Нуклеотидный полиморфизм гена интерлейкина 10 в позиции 1082 A/G у новорожденных с некротическим энтероколитом Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2020 - V. 27, № 3 - P. 38-41

УДК: 612.64 DOI: 10.24411/1609-2163-2020-16645

НУКЛЕОТИДНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА ИНТЕРЛЕЙКИНА - 10 В ПОЗИЦИИ 1082 A/G У НОВОРОЖДЕННЫХ С НЕКРОТИЧЕСКИМ ЭНТЕРОКОЛИТОМ

Т.е. ДЖАФАРОВА

Научно-исследовательский институт педиатрии им. К. Фараджевой, ул. Басти Багировой, д. 17, г. Баку, AZ1065, Азербайджан, Тел.: (+994 12) 595-30-03, (+994 12) 594-79-25, (+99412) 596-78-05, e-mail: tarana.c_86@mail.ru

Аннотация. В неонатологии одной из актуальных проблем считается некротический энтероколит, оказывающий значительное влияние на показатели заболеваемости смертности. Некротический энтероколит в кратчайшие сроки может стать причиной таких тяжелых осложнений как сепсис, синдром внутрисосудистого свертывания, полиорганная недостаточность. В настоящее время в патогенезе некротического энтероколита показывается защитная роль противоспалительного цитокина Я,-10. Также известно, что течение болезни зависит от генетической системы организма. Так, полиморфизм различных генов цитоки-нов оказывает влияние на появление и развитие заболеваний в организме. Исследования, проведенные на гене /1-10 выявили, что степень выраженности этого гена связано только с нуклеотидным полиморфизмом. Цель исследований выявить действие единого нуклеотидного полиморфизма гена /1-10 в позиции - 1082 A/G на продукцию гена у больных с некротическим энтероколитом и изучить связь с некротическим энтероколитом. Материалы и методы исследования. В исследования были привлечены 53 новорожденных, из которых 36 были с диагнозом некротический энтероколит, а 17 - практические здоровые новорожденные, составившие группу контроль. /1-10 определяли в крови методом иммуноферментного анализа, единый нуклеотидный полиморфизм гена /1-10 в позиции -1082 A/G методом полимеразной цепной реакции длины полиморфизма фрагментов рестрикции. Результаты и их обсуждение. /1-10 у больных с некротическим энтероколитом (9,98±0,75 (1,6-18,3)) статистически достоверно отличались от контрольной группы (5,65±0,57 (1,78-11,3)) (р<0,05). В промоторной области, представляющий ген /1-10 замещение аденина гуанином и у больных некротическим энтероколитом и у здоровых новорожденных способствовало повышению в крови продуктов гена в крови. У гомозигот А4 генотипа наблюдалось самый низкий уровень /1-10, у гетерозигот AG генотипа - средний уровень, у гомозигот GG генотипа - самый высокий его уровень.

Ключевые слова: некротический энтероколит, интерлейкин-10, единый нуклеотидный полиморфизм.

SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM AT POSITION -1082 (A/G) IN INTERLEUKIN-10 GENE PROMOTER REGION IN THE NEWBORNS WITH NECROTIC ENTEROCOLITIS

T.S. JAFAROVA

K. Y. Farajova Scientific Research Institute of Pediatrics, 17, Basti Baghirov Str., Yasamal District, Baku, AZ1065, Azerbaijan, tel. (+994 12) 595-30-03, (+994 12) 594-79-25, (+994 12) 596-78-05, E-mail: tarana.c_86@mail.ru

Abstract. Background: Necrotic enterocolitis (NEC) is considered to be one of the topical problems in neonatology, which exerts a significant influence on morbidity and mortality rates. NEC may rapidly lead to many serious complications like septicemia, disseminated intravascular coagulation, etc. Currently, the anti-inflammatory cytokine interleukin-10 (IL-10) is stipulated as an agent playing a protective role in the pathogenesis of NEC. It is known that the course of a disease is also dependent on the body's genetic systems. Thus, the polymorphism of different cytokine genes exerts a certain influence on the onset and progress of a disease. The studies on the IL-10 gene have shown that the degree of its expression is related to single nucleotide polymorphisms located in a specific section. The research study was to investigate the impact of the single nucleotide polymorphism at position -1082 (A/G) in the interleukin-10 gene promoter region on the gene product and to determine the link between such polymorphism and NEC. Materials and methods: The study population included 53 newborns, 36 of which were diagnosed with NEC, while the remaining 17 healthy newborns were allocated to the control group. We used the immunoenzyme analysis for the detection of IL-10 and PCR RFLP (Polymerase chain reaction-Restriction fragment length polymorphism) method for the Single Nucleotide Polymorphism at position -1082 (A/G) in the Inter-leukin-10 gene. Results: In the NEC group (9,98±0,75 (1,6-18,3)), IL-10 was significantly different from the control group (5,65±0,57 (1,78-11,3)) (p<0,05). The substitution of adenine for a guanine in the studied promoter region of IL-10 resulted in the increase of the gene product both in healthy newborns and in those with the NEC diagnosis. Levels of IL-10 in homozygous dominant AA genotype (lowest level), heterozygous AG genotype average level) and homozygous GG genotype (highest level) individuals were determined.

Keywords: Necrotic Enterecolitis, Interleukin-10, Single Nucleotide Polymorphism.

Некротический энтероколит (НЕК) является одним из самых тяжелых гастроинтестинальных заболеваний новорожденных и в особенности недоношенных детей. В настоящее время, несмотря на повышение уровня ухода за недоношенными, участились случаи НЕК. НЕК в короткие сроки может способствовать развитию серьезных осложнений - сепсиса синдрома внутрисосудистого свертывания, полиорганной недостаточности. На фоне осложнений появляется необходимость длительного лечения. У

20-40% больных требуется хирургическое вмешательство. Летальность от НЕКа колеблется в пределах 20-30%. Летальность после оперативного вмешательства еще выше [1,2].

Актуальность проблемы объясняется малоизу-ченностью причин и патогенеза заболевания. В настоящее время в патогенезе НЕК важную роль определяют провоспалительным и противоспалитель-ным цитокинам. Доказано защитная роль противо-спалительных цитокинов типа /1,-10 при гастроинте-

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2020 - V. 27, № 3 - P. 38-41

стинальных заболеваниях. Показано как защитный реакция против повреждения кишок усиление про-тивоспалительного ответа и повышение содержания Я,-10 в плазме и тканях. Также наблюдается связь между повышением экспрессии информационной рибонуклеиновой кислоты (иРНК) этих цитокинов в поврежденной кишечной ткани и снижением повреждения тканей [3,4].

Иммунорегуляторный цитокин Я,-10 - гомоди-мер с молекулярным весом 36 Юа, состоит из 178 аминокислот. Концентрация Я-10, циркулирующего в крови здоровых людей приблизительно составляет 0,5pg/ml. Основная функция Я,-10 - им-муносупрессия и противовоспалительное действие. Участвует в гомеопатическом регулировании клеточного иммунитета. Т лимфоциты, Я,-10 синтезируется В лимфоцитами, моноцитами, макрофагами, кератиноцитами, естественными киллерами, эози-нофилами и дендритными клетками. Он участвует в организации Г и В лимфоцитов, тем самым регулируя функцию иммунной системы. Препятствует синтезу различных цитокинов из Г-лимфоцитов, моноцитов и макрофагов [5,6]. Я-10 ингибируя активацию нуклеарного фактора карраБ (NFkB) также оказывает ингибирующее действие на макрофаги, одновременно снижает синтез воспалительных цитокинов IL-1 аир, IL-6) и IL-8 в Тхелпер 1 (Thl) клетках. Научные исследования показывают, что у новорожденных по сравнению со зрелыми людьми снижение выделения Я-10. Бесконтрольный усиленный синтез провоспалительных цитокинов и склонность к повреждению тканей в течении продолжительного времени после острого воспалительного процесса у недоношенных по сравнению с новорожденными связывают с меньшим синтезом этого цитокина [7]. В исследованиях проведенных на гене Я-10 было выявлено, что степень выраженности этого гена связана единственным нуклеотидным полиморфизмом в специальном участке гена. Ген Я-10 расположен на <731-32 участке 1-ой хромосомы. В промоторной части этого гена (-1082 участок A/G, -819 участок С/Т, -592 участок С/А) был выявлен единый нуклеотид-ный полиморфизм. С целью выявления фенотипиче-ского действия этих полиморфных частей в стимулированных лимфоцитах определяли уровень Я-10. В результате исследований было показано их действие на единый нуклеотидный полиморфизм продукта гена в позиции 1082 А/G [8].

Цель исследования - выявить действие единого нуклеотидного полиморфизма гена Я-10 в позиции -1082 А/G на продукцию гена у больных с некротическим энтероколитом и изучить связь с некротическим энтероколитом.

Материалы и методы исследования. В исследования были привлечены 53 новорожденных. Из них 36 новорожденных получали лечение по поводу НЕК в отделении реанимации Научно-исследовательского института педиатрии (НИИП) им. К. Фараджовой, а 17 здоровых новорожденных

составляли контрольную группу. Средний гестаци-онный возраст новорожденных в контрольной группе составлял 36,5±0,4 недель, а группе НЕК -36,1±0,2 неделя. Средняя масса тела новорожденных в контрольной группе составляла 2850±169,5 гр, а в группе НЕК - 2390±80,9гр.

Иммунологические исследования проводились иммунологической лаборатории клинико-диагностического отделения НИИП методом имму-ноферментного анализа (ИФА) на полностью автоматизированном анализаторе Elisys UNO-Human ÏFA при длине волны 450 пт.

Исследование Я-10 в плазме периферической крови новорожденных проводили на аппарате «¡L-10 EASIA (DÍA Source. Louvain is-Neuve Belgium)» с использованием стандартных наборов реактивов. Уровень цитокинов определяли в соответствии с протоколом производителя.

Исследование единого нуклеотидного полиморфизма гена Я-10 в позиции - 1082 А/G проводили методом полимеразной цепной реакции длины полиморфизма фрагментов рестрикции (ПЦР-ДПФР^) в Институте генетических ресурсов НАНАзербайджа-на. С этой целью пробы крови новорожденных собирались в специальные пробирки, обработанные раствором EDTA и сохранялись при температуре -20°С. Из собранных проб крови производили экстракцию ДНК методом Spin-Colon набором реактивов HiPurA™ (Catalog Number: МВ504). Качество и количество ДНК проверяли на аппарате nanadrop по программе nanadrop. Изучение единого нуклеотидного полиморфизма гена Я-10 в позиции -1082 А/G проводили с помощью специфического праймер

F:5'CCAAGACAACACTACTAAGGCTCCTTT3' R:5'GCTTCTTATATGCTAGTCAGGTA3 методом ПЦР-ДПФР. Каждое ПЦР объемом 25fil состоял из 2 /// ДНК, 2,5 ц110 Буффера, 2f il MgCh, 0,25 /// í/НТФ, 0,5 /// F praymer, 0,5 fil R praymer, 17 fil H2O va 0,25 fil Taq фермента полимеразы. Стадии ПЦР проводились в требуемой последовательности. На первом этапе проводили денатурацию ДНК при температуре 95 °С в течении 3-х минут, на 3-ей стадии - 94°С 45 сек, присоединение - 60°С 45 сек, 72°С 1минута - цикл спина к спине и завершалось процедура 1 циклом 72°С 5 мин. После амплификацированный реакцией цепной полимеризации ДНК при помощи «разрывающих» ферментов разделялись на фрагменты, подвергались электрофорезу на агарозной гели (2%) в буфере из смеси Tris - ацетата и EDTA, и наконец окрашивались 0,05% раствора этидия бромида.

Для каждого новорожденного, включенного в данное исследование были открыты индивидуальные карты осмотра, для каждого показателя вычислены среднее значение (М) и его средняя погрешность, показаны минимальная и максимальная показатели. Проведена статистическая обработка данных с вычислением методом Pirsonun у2 (хг-квадрат) и 5% достоверности (р<0,05). С учетом количества показателей в группах с целью уточнения получен-

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2020 - V. 27, № 3 - P. 38-41

ных результатов были применены непараметрические методы ANOVA, Mann Whitney U, Univarite Analysis of Variance).

Статистическую обработку частоту полиморфных аллелей гена iL-10 в исследуемой позиции в НЕК и контрольной группах проводили при помощи теста SPSS компьютерной программы.

Результаты и их обсуждение. После разделения на фрагменты ПЦР с участием ретрикционных ферментов материалов ДНК гена iL-10 в позиции -1082, на агарозной гели были получены у А гомозит -ных особей 2 фрагмента ДНК с длиной 280 п.о и 97 п.о, у G гомозиготных особей - 3 фрагмента ДНК с длиной 253 п.о, 97 п.о и 27 п.о и у гетерозиготных особей - 3 фрагмента ДНК с длиной 280 п.о 253 п.о и 97 п.о (рис.1).

ждать, что содержание /1-10 у гомозиготных особей АА генотипа был на наиболее низком, у гетерозиготных особей АС генотипа на среднем, у гомозиготных особей СС генотипа на самом высоком уровне.

Рис. 2. Действие генотипа, выявленного в позиции 1082 гена/1-10 на продуктивность гена с учетом групп здоровых и больных новорожденных

Рис. 1. Действие генотипа, выявленного в позиции 1082 гена /1-10 на уровень /1-10 у здоровых и больных НЕК новорожденных

При изучении уровня /1-10 было выявлено, что в группе НЕК по сравнению с контрольной группой произошло статистически достоверное повышение уровня /1-10 (табл. 1).

Таблица 1

Определение уровня /£-10 в плазме крови новорожденных и пациентов с НЭК

Рис. 3. Уровень /L-10 в контрольной и НЕК группах с учетом генотипа

Цитокин Группы Число больных Средний показатель Стандарт, погрешность 95% интервал достоверности СИ границы Показатель достоверности

Min Мах Р

ILIO (ng/l). Контроль 17 5,65 0,57 4,43 6,87 1,78 11,30 Р< 0,001

НЕК 36 9,98 0,75 8,47 11,49 1,60 18,30

Всего 53 8,59 0,60 7,38 9,80 1,60 18,30

Статистический анализ данных с учетом результатов обеих групп, выявил, что в группе НЕК и в группе здоровых у гомозиготных особей носителей АА аллелей уровень /1-10 был низким, а у гомозиготных особей носителей СС аллелей уровень /1-10 был высоким.

Таким же образом проведенный статистический анализ выявил, что у гомозиготных особей носителей АА аллелей по

Таблица 2

Действие полиморфных вариантов аллелей, выявленных в позиции 1082 гена /£-10 на уровень Д-Ю у здоровых и больных новорожденных

Цитокин Группы Число больных Средний показатель Стандарт, погрешность 95% интервал достоверности СИ границы Показатель достоверности Р

Min Мах

IL-10 (ng/l). АА 15 5,35 0,69 3,87 6,83 1,60 9,73 Р< 0,05

AG 25 9,38 0,86 7,61 11,15 2,20 18,20

GG 7 12,04 1,57 8,19 15,89 8,01 18,30

Всего 47 8,49 0,65 7,19 9,79 1,60 18,30

В том числе замещение аденина гуанином в исследуемой промоторном участке гена /1-10 в позиции 1082 и у здоровых и у больных НЕК новорожденных способствовало повышению содержания белка /1-10. Так, на основании полученных данных можно утвер-

сравнению с гомозиготными особями носителями СС аллелей уровень /1-10 оказался на более высоком уровне (рис. 3).

Известно, что /1-10 - ци-токин, оказывающий обратно регуляторное многостороннее действие на иммунную систему. Основные направления его действия синтеза таких важных факторов воспалительного процесса как интерлейкин 1/3 (1Ь-1/3), фактор некроза опухоли (ФНО), интерферон гамма (/Л/Р-у), грану-лоцит макрофаг-колония стимулирующий фактор (ТЖ-С?/7), индуцированная синтетаза оксида азота (iNOS) и циклооксигеназа -2 (ЦОГ-2), тормозя тем самым воспалительный процесс. Он ингибирует ко-

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2020 - V. 27, № 3 - P. 38-41

стимулирующие молекулы макрофагов противодействует участию макрофагов в Г-клеточной активации, тем самым направляя иммунный ответ по Th2 типу, регулирует воспалительный процесс [9-11]. По полученным результатам повышенный уровень Я-10 в группе НЕК по сравнению с контрольной группой мы связываем с регуляторным иммунным ответом на воспалительный процесс в группе НЕК. Обращает внимание то, что у некоторых больных НЕК с ухудшением клинической картины НЕК снижается уровень Я,-10. У этих больных НЕК недостаток Я,-10 предположительно вызывает стремительное развитие НЕК. Так, в исследовании было показано, что воспалительные процессы толстого кишечника связаны с низким уровнем Я-10. В тоже время показано, что различие в продукции Я-10 у различных людей 50-70% случаях связано с генетическими факторами. Так, синтезированные цитокины не депонируются в организме. Их синтез начинается с транскрипции гена и иРНК имеет короткую жизнь [12]. В последнее время наличие нуклеотидных полиморфизмов локализованных в регуляторных участках гена и воздействие на активность их транскрипции-одна из актуальных научно-практических проблем. Исследования, проведенные на генах Я-10 выявили, что выраженность этого гена связано с единственным полиморфизмом в определенной позиции гена. По результатам, проведенных нами исследований можно прийти к заключению, что цитокин Я-10 обладает важной роль в патогенезе НЕК и может оцениваться как диагностический маркер. По сравнению с группой здоровых новорожденных у больных НЕК 2-х кратное повышение уровня Я-10 и продолжающееся повышение его уровня в соответствии осложнением клинического течения НЕК связано с ответной реакцией организма на воспалительный процесс. У больных НЕК в соответствии с единым нуклеотидным полиморфизмом в позиции 1082A/G обычно более низкий уровень Я-10 у особей носителей АА аллели, по сравнению с особями носителями GG аллели, становится причиной недостаточности Я-10, бесконтрольности воспалительного процесса и более глубокого повреждения кишечной мукозы.

Литература / References

1. Thyoka М. Advanced necrotizing enterocolitis part 1: mortality // European Journal of Pediatric Surgery. 2012. Vol. 22, №1. P. 8-12 /

Thyoka M. Advanced necrotizing enterocolitis part 1: mortality. European Journal of Pediatric Surgery. 2012 ;22(1):8-12.

2. Neu J., Walker W.A. Necrotizing enterocolitis // N Engl J Med. 2011. Vol. 364 . P. 255-264 / Neu J, Walker WA. Necrotizing enterocolitis. N Engl J Med. 2011:364:255-64.

3. Erika C. Claud. Neonatal Necrotizing Enterocolitis -Inflammation and Intestinal Immaturit Antiinflamm Antiallergy Agents // Med Chem. 2009. Vol. 8, N3. P. 248-259 / Erika C. Claud. Neonatal Necrotizing Enterocolitis -Inflammation and Intestinal Immaturit Antiinflamm Antiallergy Agents. Med Chem. 2009;8(3):248-59.

4. Frost B.L., Jilling T., Caplan M.S. The importance of proinflammatory signaling in neonatal NEC // Semin Perinatal. 2008. Vol. 32, N2. P. 100-106 / Frost BL, Jilling T, Caplan MS. The importance of pro-inflammatory signaling in neonatal NEC. Semin Perinatal. 2008 ;32(2): 100-06.

5. Moore K.W., Malefyt R.W., Coffman R.L., O'Garra A. Interleu-kin-10 ve the Interleukin-10 receptor // Annu Rev Immunol. 2001. Vol. 19. P. 683 - 765 / Moore KW, Malefyt RW, Coffman RL, O'Garra A. Inter-leukin-10 ve the Interleukin-10 receptor. Annu Rev Immunol. 2001;19:683-765.

6. Mocellin S., Panelli M.C., Wang E., Nagorsen D., Marincola F.M. The dual role of IL-10 // Trends Immunol. 2003. Vol. 24. P. 36-43 / Mocellin S, Panelli MC, Wang E, Nagorsen D, Marincola FM. The dual role of IL-lO.Trends Immunol. 2003;24:36-43.

7. Martin C.R., Walker W.A. Intestinal immune defences and the inflammatory response in necrotising enterocolitis // Semin Fetal Neonatal Med. 2006. Vol. 11. P. 369-377 / Martin CR, Walker WA. Intestinal immune defences and the inflammatory response in necrotising enterocolitis. SeminFetal Neonatal Med. 2006;11:369-77.

8. Turner D.M., Williams D.M., Sankaran D., Lazarus M. An Investigation of Polymorphism in The Interleukin-10 Gene Promoter // Euro J Immunogen. 1997. Vol. 24. P. 1-8 / Turner DM, Williams DM, Sankaran D, Lazarus M. An Investigation of Polymorphism in The Inter-leukin-10 Gene Promoter. Euro J Immunogen. 1997;24:1-8.

9. Abbas A.K., Lichtman A.H., Poper J.S. Cytokines. Cellular and Molecular Immunology Philadelphia: WB Saunders Company, 1994. P. 240-261 / Abbas AK, Lichtman AH, Poper JS. Cytokines. Cellular and Molecular Immunology Philadelphia: WB Saunders Company; 1994.

10. Hui, Lei M.S., Dai, Yi M.D. Immunoregulation effects of different y8T cells and toll-like receptor signaling pathways in neonatal necrotizing enterocolitis // Medicine: 2017. Vol. 96, Issue 8. P. e6077 / Hui, Lei MS, Dai, Yi MD. Immunoregulation effects of different y8T cells and toll-like receptor signaling pathways in neonatal necrotizing enterocolitis. Medicine. 2017;96(Issue 8):e6077.

11. Thomas Benkoe, Suzann Baumann, Manfred Weninger, Mario Pones Comprehensive Evaluation of 11 Cytokines in Premature Infants with Surgical Necrotizing Enterocolitis // Journal PLOS ONE Published. 2013. March 5 / Thomas Benkoe, Suzann Baumann, Manfred Weninger, Mario Pones Comprehensive Evaluation of 11 Cytokines in Premature Infants with Surgical Necrotizing Enterocolitis. Journal PLOS ONE Published. 2013: March 5.

12. Kotlarz D., Beier R., Murugan D. Loss of interleukin-10 signaling and infantile inflammatory bowel disease: implications for diagnosis and therapy // Gastroenterology. 2012. Vol. 143. P. 347-343 / Kotlarz D, Beier R, Murugan D. Loss of interleukin-10 signaling and infantile inflammatory bowel disease: implications for diagnosis and therapy. Gastroenterology. 2012;143:347-3.

Библиографическая ссылка:

Джафарова T.C. Нуклеотидный полиморфизм гена интерлейкина - 10 в позиции 1082 A/G у новорожденных с некротическим энтероколитом//Вестник новых медицинских технологий. 2020. №3. С. 38-41. DOI: 10.24411/1609-2163-2020-16645.

Bibliographic reference:

Jafarova TS. Nukleotidnyy polimorfizm gena interleykina - 10 v pozitsii 1082 A/G u novorozhdennykh s nekroticheskim enterokolitom [Single nucleotide polymorphism at position-1082 (a/g) in interleukin-10 gene promoter region in the newborns with necrotic enterocolitis]. Journal of New Medical Technologies. 2020;3:38-41. DOI: 10.24411/1609-2163-2020-16645. Russian.