CC BY
67
УДК 576.08
О ВЛИЯНИИ ДИМЕФОСФОНА НА МОРФОЛОГИЮ МОЗЖЕЧКА БЕЛОЙ
КРЫСЫ
И.Д. Ипастова, Н.П. Перфильева
В статье приведены результаты морфометрического исследования головного мозга и мозжечка здоровых белых половозрелых крыс, которым в течение длительного времени вводили лекарственный препарат димефосфон. Результаты этой работы представляют собой научный и практический интерес, поскольку, с одной стороны, этот фосфорсодержащий препарат вот уже более 30 лет успешно используют в клинической практике, тогда как с другой стороны, многие исследователи уверены в том, что большинство синтетических фосфорорганических соединений нейротоксичны.
Ключевые слова: димефосфон, мозжечок, белая крыса, морфология, морфометрия, фосфор
Димефосфон (диметиловый эфир 1,1-диметил-3-оксобутилфосфоновой кислоты) — фосфорорганическое соединение (ФОС), впервые синтезированное в 1952 году в Казани в институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова и в 1983 году разрешенное к промышленному выпуску для лечебных целей [1]. В настоящее время в России применение димефосфона в клинической практике регламентировано Регистром лекарственных средств (2014). Этот отечественный препарат широко используют при травмах и различных заболеваниях нервной системы, в том числе при нарушениях мозгового кровообращения, для нормализации функциональной активности мозга при послеоперационных и посттравматических церебральных нарушениях, нейрохирургической операционной и черепно-мозговой травмах, болезни Меньера и вегетативной дисфункции в качестве вазоактивного средства.
Однако терапевтические эффекты димефосфона у некоторых исследователей вызывают скептическое отношение, поскольку принято полагать, что большинство синтетических ФОС нейротоксичны — они угнетают ключевой фермент нейромедиаторного обмена ацетилхолинэстеразу с последующим ингибированием нейромедиатора ацетилхолина и несостоятельностью всей нейрогуморальной регуляции [2]. Кроме того, в научной литературе мы обнаружили сведения, что ФОС обусловливают различные патогистоморфологические изменения в ЦНС и, в частности, в мозжечке [3,4,5]. Так, например, установлено, что при воздействии ФОС в мозжечке крыс происходят дегенеративные процессы в клетках-зернах: их форма искажается до овальной или грушевидной, происходит хроматолиз, пикноз и отек перикарионов, некроз. Поскольку вопрос безопасности димефосфона относительно морфологии нервной ткани до настоящего времени оставался без внимания (публикаций на этот счет в доступной нам научной медицинской литературе мы не обнаружили), мы провели экспериментальное исследование. Цель исследования состояла в изучении влияния димефосфона на морфологию мозжечка. В ходе работе были решены следующие задачи: определены макро- и микроморфометрические показатели мозжечка у половозрелых белых здоровых крыс, получающих и не получающих димефосфон; проведен сравнительный анализ морфометрических показателей; установлено, оказывает ли препарат негативное влияние на морфологию мозжечка.
Методы исследования. В работе были использованы 90 половозрелых белых крыс. Животных произвольно разделили на три равные по численности группы: контрольную (КГ) и две экспериментальных (ЭГ-1 и ЭГ-2). Экспериментальным крысам в течение 10 дней внутрибрюшинно вводили димефосфон один раз в день в следующих количествах: ЭГ-1 — в терапевтической дозе 500 мг/кг; ЭГ-2 - в летально-токсической дозе DL5o - 2500 мг/кг. После убоя животных и анатомического препарирования головного мозга и мозжечка проводили морфометрическое исследование: вычисляли их объем, массу при помощи
взвешивания на аналитических весах, высоту, длину и ширину посредством штангенциркуля; у мозжечка также определяли длину и ширину червя и полушарий. Рассчитывали процентное отношение объёма и массы мозжечка к головному мозгу
Затем изготовляли гистологические срезы толщиной 5-9 мкм, окрашивали гематоксилином-эозином и азотнокислым серебром по методу Бильшовского-Грос. Дальнейшее микроморфометрическое исследование проводили при помощи окулярной линейки, сетки и окуляр-микрометра МОВ-1-15х с рассчитанной при помощи объект-микрометра ценой деления; а также планиметра. Определяли диаметр извилин на их вершине, в середине и у основания, высоту и расстояние между ними, толщину коры мозжечка и ее слоёв, белого вещества, большой и малый диаметры клеток Пуркинье, диаметр их ядер, нейроглиальный индекс (НГИ). По формулам вычисляли количество извилин на 1 мм2 поверхности мозжечка, процентное соотношение белого и серого вещества, объём цитоплазмы и ядер клеток Пуркинье, ядерно-цитоплазменное отношение (ЯЦО). Формулы, по которым проводили расчёты, приведены в статье, посвященной макро- и микроморфологии мозжечка белой крысы [6]. Рассчитывали средние арифметические величины и их среднеквадратичные отклонения (М±ш).
Результаты исследования.
Макроморфология головного мозга и мозжечка. Как показали результаты исследования, при введении димефосфона крысам у них изменяются макроморфометрические показатели головного мозга и мозжечка (табл. 1). Так, использование димефосфона в терапевтических дозах приводит к незначительному увеличению объема и массы головного мозга на 1,2 и 0,6% соответственно, тогда как применение препарата в летально-токсических дозах обусловливает существенный рост этих показателей на 8,6 и 4%, а также увеличение ширины головного мозга— на 3,6%, высоты — на 2,2%, длины — на 1,3% (рис. 1).
Что касается мозжечка, следует отметить, что макроморфометрические показатели не только у крыс из группы ЭГ-2, но и ЭГ-1 существенно отличаются от таковых у контрольных животных. У грызунов, получавших димефосфон в летально-токсических дозах, объём и масса мозжечка увеличиваются на 4,8 и 8,3% соответственно, линейные показатели также возрастают: ширина — на 2,6%, длина — на 4,7%, высота — на 2%, длина и ширина червя — на 2,5%, длина и ширина полушарий — на 4 и 11,4%. При введении препарата в терапевтических дозах наблюдается противоположная динамика: объем и масса мозжечка уменьшаются на 9,5 и 8,3%, длина — на 1,6%, ширина — на 0,7%, высота — на 2%; длина и ширина червя - на 2,5%, длина и ширина полушарий - на 2%. Все это отражается на относительной массе и объёме мозжечка: так, например, введение препарата в терапевтических дозах способствует уменьшению этих показателей в среднем на 1%.
Таким образом, применение димефосфона у здоровых крыс отражается на макроморфологии головного мозга и мозжечка следующим образом. Во-первых, при длительном воздействии препарата как в терапевтической, так и в летально-токсических дозах все макроморфометрические показатели головного мозга (объем, масса, линейные показатели) возрастают. Примечательно, что чем выше дозировка лекарственного средства, тем выраженнее эти изменения. Во-вторых, аналогичные макроморфометрические показатели мозжечка при введении летально-токсической дозы увеличиваются от 2 до 11,4%, при введении терапевтических доз — уменьшаются от 0,7 до 10,5%.
Табл. 1. Макроморфометрические показатели головного мозга и мозжечка белых крыс в норме и при воздействии димефосфона (М±м) р<0,05
———Группы животных Параметры ——^^ КГ ЭГ-1 ЭГ-2
Головной мозг
Объем, мл3 1,62±0,02 1,64±0,15 1,76±0,17
Масса, г 1,73±0,04 1,74±0,03 1,80±0,03
Ширина, см 1,40±0,06 1,42±0,03 1,45±0,03
Длина, см 2,39±0,08 2,33±0,05 2,36±0,08
Высота, см 0,90±0,03 0,88±0,03 0,92±0,02
Мозжечок
Объем, мл3 0,21±0,06 0,19±0,01 0,22±0,01
Масса, г 0,24±0,02 0,22±0,01 0,26±0,01
Ширина, см 1,11±0,05 1,50±0,01 1,15±0,01
Длина, см 0,64±0,01 0,63±0,01 0,67±0,01
Высота, см 0,51±0,01 0,50±0,01 0,52±0,01
Длина червя, см 0,84±0,02 0,82±0,03 0,86±0,02
Ширина червя, см 0,38±0,02 0,37±0,01 0,39±0,02
Длина полушария, см 0,50±0,01 0,49±0,02 0,52±0,03
Ширина полушария, см 0,35±0,01 0,37±0,01 0,39±0,01
Масса мозжечка от массы головного мозга, % 13,87 12,64 14,44
Объем мозжечка от объема головного мозга, % 12,96 11,60 12,50
Объем Масса
головного головного Объем Масса
мозга мозга мозжечка мозжечка
10 +8,6% +8,3%
8 ЭГ-1
6 +4% + + 4,8% 4,8%
4 п 0 +1,2% +0,6% ЭГ-2
-2 -4 -6 -8 |
-10 -12 9,5% 8,3%
Рис. 1. Изменение массы и объема головного мозга и мозжечка у экспериментальных белых крыс
Микроморфология мозжечка
Результаты последующих морфометрических измерений мозжечка подтвердили выявленную нами закономерность, что при введении димефосфона крысам в терапевтических дозах снижаются его объём, масса и линейные показатели. Так, у крыс ЭГ-1 уменьшается высота вторичных извилин на 21,5%, диаметр — на 19,2%, расстояние между ними — на 35% (табл. 2, рис. 2). Вместе с этим снижается и толщина белого вещества на 33,3%, коры — на 5,9% и, в частности, зернистого и молекулярного слоев — на 18,7 и 5,8% соответственно. При этом отношение площади серого вещества к площади извилины остаётся практически неизменным, хотя в целом площадь извилин сокращается почти на 7% (в том числе коры — на 7,6%), а площадь белого вещества возрастает на 20%. Количество извилин на 1 мм2 поверхности мозжечка увеличивается на 76,8%.
Многократное введение крысам летально-токсических доз препарата приводит к дальнейшему снижению большинства микроморфологических показателей. В частности, высота извилин сокращается на 36,9%, диаметр — на 24,4%, расстояние между ними — на 40%. Вместе с этим уменьшается толщина белого вещества на 50%, коры — на 8,8% (зернистого и молекулярного слоев — на 12,5 и 5,8% соответственно). Кроме того, введение летально-токсических доз приводит к изменению процентного содержания серого вещества в мозжечке в сторону увеличения на 2,7%. Плотность извилин возрастает на 67,5%.
Обобщая, следует заключить, что многократное использование димефосфона приводит к уменьшению большинства основных микроморфометрических показателей
мозжечка (высоты, диаметра и расстояния между извилинами, толщины белого и серого вещества) при значительном росте количества извилин на единицу площади. В частности, при использовании препарата в терапевтических дозировках различные морфометрические показатели уменьшаются от 5 до 20%, при введении препарата в летально-токсических дозах — от 6 до 40%.
Табл. 2. Микроморфометрические показатели извилин мозжечка белых крыс в норме и при воздействии димефосфона (М±м) р<0,05_
Группы животных Параметры " —-— КГ ЭГ-1 ЭГ-2
Извилины
Высота извилин, мм 1,49±0,10 1,17±0,21 0,94±0,01
Диаметр извилины на вершине, мм 0,43±0,01 0,39±0,02 0,35±0,01
Диаметр извилин у основания, мм 0,78±0,05 0,63±0,03 0,59±0,05
Средний диаметр извилины, мм 0,61±0,01 0,51±0,01 0,47±0,03
Расстояние между извилинами, мм 0,20±0,04 0,13±0,02 0,12±0,02
Площадь, мм2 0,72±0,14 0,67±0,07 0,71±0,11
Удельная площадь 8,46±0,02 13,92±0,03 13,97±0,01
Площадь белого вещества, мм2 0,05±0,01 0,06±0,01 0,04±0,01
Площадь серого вещества, мм2 0,66±0,14 0,61±0,07 0,68±0,10
Отношение площади серого вещества к извилине, % 91,71 91,04 94,37
Количество извилин на 1 мм2 11,75±0,01 20,78±0,03 19,68±0,04
Составляющие извилины
Толщина коры, мм 0,34±0,02 0,32±0,01 0,31±0,01
Толщина зернистого слоя, мм 0,16±0,02 0,13±0,01 0,14±0,01
Толщина молекулярного слоя, мм 0,17±0,01 0,16±0,01 0,16±0,01
Толщина белого вещества, мм 0,09±0,03 0,06±0,01 0,04±0,01
Рис. 2. Изменение морфометрических показателей извилин мозжечка у экспериментальных белых крыс
Цитоархитектоника.
У экспериментальных крыс в сравнении с контрольными плотность нейронов коры мозжечка оказывается существенно ниже. Наименьшее количество нервных клеток выявлено у грызунов, многократно получавших димефосфон в летально-токсических дозах. Плотность нейронов молекулярного слоя у крыс ЭГ-1 и ЭГ-2 уменьшилась на 27,8 и 29% соответственно, зернистого слоя — на 9,1 и 14%, ганглионарного — на 28% и 48% (табл. 3, рис. 3). Что касается последних, замечено, что у крыс экспериментальных групп, в особенности ЭГ-2, стройные ряды плотно расположенных друг к другу клеток Пуркинье поредели, на их месте образовались пустоты, дегенерирующие клетки, клетки-тени, соединительная ткань. Похожую картину наблюдали и в зернистом слое: в норме равномерно расположенные клетки-зерна у крыс ЭГ-2 располагаются хаотично — компактными группами, разреженно.
Кроме этого, у экспериментальных крыс уменьшаются объемы перикарионов и ядер нейронов Пуркинье: при введении терапевтических доз препарата эти изменения незначительны, при использовании летально-токсических доз — наиболее выражены. У животных ЭГ-1 объем тел нейронов остается практически неизменным, объем ядра уменьшается на 9%, что приводит к росту ЯЦО (табл. 4). По всей видимости, это свидетельствует о замедлении синтеза обеспечивающих жизненные процессы в нейронах белков и функционирования самих нервных клеток. На этом фоне НГИ возрастает на 3,2%, что, по всей видимости, обусловлено реагированием глиоцитов на воздействие димефосфона размножением и активным функционированием этих клеток. У крыс ЭГ-2 несоответствие морфометрических показателей нейронов значениям нормы еще более выражены: объем перикарионов и ядер нейронов Пуркинье уменьшаются на 11,6 и 49%, ЯЦО снижается на 42%. Более того, НГИ уменьшается на 13,7%, что указывает на снижающуюся активность глиоцитов и их гибель.
Таким образом, длительное воздействие димефосфона на организм здоровых половозрелых крыс как в терапевтических, так и в летально-токсических дозах приводит к следующим морфологическим изменениям в мозжечке.
1. Уменьшается плотность нейронов коры мозжечка, при этом наиболее чувствительными к действию димефосфона оказываются нейроны Пуркинье и корзинчатые клетки.
2. Снижается объем тел и, в особенности, ядер нейронов Пуркинье.
Табл. 3. Плотность нейронов коры мозжечка в норме и при воздействии
димефосфона (М±м) р<0,05
Количество клеток на 1 мм2 КГ ЭГ-1 ЭГ-2
Клетки Пуркинье 30,36±2,71 22,00±1,81 15,84±1,11
Корзинчатые нейроны 128, 00±10,35 92,56±8,79 90,64±7,34
Клетки-зерна 1029,32±46,51 935,08±42,59 878,04±35,21
Табл. 4. Морфометрическая характеристика клеток Пуркинье в норме и при воздействии димефосфона (М±м) р<0,05_
^^^^^^ Группы Параметры КГ ЭГ - 1 ЭГ - 2
Объем цитоплазмы, тыс. мкм3 64,71±0,01 65,53±0,01 57,21±0,01
Объем ядра, тыс. мкм3 11,40±0,02 10,41±0,02 6,10±0,02
ЯЦО 0,19±0,03 0,20±0,01 0,11±0,03
НГИ 6,16±0,30 6,36±0,28 5,32±0,39
Рис. 3. Изменение морфометрических показателей нейронов коры мозжечка
у экспериментальных крыс
Выводы.
В завершение следует отметить, что многократное введение димефосфона здоровым животным обусловливает отклонение морфометрических показателей мозжечка от нормы и проявляется как на макроморфологическом уровне организации — изменением объема и массы мозжечка, так и на микромофологическом - уменьшением размеров извилин, толщины белого и серого вещества, плотности и величины нейронов коры. Эти адаптационно-структурные изменения нервной ткани наиболее выражены при введении препарата крысам в летально-токсических дозах.
Как полагают некоторые исследователи, выявившие негативное влияние других ФОС на морфологию мозжечка крысы, в их основе лежит следующий механизм. В процессе метаболизма ФОС образуются активные производные, которые, во-первых, нарушают целостность ДНК нейронов, вступая с ДНК в реакцию метилирования и, во-вторых, блокируют механизмы восстановления ДНК нервных клеток [6]. По всей видимости, этот механизм справедлив и для димефосфона, при воздействии которого на организм лабораторных крыс уменьшается плотность и размеры нейронов мозжечка, что объясняет также изменение и других морфометрических показателей мозжечка.
И тем не менее, в контексте проблемы негативного влияния димефосфона на морфологию мозжечка крысы нельзя не учитывать, что димефосфон более чем за 30 лет использования в клинической практике хорошо зарекомендовал себя в различных клинических ситуациях и к настоящему времени известно о многочисленных благоприятных свойствах этого фосфорорганического препарата — вазоактивных, антиацидотических, антиоксидантных, антигипоксических, противовоспалительных, ранозаживляющих, бактериостатических, иммунокорригирующих, антиаритмических, нейротропных [1,2,7].
The article presents the results of the morphometric study of the brain and cerebellum healthy white adult rats who received prolonged periods of dimephosphone. The results obtained are of scientific and practical interest since, on the one hand, the phosphorus-containing medication for more than 30 years successfully used in clinical practice, while on the other hand, many researchers believe that most synthetic organophosphorus compounds are neurotoxic.
Key words: dimephosphone, cerebellum, white rat, morphology, morphometry, phosphorus
Список литературы
1. Гараев РС. Изыскание новых лекарственных средств в рядах фосфорорганических соединений / РС. Гараев // Казанский государственный медицинский университет. - 2008. - № 5. - С. 585-590.
2. Малышев В.Г. Влияние димефосфона на гомеостаз организма: монография / В.Г. Малышев, И.В. Федосейкин. - Москва: Наука, 2007. - 215 с.
3. Fonnum F. The contributions of excitotoxicity, glutathione depletion and DNA repair in chemically induced injury to neurones: exemplified with toxic effects on cerebellar granule cells / F. Fonnum, E.A. Lock // J. Neurochem. -2004. - Vol. 88(3). - P. 513-531.
4. Mehl A. The effect of trichlorfon and methylazoxymethanol on the development of guinea pig cerebellum / A. Mehl, T.M. Schanke, A. Torvik [et al.] // Toxicol. Appl. Pharmacol. -2007. - Vol. 219(2-3). - P. 128-35.
5. Hazarika R. Neurotoxic impact of organophosphate pesticide phosphomedon on the albino rat / R. Hazarika // J. Environ. Biol. - 2014. - Vol. 35(2). - P. 427-430.
6. Fonnum F. Cerebellum as a target for toxic substances / F. Fonnum, E.A. Lock // Toxicol. Lett. - 2000. - Vol. 112-113. - P. 9-16.
7. Анчикова Л.И. К механизму действия отечественного препарата димефосфона / Л.И. Анчикова, И.Х. Валеева, И.А. Студенцова // Казанский медицинский журнал. - 2005. - Т. 86. - № 2. - С. 92-97.
Об авторах
Ипастова И.Д. - аспирантка кафедры анатомии, физиологии и гигиены человека ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный педагогический университет», [email protected]
Перфильева Н.П. - доктор биологических наук, профессор кафедры анатомии, физиологии и гигиены человека ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный педагогический университет»
