О природе изотопного эффекта при карбоксилировании РиБФ в процессе фотосинтетической ассимиляции Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

химия

Известия ТСХА, выпуск 3, 2008 год

УДК 581.132.04:539.16.04

О ПРИРОДЕ ИЗОТОПНОГО ЭФФЕКТА ПРИ КАРБОКСИЛИРОВАНИИ РИБФ В ПРОЦЕССЕ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОЙ АССИМИЛЯЦИИ

А.А. ИВЛЕВ, д. б. н.; А.В. БОЧКАРЕВ, к. х. н.

(Кафедра неорганической и аналитической химии)

Проведен расчет и дан анализ достижимого коэффициента разделения изотопов углерода в реакции ферментативного карбоксилирования РиБФ (а,). С этой целью, используя квантово-химический ограниченный метод Хартри — Фока (базис RHF/6-311++G**; 3df,3p) в программном комплексе PC GAMESS, были рассчитаны геометрия и частоты колебаний, а с помощью последних — отношения приведенных статистических сумм ф-факторов) для молекулы СО2 и переходного комплекса. Полученное значение а,-=1,047 соответствовало значениям этой реакции в опытах in vitro, но оказалось значительно больше обогащений биомассы изотопом 12С, наблюдаемых in vivo. Этот результат позволяет допустить, что в живой клетке возможно возникает эффект противоположного знака в другой реакции, компенсирующий влияние эффекта карбоксилирования РиБФ.

Изучение in vitro изотопного эффекта карбоксилирования рибулозо-бисфосфата (РиБФ) — ключевой реакции фотосинтетической ассимиляции С02—вызвано необходимостью объяснить наблюдаемое обогащение биомассы фотосинтезирующих организмов изотопом 12С. В 1961 г. Парк и Эпстайн [21], впервые выделив фермент РиБФ-карбоксилазу из листьев томата в на-тивной форме, провели реакцию кар-боксилирования РиБФ in vitro и получили значение (17%о), которое с учетом предполагаемого изотопного эффекта диффузии С02 в клетку (4%о), позволило объяснить наблюдаемое обогащение биомассы растений легким изотопом. Однако последующие опыты in vitro, проведенные на карбоксилазах, выделенных из разных растений (рис. 1), дали неожиданно большие величины эффекта, намного превышающие наблюдаемое обогащение и нередко составлявшие 60~80%о [12, 15, 30] , а в некоторых опытах — до 100%о [30].

Естественно, возник вопрос о причинах столь больших различий. Ответы на него оказались разными. Одни считали [15, 23, 24, 29], что фракционирование изотопов углерода in vitro существенно отличается от фракционирования in vivo из-за условий протекания реакции, меняющих контролирующую скорость стадию, с которой связана величина изотопного эффекта. Другие полагали [6, 7, 19], что в клетке возникает иной эффект противоположного знака, компенсирующий обогащение биомассы изотопом 12С. Помощь в получении правильного ответа могла бы дать теоретическая оценка величины изотопного эффекта.

Теоретическая оценка величины изотопного эффекта, определяемого через коэффициент изотопного фракционирования реакции [8], сопряжена с некоторыми трудностями. Они связаны с двумя причинами: 1) недостаточной изученностью механизма ферментативной реакции, обусловленной ее

Рис. 1. Сопоставление изотопных эффектов углерода при ферментативном карбокси-лировании РиБФ на карбоксилазах, выделенных из различных фотосинтезирующих организмов с реальным обогащением биомассы этих организмов изотопом 12С (по данным работы [5])

многостадийностью; 2) приближенностью расчета самого кинетического изотопного эффекта на контролирующей скорость эффектзадающей стадии («intrinsic isotope effect»).

В связи с вышесказанным значительный интерес представляет оценка максимально достижимых значений величин эффективных коэффициентов изотопного фракционирования ае/ в реакциях ферментативного карбоксилирова-ния РиБФ. Она должна быть близкой к величине кинетического изотопного эффекта на контролирующей скорость стадии. Ее расчет мог бы помочь установлению причины изотопных различий in vitro и in vivo и, таким образом, дать новую информацию о механизме фотосинтетической ассимиляции.

Анализ имеющихся величин коэффициентов изотопного фракционирования выявил большой разброс значений Ое/, обусловленный упомянутыми причинами. В самом деле, в ферментативной реакции, которая обычно состоит из нескольких элементарных стадий, изотопный эффект проявляется лишь тогда, когда на стадии, контролирующей скорость реакции, возникает конкуренция изотопных молекул. Чем больше вклад в общую скорость реакции стадий, где эффекта нет, тем слабее проявляется вклад эффектзадающей стадии. Условия протекания реакции в организмах различаются, и это меняет вклад разных стадий в общую скорость реакции, чем и обусловлены колебания величин изотопных эффектов.

Другая причина, как отмечалось, связана с приближенностью оценки кинетического изотопного эффекта, основанной на теории абсолютных скоростей реакций [2]. Последняя в основном связана с неполнотой сведений о структуре и силовых постоянных переходного комплекса и порождает субъективизм в оценке этих параметров и в конечном счете приводит к неточностям в оценке коэффициента кинетического изотопного эффекта на контролирующей скорость стадии а1.

Косвенную оценку а1 в реакции кар-боксилирования РиБФ дали Роеске и О'Лири [24]. Учитывая многостадий-ность ферментативных реакций, они представили изотопный эффект при ферментативном карбоксилировании

РиБФ (аД как состоящий из эффекта на эффектзадающей стадии, где происходит конкуренция изотопных молекул (а1), и вклада стадий, не чувствительных к изотопному замещению.

ае/=(а,+/>)/(1 +Р), (1)

где р — фактор, учитывающий влияние стадий, не чувствительных к изотопному замещению по 13С.

Коэффициент ае} связан с величиной наблюдаемой изотопной дискриминации Д13С соотношением ае/ = (1 + + Д13С • 10'3). Приняв величину Д13С, определяемую экспериментально, равной 29%о [7], а величину р, по ряду соображений, равной 0,6, авторы получили величину а, = 1,040. Однако такая оценка субъективна, поскольку соображения авторов при выборе р были субъективны. Кроме того, она основывается на априорном представлении, что наблюдаемая обогащенность биомассы изотопом 12С обусловлена только ассимиляцией, что не является бесспорным фактом.

Другую попытку оценить достижимые значения изотопных эффектов в реакции ферментативного карбоксили-рования РиБФ (а1) предприняли Ив-лев и Князев [5], воспользовавшись кинетической схемой реакции, пред-

ложенной Рубиным и Гавриленко [9]. Согласно этой схеме, при ассимиляции вначале на одном из активных центров фермента происходит связывание молекулы С02. Затем на другом активном центре фермента связывается молекула РиБФ, после чего между ними происходит взаимодействие. В результате образуется неустойчивое промежуточное соединение 2-карбо-кси-3-кето-арабинол, деструкция которого приводит к образованию двух молекул ФГК. Контролирующей скорость стадией, на которой возникает изотопный эффект, считалось превращение С02 в карбоксильную группу с разрыхлением и деструкцией одной из 71-связей молекулы, при котором молекула из линейной превращалась в угловую. В пользу этого свидетельствовали высокая стабильность молекулы С02, наличие у нее большого числа возможных резонансных структур, а также то, что энергия, затрачиваемая на разрушение ее связей и образование угловой молекулы, значительно (на 7 ккал [14]) превышает энергию, которая выделяется при образовании новой карбоксильной группы. Полученные значения эффекта составили 80-100%о и перекрыли весь диапазон значений достижимых эффектов, наблюдаемых в опытах in vitro. Однако, как выяснилось позднее, кинетическая схема реакции, которой придерживались авторы, оказалась иной.

Дальнейшие исследования [10, 11, 18, 22, 25] установили другую последовательность элементарных стадий (см. рис. 2). Было доказано, что кар-боксилирование РиБФ включает 9 стадий. Вначале с ферментом связывается РиБФ и лишь на пятой стадии (см. рис. 1) под воздействием иона Mg+2 и ферментсвязанного РиБФ происходит фиксация С02 на активном центре фермента. Одна из п-связей С=0 разрыхляется, на углеродном атоме появляется положительный заряд. Сама молекула из линейной превращается

в угловую. Кроме того, возникает связь С-С между углеродом С02 и одним из углеродных атомов РиБФ, находящимся на конце кратной связи. Соответствующая схема модельной конгруэнтной реакции имеет вид:

(Xef — &гиэ~ 13-Кз/12-Кз,

(5)

где С — концентрация молекул С02.

Если считать стадию 3 связывания С02 с ферментом частично обратимой, можно записать следующее выражение для эффективного коэффициента изотопного фракционирования

aef = a, (13Jc.3+ к<)/( 12fc.3 + Ы (3)

где Ok = 12K3/13K3 — кинетический коэффициент изотопного фракционирования на стадии 3 чувствительной к изотопному замещению («intrinsic isotope effect»), K4 — константа скорости, которая характеризует стадию, не чувствительную к изотопному замещению.

Из анализа выражения (2) легко обнаружить два предельных случая. Первый, когда обратимостью стадии 3 можно пренебречь. Выражение (3) в этом случае можно представить как

Oef = (Xi = 12к3/13к3,

(4)

т.е. изотопный эффект ферментативной реакции равен кинетическому изотопному эффекту стадии, где происходит необратимая деструкция связи

Второй предельный случай соответствует установлению равновесия на стадии 3. Коэффициент изотопного фракционирования в этом случае равен отношению изотопных констант равновесия на этой стадии.

где К3 — упомянутая константа равновесия.

Второй случай не представляет интереса ввиду доказанности существенной обогащенности фиксируемого углерода «легким» изотопом, что противоречит равновесному распределению между С02 и карбоксильной группой. В этом случае [4] фиксируемый углерод должен был бы обогащаться изотопом 13С, а не 12С фсо2 < Рсоон).

Таким образом, для оценки достижимых величин аеР с учетом результата проведенного анализа, необходимо оценить величину а^ Она рассчитывается через термодинамические функции (р-факторы, приведенные суммы по состояниям) молекулы С02 (Рсо2) и переходного комплекса (Р°) (термодинамическое приближение):

веденные частоты для реагирующей молекулы С02 и переходного комплекса соответственно.

Тогда с учетом (6) выражение для а1 можно записать

Для частного случая, когда рассматривается деструкция связи и структура переходного комплекса совпадает со структурой реагирующей молекулы выражение (9) после сокращения одинаковых частот преобразуется к виду:

ехр(1/2<2J 1 - exp(-uf2)

или

sh - щл sh ^ «<>s

(12)

Расчет (3-фактора С02 не представляет сложности. Неопределенным является расчет Р®-фактора переходного комплекса. В этом определяющую роль играет выбор переходного комплекса. Тапиа и др. [25] представили его как результат взаимодействия еноль-ной формы ферментсвязанного РиБФ

с б+поляризованным углеродным атомом С02. Ферментсвязанную форму РиБФ моделировали молекулой 2,3,4-тригидрокси-2-пентеном. Квантово-хи-мическим методом ab initio авторы рассчитали энергетический профиль реакции и определили мнимую частоту, соответствующую переходу через седловину потенциальной поверхности в точке, где возникает переходный комплекс. При этом сама реакция рассматривалась как электрофильная атака поляризованного С02 на С-2 атом дие-нола. Мнимая частота переходного комплекса оказалась равной 395 г. Воспользовавшись результатами расчета и соотношением, связывающим мнимые частоты изотопных форм (как корень квадратный из приведенных масс [8]), Черкез и Фаркуар [27] получили для мнимой частоты изотопной формы значение 382 г. Затем с помощью выражения (12) оценили коэффициент а,

Более грубое приближение получается, если принять, что апериодическая мнимая частота в переходном комплексе и соответствующая ей реальная частота в реагирующей молекуле приблизительно равны и тогда первые два сомножителя сократятся, а выражение (10) примет вид

ехр(1 / 2и{1) 1 - ехр(-ии) а.--г—. . л* . ' --:—— (11)

величину которого использовали для обоснования более низких, чем считалось, значений изотопных эффектов in vitro и близости этих значений к эффектам in vivo, что означало признание ключевой роли изотопного эффекта фотосинтетической ассимиляции в наблюдаемом обогащении биомассы.

Однако полученный результат и следующие из него выводы вызывают сомнение по следующим причинам. Во-первых, выражение (12), которое использовали авторы не может быть применено, поскольку оно получено для случая, когда структуры переходного комплекса и молекулы С02 совпадают и частоты изотопных форм переходного комплекса и молекулы С02 в выражении (12) сокращаются. В рассматриваемом случае это не так. Во-вторых, в выражение (12) входят реальные изотопные частоты колебания

молекулы С02, которая соответствует мнимой частоте апериодического колебания вдоль координаты реакции. Авторы вместо них использовали мнимые изотопные частоты. В-третьих, приближение (12) в этом случае вообще нельзя использовать, так как в переходном комплексе, помимо мнимых частот, появляются реальные частоты колебаний, не совпадающие с частотами С02, которые также вносят свой вклад в (3-фактор переходного комплекса. Следует также заметить, что оценки, полученные путем таких приближенных расчетов, можно использовать лишь как грубое приближение величин изотопных эффектов и выяснения трендов в их поведении, но не как эталонные, основываясь на которых можно делать принципиальные выводы.

Ввиду изложенного нами предпринята новая попытка теоретической оценки достижимого коэффициента разделения изотопов углерода в реакции карбоксилирования РиБФ, которую аппроксимировали величиной сх,. При этом использовали кинетическую схему реакции, предложенную в работе [25]. Ее анализ показывает, что изотопный эффект по ассимилируемому углеродному атому возникает на стадии 4 (рис. 2), когда линейная молекула С02 под действием активного центра фермента и ферментсвязанно-го РиБФ превращается в промежуточное переходное состояние, в котором одна р-связь разрушается, а взамен появляется связь С-С.

Для расчета (3-фактора переходного комплекса вначале рассчитали геомет-

рию и частоты колебаний. Расчет проводили по ограниченному методу Хар-три — Фока (базис RHF/6-311++G**; 3df,3p) с использованием программного комплекса РС GAMESS [17, 20]. В комплексе программ вначале проводится квантово-химический расчет силовых постоянных, которые вместе с геометрическими параметрами используются затем для расчета частот колебаний известными методами [1, 3]. При этом считалось, что на атоме углерода возникает положительный заряд, а на атоме кислорода — отрицательный. Для моделирования этих превращений С02 в качестве сильного нуклеофила был выбран ион ОН-. Под его воздействием молекула С02 переходит в карбоксилат-ион. При параметризации связи, образующейся между С02 и нуклеофилом, не очень существенно, какой именно атом образует связь с углеродом (С или О). Реакция не имеет потенциального барьера и по мере сближения реагирующих частиц вплоть до момента образования продукта энергия системы падает. Расчет проводили для 14 точек, равномерно расположенных на пути реакции, при значениях г(С~ОН) от 1,3 до 4А. В каждой точке жестко фиксировалось расстояние г(С-ОН), затем проводилась оптимизация остальных геометрических параметров. В качестве переходного комплекса выбрали конфигурацию с расстоянием г(С-ОН) = 1,90 А, при котором мнимая частота имела максимальное значение. Для «легкой» формы %#(12) = 430Д см-1, для «тяжелой» формы %#(13) = 423Д см-1. Все частоты для изотопных форм переходного комплекса представлены в таблице. По ним с помощью выражения (8) был рассчитан (3-фактор переходного комплекса, который оказался равным 1,2207. Заметим, что данное значение по величине приближается к значениям, которые были получены ранее с помощью другой кинетической схемы [5]. Объясняется это тем, что в обоих случаях лимитирующей

6Ы204

I

ш м

ап204

-он

0=сч

0

1 /

- 1 +2 ч 0--Й&-

II оС он" о £=о

Аяр203 (У

СН ^ -Резонанс: 1ога201 А-----

ажтюацня фертекта с кфбтимнк* 1у*201

ИЗ

««204

I

0

/ОН

Резонанс хые ^ форшх каршншт»

0=Сч

0

1

1 4

с ' 1

» * ! ¿я,

о=с

О"

I

,+2

А Ж— ?н

с У I

О

Алр203

I

Ьув201

яеремвс «ротона

снр®

с-нсон

сир®

Ьта201 л

* XI С1ф® С таутшисркгации

т гаязымхне СО2

СЯя204

С1и204 _

о=сч Е

г *

'¿у'

,с—неон

Я енр® сн,р©

\ .у- - ВД --1 - - (

II Оч \ Г-о|

ИЩМХКЩП

6Ь|204

ш Г4

. Г^-й

П <>ч I / О - Ьуя39

Х-нсон Ч/-нсон

/М&11СГК1ПИ

Ь5=ао» \ Ацхв)

\ (Г пубмшциш»

, СНра С&р®

дестаукцня С— С связи

\

- с—неон

о

?=<ч_ т

(Ли204 О 0~ О"

о-^Ц-сп-

с / с^ I II О, 1 уо сн£®

/сар®

ГТ® V, нм^ О^

Вм327 Ьуз175

?=<Ч.

*ФГК ШЗДО

ш

ФГК

+2

^нс^"0 1^201

„ -О"--с-нсон н оч ;

ь)*201 СНф®

схереоспедафичкское Гецюяфшк х шЫиппв тугого продукта

Яи204?

ш

I

СН^

ОН

/

Ьуя175 сююбвждаше

ВТОрОГО

II ОН

0 чс-=0

НС н0" Ьув201

/

С I

.сн

Рис. 2. Предполагаемая последовательность элементарных стадий реакции ферментативного карбоксилирования РиБФ согласно механизму, предложенному в работе [17]

скорость стадией являлась стадия превращения линейной молекулы С02 в нелинейную карбоксильную группу с деструкцией я-связи.

Расчет изотопных частот С02, как отмечалось, не представляет сложностей, поскольку и геометрия, и спектр частот этой молекулы хорошо изучен,

Изотопные частоты молекулы С02 и переходного комплекса, образующегося при ферментативном карбоксилировании РиБФ, полученные квантово-химическим

методом Хартри — Фока (базис RHF/6-3П++G**; 3df,3p) с использованием программного комплекса PC GAMESS

co2 «Переходный комплекс»

Частоты колебаний, Частоты колебаний,

v см"' V см"1

12CO2 13co2 ("CS*)

778.09(E) 755.94(E) 430,63/ 423,34Í

1513,34 1513,34 2555,04 2482,32

364,00 411,37 692,65 842,87

363,99 410,29 684,24 817,02

913,95 913,86

1394,97 1391,12

2128,97 2191,12

4159,38 4159,37

Р = 1,1836 р= 1,2207

Примечание. * Частота дважды вырожденная. Пояснения к таблице в тексте.

а метод расчета хорошо разработан, но, работая в рамках одной модели и с целью лучшей сопоставимости результатов, частоты молекулы С02 мы также рассчитали описанным способом (таблица). (3-фактор С02 оказался равным 1,1836 и очень хорошо соответствовал значению, полученному ранее Тодом с коллегами [26] (3 = 1,1858.

В итоге величина эффективного коэффициента фракционирования изотопов углерода при карбоксилировании РиБФ получилась равной

что значительно больше значения, данного в работе [23].

Таким образом, проведенные нами расчеты подтверждают высокие значения коэффициентов изотопного фракционирования, наблюдаемые in vitro. Это позволяет сделать вывод, что в опытах in vitro значения изотопных эффектов действительно намного превышают то обогащение, которое на-

блюдается в биомассе фотосинтезиру-ющих организмов и подтверждается рис. 1 и данными исследований многих авторов [12, 13,16, 28-31], полученных на разных объектах (соя, томат, сорго, кукуруза, водоросли и микроорганизмы). Полученный результат дает основание полагать, что в клетках этих организмов, вероятно, существует изотопный эффект противоположного знака, компенсирующий эффект ассимиляции. Это предположение подтверждается и другими независимыми данными [19].

Библиографический список

1. Вильсон Е., Дешиус Дж., Кросс А. Теория колебательных спектров молекул. М.: ИИЛ 1960. — 2. Глесстон С., Лейд-лер К., Эйринг Г. Теория абсолютных скоростей реакций. М.: ИИЛ. 1948. — 3. Грибов JI.A. Введение в теорию и расчет колебательных спектров многоатомных молекул. Л.: ЛГУ. — 4. Ивлев А.А., Гали-мов Э.М., Королёва МЛ. Термодинамические изотопные эффекты органических соединений. VI. Уксусная кислота, ацетальдегид, метиламин, метиловый спирт / Журнал физической химии, 1974. Т. 48. С. 225-227. — 5. Ивлев А.А., Князев Д.А. // Известия ТСХА, 1983. Вып. 4. С. 105-114. — 6. Ивлев А.А. О потоках «лёгкого» и «тяжёлого» углерода при сопряжении фотосинтеза и фотодыхания // Физиология растений, 1993. Т. 40. С. 872-880. — 7. Ивлев А.А., Калин-кина Л.Г. Экспериментальные свидетельства существования изотопного эффекта фотодыхания // Физиология растений, 2001. Т. 48. С. 467-480. — 8. Меландер JI. Сондерс У.Скорости реакций изотопных молекул. М: Мир, 1983. — 9. Рубин А.Б., Гавриленко В.Ф. Биохимия и физиология фотосинтеза. М.: МГУ, 1971. — 10. Andrews Т. J., Lorimer G.H. II The Biochemistry of Plants, 1987. V. 10. PP. 131-218. — 11. Cleland W.W., Andrews J., Gutteridge S. et al. // Chem. Rev., 1998. V. 98. P. 549-561. — 12. Christeller I.T., Laing W.A., Troughton J.H. Ц Plant Physiol. 1976. V. 57. P. 580-586. — 13. Deleens E.,Lerman J.C. Nato A.,Moy-

se Ä. // Proc. 3-rd Int. Congr. on Photosynthesis. Amsterdam: Elav., 1974. P. 1267-1276. — 14. Edwards G, Walker D. C3, C4: mechanisms, and cellular and environmental regulation of photosynthesis. Blackwell Scientific Publications. Oxford, London, Boston, Melbourne, 1983. — 15. Estep M.L.F, Tabita F.R., Parker P.L., Baalen CH. V. // Plant PhysioL, 1978. V. 61. P. 680-687. — 16. Fogel M.L. // Diss. Abstr. Int. Sec. B., 1977. V. 38. P. 1994-1996. — 17. Granovsky A.A. PC GAMESS version 7.0 / http://classic.chemmsusu/gamess/ index.html — 18. Mauser H., King W.A., Gready J.E., Andrews T.J. // J. Am. Chem. Soc., 2001. V. 123. P. 1 5414-15422. — 19. Ivlev A.A., Igamberdiev A.Y., Dubin-sky A.Yu. II Biophysics, 2004. V.49. Suppl. 1. P. 3-16. — 20. Nemukhin A.V., Grigorenko, B.L., Granovsky A.A. // Moscow University Chemistry Bulletin, 2004, Vol. 45. No. 2. — 21. Park R., Epstein S. j j Plant. Physiol., 1961. V. 36. P. 133-

139. — 22. Pierce J., Andrews T.J., Lori-mer J.H. Ц J. Biol. Chem., 1986. V. 261. P. 10248-10256. — 23. RoeskeC.A., O'Leary M.H. II Biochemistry, 1984. V. 23. P. 62756284. — 24. Roeske C.A., O'LearyM.H. // Biochemistry, 1985. V. 24. P. 1603-1607. — 25. Tapia O., Andres J., Safont V.S. // Journal of Molecular Structure, 1995. V. 342. P. 131-140. — 26. Thode H, Shima М., Rees C.JZrishnamurty К // Canadian J.Chem, 1965. V. 43. N 3. P. 582-593. — 27. Tcher-kez G.,Farquhar G.D. // Functional plant Biology, 2005. V. 32. P. 277-291. — 28. Whelan T.W., Sackett W.M., Benedict C.R. II Biochem. Biophys. Res. Comm., 1976. V. 41. P. 1205-1207. — 29. Whelan T.W., Sackett W.M., Benedict C.R. // Plant Physiol., 1973. V. 51. P. 1051-1054. — 30. Winkler F.J., Kexel H., Kranz C., Schmidt H.-L. The 4-th Int. Conf. On Stable Isotopes. Book of Abstr. Julich., 1981.11.2. Life sciences. — 31. Wong H.G., Benedict C.R., Kohel RJ. // Plant Physiol., 1979. V. 63. P. 852-856.

Рецензент — д. б. н. JI.A. Паничкин

SUMMARY

The ab initio calculation of the carbon isotope fractionation coefficient (A,-) in RuBP carboxylation reaction was carried out and the estimate of maximal value of it was made. To get this objective RHF/6-311++G** (3df,3p) basis in PC GAMESS program was applied. The geometry and the vibrational frequencies were calculated. By means of the obtained data the partition functions ((3-factors) for C02 and for the transitional state were calculated. The value of otf, equal to 1,047 appeared to be in the range of the values characteristic of in vitro experiments but much more than those observed in vivo. The result makes it possible to assume the emergence of the isotope effect in some reactions of a living cell that compensate the effect of RuBP carboxylation.