NR, Pena-Mendez EM, Havel J. Silver or silver nanoparticles: a hazardous threat to the environment and human health. JApplBiomed. 2008;6(3):117-129.
30. Rogers E, Hsieh S, Organti N, et al. A high throughput in vitro analytical approach to screen for oxidative stress potential exerted by nanomaterials using a biologically relevant matrix: Human blood serum. Toxicology in Vitro. 2008;22(6):1639-1647. doi: 10.1016/j. tiv.2008.06.001.
31. Rosenman K, Seixas N, Jacobs I. Potential nephrotoxic effects of exposure to silver. Occupational and Environmental Medicine. 1987;44(4):267-272. doi: 10.1136/ oem.44.4.267.
32. Rungby J, Danscher G. Localization of exogenous silver in brain and spinal cord of silver exposed rats. Acta Neuropathologica. 1983;60(1-2):92-98. doi: 10.1007/bf00685352.
33. Rungby J, Danscher G. Neuronal accumulation of silver in brains of progeny from argyric rats. Acta Neuropathologica. 1983;61(3-4):258-262. doi: 10.1007/bf00691995.
34. Seung-heon S, Mi-kyung Y, Jeung-kyu K. The effects of nano-silver on the proliferation and cytokine production in peripheral blood mononuclear cells. J Rhinol. 2006;45:269.
35. Sharifi S, Behzadi S, Laurent S, et al. Toxicity of nanomaterials. Chem Soc Rev. 2012;41(6):2323-2343. doi: 10.1039/c1cs15188f.
36. Shin S, Ye M, Kim H, Kang H. The effects of nano-silver on the proliferation and cytokine expression by peripheral blood mononuclear cells. International Immunopharmacology. 2007;7(13):1813-1818. doi: 10.1016/j.intimp.2007.08.025.
37. Stark W. Nanoparticles in biological systems. Angewandte Chemie International Edition. 2011;50(6):1242-1258. doi: 10.1002/anie.200906684.
38. Vance M, Kuiken T, Vejerano E, et al. Nanotechnology in the real world: Redeveloping the nanomaterial consumer products inventory. Beilstein J Nanotechnol. 2015;6:1769-1780. doi: 10.3762/bjnano.6.181.
39. Venugopal B, Luckey TD (eds.). Metal toxicity in mammals. In: Chemical Toxicity of Metals and Metalloids. Chapter 1. New York: Plenum Press; 1978. P. 32-36.
40. Woehrle GH, Hutchinson JE, Özkar S, Finke RG. Analysis of nanoparticle transmission electron microscopy data using a public- domain image-processing program, image. Turk J Chem. 2006;30:1-13.
41. http://emergingtech.foe.org.au/190/.
42. http://www.epa.gov/iris/subst/0099.htm#reforal.
43. http://www.silvermedicine.org/.
44. http://www.sintvita.ru/products/povidone12600.html.
♦ Информация об авторах
Орхан Ахмедович Зейналов — канд. биол. наук, главный специалист ООО «НПК«СКиФФ», Москва. E-mail: office@skiff-pharm.ru.
Светлана Петровна Комбарова — канд. биол. наук, старший научный сотрудник ООО «НПК«СКиФФ», Москва. E-mail: kombarsv@rambler.ru.
Дмитрий Владимирович Багров — канд. физ.-мат. наук, научный сотрудник кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва. E-mail: dbagrov@gmail.ru.
Мария Анатольевна Петросян — канд. биол. наук, старший научный сотрудник гр. фармакологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург E-mail: mariya@labpharm.spb.ru.
ГулрухсорХайбуллоевна Толибова — канд. мед. наук, старший научный сотрудник лаб. клеточной биологии отдела пато-морфологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург. E-mail: gulyatolibova@yandex.ru.
Алексей Валерьевич Феофанов — д-р биол. наук, профессор кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва. E-mail: avfeofanov@yandex.ru.
♦ Information about the authors
Orkhan A. Zeinalov — PhD, Chief Specialist, Research and Production Company "SK&FF" Ltd, Moscow, Russia. E-mail: office@skiff-pharm.ru.
Svetlana P. Kombarova — PhD, Senior Researcher, Research and Production Company "SK&FF" Ltd, Moscow, Russia. E-mail: kombarsv@rambler.ru.
Dmitry V. Bagrov — PhD, Researcher at the Department of Bioengineering, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia. E-mail: dbagrov@gmail.com.
Mariya A. Petrosyan — PhD, Senior Researcher at the Laboratory of Pharmacology D.O. Ott Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology, Saint Petersburg, Russia. E-mail: mariya@labpharm.spb.ru.
GulrukhsorH. Tolibova — PhD, MD, Senior Researcher at the Laboratory of Cell Biology, Department of Pathomorphology. D.O.Ott Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology, Saint Petersburg, Russia. E-mail: gulyatolibova@yandex.ru.
Alexey V. Feofanov — Dr. Sci., Professor at the department of bioengineering, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia. E-mail: avfeofanov@yandex.ru.
КонстантинВольдемаровичШайтан — д-р физ.-мат. наук, про- Konstantin V. Shaitan — Prof., Dr. Sci., Professor at the фессор кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ department of bioengineering, Lomonosov Moscow State им. М.В. Ломоносова, Москва. E-mail: shaytan49@yandex.ru. University, Moscow, Russia. E-mail: shaytan49@yandex.ru.
