CC BY
76
УДК 541.64:536.7
О ПРИЧИНЕ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ХИТОЗАНА ПОД ДЕЙСТВИЕМ НЕКОТОРЫХ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
© Е. И. Кулиш1*, В. В. Чернова1, Р. Ф. Вильданова1,
В. П. Володина2, С. В. Колесов2
1 Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450074 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
E-mail: alenakulish@rambler. ru 2Институт органической химии Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.
Рассмотрен вопрос о причине проявления неспецифической активности некоторых ферментов по отношению к хитозану. Высказывается предположение, что все изучаемые ферменты содержат в качестве примесных ферменты с в-гликозидазной активностью.
Ключевые слова: ферменты, деструкция, хитозан.
Основные средства, использующиеся на сегодняшний день при лечении ран - это перевязочные материалы. Вместе с тем проблема выбора материала, подходящего для использования во всех фазах раневого процесса, далека от разрешения. Перспективным вариантом решения проблемы создания нетравмирующих сорбирующих покрытий является применение покрытий на основе полимера природного происхождения полисахарида - хитоза-на (ХТЗ). Крайне перспективным представляется использование ХТЗ как носителя ферментных препаратов, имеющих фармакологическое значение -таких как, например, коллагеназа, лидаза, трипсин и т. д. Однако, в процессе иммобилизации ферментных препаратов на хитозановой матрице они способны воздействовать на полимер-основу. Так в литературе имеются сведения о том, что неспецифические к ХТЗ ферменты способны вызвать процесс его ферментативного разложения [1-7]. Отмечается как сам факт проявления активности некоторых ферментов по отношению к ХТЗ, так и различного роды эффекты, сопровождающие данный процесс. В связи с этим, целью данной работы стало изучение влияния некоторых ферментных препаратов, используемых при лечении ожоговых и гнойных ран, на процесс ферментативного гидролиза ХТЗ и установление причины их неспецифической активности по отношению к ХТЗ.
Экспериментальная часть
В качестве объектов исследования были выбраны: ХТЗ (производства ЗАО «Биопрогресс», Щелково), полученный щелочным деацетилирова-нием крабового хитина, (степень деацетилирования ~83%, молекулярная масса 87 кДа), натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), синтезированная в лаборатории Коми научного центра РАН, (степень замещения 1.1, молекулярная масса 100 кДа), ферментные препараты: коллагеназа (ЗАО Биопрогресс, Щелково), пепсин й (ООО Шако, Ростов-на-Дону), гиалуронидаза (ГУП Иммунопрепарат, Уфа), трипсин (Микроген НПО ФГУП, Омск). Растворы полимеров готовили растворением в течение 6-8 часов при комнатной температуре. В качестве рас-
творителя были использованы уксусная кислота с концентрацией 1 г/дл в случае ХТЗ и вода в случае карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ). Для определения характеристической вязкости ХТЗ использовали ацетатный буфер, состоящий из 0.3 м. уксусной кислоты и 0.2 м. ацетата натрия, в случае КМЦ -0.1 н раствор №С1. Ферментный препарат, предварительно растворенный в небольшом количестве воды, вносили в раствор полимера непосредственно перед началом изучения процесса деструкции в количестве 5% от массы полимера. Температура проведения процесса составляла 25 °С. Содержание белковых примесей в образце ХТЗ оценивали спектрофотометрическим методом [8]. Определение концентрации восстанавливающих сахаров проводили феррицианидным методом [8]. Для определения общей, арил- (экзо-) и эндо-глюкозидазной активностей использовали методики, разработанные в [9, 10]. За единицу общей Р-глюкозидазной активности принимали количество ферментного препарата, которое образует 1 мкмоль восстанавливающих сахаров за 1 минуту гидролиза 50 мг фильтровальной бумаги при комнатной температуре. За единицу эндо-Р-глюкозидазной активности принимали количество ферментного препарата, который статистически расщепляет 1 мкмоль гликозидных связей за 1 минуту при комнатной температуре. За единицу арил-глюкозидазной активности принимаем количество ферментного препарата, которое образует 1 мкмоль п-нитрофенола за 1 мин при инкубации раствора субстрата - п-нитрофенил-Р-В-глюкопиранозида, при комнатной температуре.
Результаты и их обсуждение
В ходе собственных исследований авторов [11-13] было установлено, что выдержка растворов ХТЗ с неспецифическими для него ферментами -трипсином, лидазой, коллагеназой и пепсином, сопровождается уменьшением как относительной, так и характеристической вязкости ХТЗ (рис. 1). Подобное снижение вязкости имело место как при исследовании ХТЗ в растворах уксусной кислоты различной концентрации, так и в случае пленок, полученных из уксуснокислых растворов. Между
* автор, ответственный за переписку
682
ХИМИЯ
тем, из изученных ферментов только лидаза непосредственно могла бы вызвать гидролиз гликозид-ных связей ХТЗ, поскольку катализирует реакции гидролитического расщепления основного компонента соединительной ткани - гиалуроновой кислоты. Гиалуроновые кислоты, как известно, представляет собой высокомолекулярные линейные биополимеры, молекулы которых построены из чередующихся остатков О-глюкуроновой кислоты и N ацетил-О-гликозамина, соединенных р-(1-4)- и в-(1-3)-связями. ХТЗ является аминополисахари-дом, т.е. веществом с близкой к гиалуроновой кислоте химической структурой.
ГП]
1 5 10 15 20 сутки
Рис. 1. Зависимость характеристической вязкости хитоза-на, выделенного из раствора в 1% уксусной кислоте, содержащего трипсин (1), лидазу (2), коллагеназу (3) и пепсин (4), от времени выдержки хитозана в растворе.
Все другие используемые нами ферменты представляют собой протеазы и не должны гидролизовать полисахарид ХТЗ. Логично было бы предположить, что в присутствии используемых нами ферментов гидролизу подвергаются не р-гликозидные связи ХТЗ, а белковые примеси, которые могут в нем присутствовать. О том, что ХТЗ может иметь ковалентно связанные с ним белковые примеси, хорошо известно [14]. В используемом нами образце они тоже присутствуют в количестве не более 0.1% масс. Предположение о том, что такое ничтожное количество белка может вызывать столь внушительное уменьшение характеристической вязкости ХТЗ, кажется маловероятным. Тем не менее, для проверки данной гипотезы, был проведен ферментативный гидролиз карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), которая априори не содержит веществ белкового происхождения, но имеет, так же как и в хитозане, в-гликозидные связи. Как показали вискозиметриче-ские исследования, добавление к водному раствору КМЦ ферментов приводит к зависимостям, аналогичным тем, которые имеют место при гидролизе ХТЗ. Как видно из рис. 2, происходит закономерное уменьшение характеристической вязкости полимера по мере увеличения времени его выдержи с ферментами. Таким образом, причина падения характеристической вязкости ХТЗ не связана с присутствием в нем белковых примесей, а обусловлено наличием в-гликозидных связей.
Факт ферментативного гидролиза ХТЗ под действием изучаемых ферментов подтверждается прямым определением количества восстанавливающих сахаров. Как показали проведенные исследования, длительная (в течение 20 дней) выдержка растворов ХТЗ в уксусной кислоте в отсутствии фермента не сопровождается каким-либо изменением концентрации восстанавливающих сахаров. Напротив, выдержка растворов ХТЗ в уксусной кислоте в присутствии ферментных препаратов приводит к закономерному увеличению концентрации восстанавливающих сахаров.
Рис. 2. Зависимость характеристической вязкости карбоксиметилцеллюлозы, выделенной из раствора, содержащего трипсин (1), лидазу (2), коллагеназу (3) и пепсин (4) от времени выдержки в растворе.
Определение накопления количества восстанавливающих сахаров в процессе выдержки уксуснокислого раствора ХТЗ в присутствии ферментов позволяет рассчитать увеличение количества цепей полимера, происходящее в ходе гидролиза. Из рисунка 3 видно, что число макромолекул ХТЗ возрастает за изучаемое время в 3-6 раз, что позволяет говорить о статистическом характере процесса гидролиза.
Можно предположить, что во всех изученных нами ферментных препаратах присутствуют глико-зидазные ферменты. Данный факт может иметь место, так как все используемые в работе ферменты получены из биоматериала. Это означает, что они могут иметь в качестве примесных ферменты, содержащиеся в лизосомах, среди которых и в-гликозидазы, назначение которых - лизис протеог-ликанов, составляющих основу соединительной ткани живых организмов.
Для всех используемых в работе ферментов было проведено определение в-гликозидазных активностей - общей, арил- (экзо-) и эндо-
глюкозидазной. Результаты определений даны в таблице. Обращает на себя внимание, что значения общей и арил-гликозидазной активности ферментных препаратов несколько отличается от их способности гидролизовать хитозан. Данный факт можно объяснить тем, что основной вклад в изменение характеристической вязкости ХТЗ вносят только эндо-гликозидазы.
17
число цепей хитозана, 10
Рис. 3. Зависимость числа цепей хитозана, находящихся в 0.1 мл 0.2% раствора хитозана в 1% уксусной кислоте (7) в присутствии фермента трипсина (2), лидазы (3), коллагеназы (4) и пепсина (5) от времени выдержки раствора.
Таблица
Значение гликозидазных активностей используемых в работе ферментов
Используемый Общая Р-гликозидазная Экзо-Р-гликозидазная Эндо-Р-гликозидазная
фермент активность, Е/г активность, Е/г активность, Е/г
Трипсин 46.1
Пепсин 124.5
Коллагеназа 166.3
Лидаза 70.1
Таким образом, в ходе работы установлено, что причина уменьшения характеристической вязкости ХТЗ и накопление восстанавливающих сахаров в деструктированном ХТЗ в присутствии ферментных препаратов обусловлены протеканием гидролиза основной цепи ХТЗ, вследствие наличия в ферментных препаратах в-гликозидаз.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ и Республики Башкортостан (грант
р_поволжье_а № 11 -03-97016).
ЛИТЕРАТУРА
1. Ильина А. В., Варламов В. П. В книге Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение // Ред. Скрябин К. Г., Вихорева Г А., Варламов В. П. М.: Наука, 2002. C. 79.
2. Panteleone D., Yalpani M. // In Carbohydrates and carbohedrate polymers, Analisis, Biotechnology, Modification, Antiviral, Biomedical and other application / M. Yalpani, ed. ATL Press. 1993. P. 44.
3. Yalpani M., Panteleone D. // Carbohydr.Res. 1994. V256. P. 159.
4. Журавлева Н. В., Лукьянов П. А. // Вестник ДВО РАН. 2004. №3. С. 76.
5. Муллагалиев И. Р., Актуганов Г. Э., Мелентьев А. И. //
Материалы 7 Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». М. : ВНИРО, 2006. С. 305.
40.3 14.1
76.5 96.1
80.1 115.9
64.2 28.8
6. Черкасова Е. И., Душкова З. Г., Фролов В. Г. // Материалы 7 Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». М.: ВНИРО, 2006. С. 318.
7. Бакулин А. В., Львова А. А., Албулов А. И., Тран Дин Тоай. // Материалы 9 Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитоза-на». М.: ВНИРО, 2008. С. 241.
8. Практикум по биохимии / под ред. Северина С. Е., Со-
ловьевой Г. А. М.: Изд-во МГУ, 1989.
9. Рабинович М. Л., Клесов А. А., Березин И. В. // Биоорга-
ническая химия. 1977. Т. 3. №3. С. 405.
10. Клесов А. А., Рабинович М. Л., Синицын А. П., Чурилова И. В., Григораги С. Ю. // Биоорганическая химия. 1980. Т.
6. № 8. С. 1225.
11. Кулиш Е. И., Володина В. П., Фаткуллина Р. Р., Колесов С. В., Заиков Г. Е. // Высокомолек. соед. Б. 2008. Т.50. №7. С. 1277.
12. Чернова В. В., Кулиш Е. И., Володина В. П., Колесов С. В. // Материалы 9 Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». М.: ВНИРО, 2008. С. 234.
13. Кулиш Е. И., Чернова В. В., Володина В. П., Торлопов М. А., Колесов С. В. // Материалы 10 Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». Нижний Новгород: ННГУ, 2010. С. 274.
14. Гамзазаде А. И. // Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение. // Ред. Скрябин К. Г., Вихорева Г. А., Варламов В. П. М.: Наука, 2002. С. 112.
Поступила в редакцию 22.04.20II г.
