CC BY
10
новый ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫИ СООУДИОТЫИ НА ОСНОВЕ РЕГЕНЕРИРОВАННОГО ФИБРОИНА Ш1 ИССЛЕДОВАНИЕ in vitro
DOI: 10.17691/stm2023.15.4.04 УДК 616.1-089.843-004.891.3 Поступила 22.03.2023 г.
Е.С. Прокудина, к.м.н., научный сотрудник лаборатории тканевой инженерии и внутрисосудистой визуализации;
Е.А. Сенокосова, к.б.н., научный сотрудник лаборатории тканевой инженерии и внутрисосудистой визуализации;
Л.В. Антонова, д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории тканевой инженерии и внутрисосудистой визуализации;
Е.О. Кривкина, младший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий;
Е.А. Великанова, к.б.н., научный сотрудник лаборатории клеточных технологий;
Т.Н. Акентьева, младший научный сотрудник лаборатории новых биоматериалов;
Т.В. Глушкова, к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории новых биоматериалов;
В.Г. Матвеева, к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий;
Н.А. Кочергин, к.м.н., зав. лабораторией тканевой инженерии и внутрисосудистой визуализации
Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний, Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002
Цель исследования — изготовить сосудистую заплату на основе регенерированного фиброина шелка (ФШ) и изучить ее физико-механические характеристики, биосовместимость и матриксные свойства в сравнении с материалом из полигидроксибути-рата/валерата/поликапролактона с инкорпорированным сосудистым эндотелиальным фактором роста (ПГБВ/ПКЛ/VEGF) и коммерческим лоскутом из бычьего ксеноперикарда (КП) в экспериментах in vitro.
Материалы и методы. Тканеинженерные матриксы изготавливали методом электроспиннинга. Исследовали структуру поверхности, физико-механические характеристики, гемосовместимость (гемолиз эритроцитов, агрегацию, адгезию и активацию тромбоцитов после контакта с материалом) и матриксные свойства сосудистых заплат (адгезию, жизнеспособность, метаболическую активность клеток EA.hy926 на материале).
Результаты. Поверхность матриксов на основе ФШ и тканеинженерных заплат на основе ПГБВ/ПКЛ/VEGF отличалась пористой и волокнистой структурой по сравнению с более плотным и однородным КП-лоскутом. Физико-механические характеристики матриксов из ФШ были приближены к нативным сосудам. Наряду с этим тканеинженерные заплаты продемонстрировали высокие гемосовместимые свойства, которые не отличаются от таковых для коммерческого КП-лоскута. Адгезия, жизнеспособность и метаболическая активность эндотелиальных клеток EA.hy926 также соответствовали ранее разработанному нами матриксу ПГБВ/ПКЛ/ VEGF и КП-лоскуту, что говорит о нетоксичности и биосовместимости ФШ-матриксов.
Заключение. Матриксы, изготовленные из регенерированного ФШ, продемонстрировали удовлетворительные результаты, сопоставимые с таковыми для ПГБВ/ПКЛ/VEGF и коммерческого КП-лоскута, а в случае адгезии и активации тромбоцитов они превосходили указанные заплаты. В совокупности ФШ можно определить как материал с достаточной биологической совместимостью, что позволяет считать изготовленный из него тканеинженерный матрикс перспективным для имплантации в сосудистую стенку.
Ключевые слова: сосудистая заплата; тканевая инженерия; фиброин шелка; электроспиннинг; биосовместимость.
Как цитировать: Prokudina E.S., Senokosova E.A., Antonova L.V., Krivkina E.O., Velikanova E.A., Akentieva T.N., Glushkova T.V., Matveeva V.G., Kochergin N.A. New tissue-engineered vascular matrix based on regenerated silk fibroin: in vitro study. Sovremennye tehnologii v medicine 2023; 15(4): 41, https://doi.org/10.17691/stm2023.15.4.04
Для контактов: Прокудина Екатерина Сергеевна, e-mail: goddess27@mail.ru
New Tissue-Engineered Vascular Matrix Based on Regenerated Silk Fibroin: in vitro Study
E.S. Prokudina, MD, PhD, Researcher, Laboratory of Tissue Engineering and Intravascular Visualization;
E.A. Senokosova, PhD, Researcher, Laboratory of Tissue Engineering and Intravascular Visualization;
L.V. Antonova, MD, DSc, Leading Researcher, Laboratory of Tissue Engineering and Intravascular Visualization;
E.O. Krivkina, Junior Researcher, Laboratory for Cell Technology;
E.A. Velikanova, PhD, Researcher, Laboratory for Cell Technology;
T.N. Akentieva, Junior Researcher, Laboratory of New Biomaterials;
T.V. Glushkova, PhD, Senior Researcher, Laboratory of New Biomaterials;
V.G. Matveeva, MD, PhD, Senior Researcher, Laboratory for Cell Technology;
N.A. Kochergin, MD, PhD, Head of Laboratory of Tissue Engineering and Intravascular Visualization
Research Institute for Complex Issues in Cardiovascular Diseases, 6 Sosnovy Blvd., Kemerovo, 650002, Russia
The aim of the study was to make a vascular patch based on regenerated silk fibroin (SF) and study its physical and mechanical characteristics, biocompatibility and matrix properties in comparison with polyhydroxybutyrate/valerate/polycaprolactone with incorporated vascular endothelial growth factor (PHBV/PCL/VEGF) and commercial bovine xenopericardium (XP) flap in experiments in vitro.
Materials and Methods. Tissue-engineered matrices were produced by electrospinning. The surface structure, physical and mechanical characteristics, hemocompatibility (erythrocyte hemolysis, aggregation, adhesion and activation of platelets after contact with the material) and matrix properties of vascular patches (adhesion, viability, metabolic activity of EA.hy926 cells on the material) were studied.
Results. The surface of SF-based matrices and PHBV/PCL/VEGF-based tissue engineered patches had a porous and fibrous structure compared to a denser and more uniform XP flap. The physical and mechanical characteristics of SF matrices were close to those of native vessels. Along with this, tissue-engineered patches demonstrated high hemocompatible properties, which do not differ from those for commercial XP flap. Adhesion, viability, and metabolic activity of EA.hy926 endothelial cells also corresponded to the previously developed PHBV/PCL/VEGF matrix and XP flap, which indicates the nontoxicity and biocompatibility of SF matrices.
Conclusion. Matrices produced from regenerated SF demonstrated satisfactory results, comparable to those for PHBV/PCL/VEGF and commercial XP flap, and in the case of platelet adhesion and activation, they outperformed these patches. In total, SF can be defined as material having sufficient biological compatibility, which makes it possible to consider a tissue-engineered matrix made from it as promising for implantation into the vascular wall.
Key words: vascular patch; tissue engineering; silk fibroin; electrospinning; biocompatibility.
English
Введение
Одной из наиболее распространенных патологий сердечно-сосудистой системы является атеросклероз. Образование атеросклеротических бляшек влечет за собой нарушение проходимости сосудов и ухудшение кровоснабжения тканей и органов. Атеросклероз внутренней сонной артерии приводит к каротидному стенозу [1], что в 15% случаев является причиной ишеми-ческого инсульта [2].
Одним из способов восстановления кровотока при значимом стенозе внутренней сонной артерии (70% и более) является каротидная эндартерэктомия [3]. При наличии пролонгированных атеросклеротических бляшек предпочтительно проведение каротидной эн-дартерэктомии с закрытием артериотомного доступа с помощью сосудистой заплаты [4].
Материал для сосудистой заплаты может быть биологического (природного) происхождения (бычий ксеноперикард (КП), децеллюляризованный матрикс, фибрин, коллаген) или искусственно синтезирован-
ным (полиуретан, поливиниловый спирт, полиэтилен-терефталат, поликапролактон). Кроме того, перспективным научным направлением является создание сосудистых протезов методами тканевой инженерии [5]. Это позволяет изготавливать матриксы с заранее заданными свойствами: структурная стабильность и контролируемая биодеградация, привлечение клеток для заселения поверхности протеза, низкая иммуно-генность [6].
Одним из материалов природного происхождения является фиброин шелка (ФШ), который получают из шелковых волокон Bombyx morí [7, 8]. ФШ демонстрирует в экспериментах ín vítro и ín vívo высокую способность к адгезии, пролиферации и дифференцировке стволовых клеток [9], используется для стимуляции регенерации тканей [10-12], обладает низкой имму-ногенностью и антигенностью [13], а также не требует жестких условий для изготовления биологических ма-триксов [14]. Кроме того, работы последних лет подтверждают перспективность разработки изделий из ФШ для нужд сердечно-сосудистой хирургии [15, 16].
//////////////////////^^^^
42 СТМ 1 2023 I том 15 I №4 Е.С. Прокудина, Е.А. Сенокосова, Л.В. Антонова, Е.О. Кривкина, Е.А. Великашва, ..., H.A. Кочергин
Цель настоящего исследования — изготовить сосудистую заплату на основе регенерированного фиброина шелка и изучить ее физико-механические характеристики, биосовместимость и матриксные свойства в сравнении с заплатами из полигидрокси-бутирата/валерата/поликапролактона с инкорпорированным сосудистым эндотелиальным фактором роста и лоскутом из бычьего перикарда в экспериментах in vitro.
Материалы и методы
Исследование одобрено локальным этическим комитетом Научно-исследовательского института комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний (протокол №6 от 30.06.2022).
Изготовление сосудистых заплат. Сосудистые заплаты из 15% раствора регенерированного ФШ были изготовлены методом электроспиннинга на аппарате NANON-OIA (MECC CO, Япония). В качестве растворителя использовали гексафторпропанол. Последующую модификацию полученных матриксов проводили в 98% этаноле с целью перевода ФШ из регенерированной (водорастворимой) формы в водо-нерастворимую посредством образования р-сшивок между молекулами белка [17]. Электроспиннинг матриксов из ФШ осуществляли при следующих параметрах: игла — 22G, расстояние до коллектора — 15 см, напряжение — 20 кВ, скорость вращения коллектора — 200 об./мин, скорость подачи раствора — 1 мл/ч. В качестве коллектора использовали металлический штифт диаметром 8,0 мм.
Изготовление биодеградируемых заплат с инкорпорированным сосудистым эндотелиальным фактором роста (vascular endothelial growth factor, VEGF; Sigma-Aldrich, США) проводили методом эмульсионного электроспиннинга из смеси 5% полигидроксибутирата/ валерата (poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate), ПГБВ; Sigma-Aldrich, США) и поликапролактона (poly(£-caprolactone), ПКЛ; Sigma-Aldrich, США) в три-хлорметане в соотношении 1:2, смешивая его с VEGF в физиологическом растворе (10 мкг/мл) в соотношении 20:1 [18]. Оптимальными параметрами электроспиннинга заплат ПГБВ/ПКЛ/VEGF были следующие: игла — 22G, расстояние до коллектора — 15 см, напряжение — 20 кВ, скорость вращения коллектора — 200 об./мин, скорость подачи раствора — 0,5 мл/ч. В качестве коллектора использовали металлический штифт диаметром 8,0 мм. Матриксы разрезали вдоль и снимали со штифта постепенными отслаивающими движениями.
Свойства тканеинженерных матриксов оценивали в сравнении с лоскутами из бычьего КП «КемПериплас-Нео» (ЗАО «НеоКор», Россия), которые используются в качестве заплаты в сосудистой хирургии при проведении каротидной эндартерэктомии.
Исследование поверхностной структуры заплат. Образцы сосудистых заплат размером 0,25 см2
подвергали напылению Ag-Pd с помощью системы EM ACE200 (Leica Microsystems GmbH, Австрия) для получения покрытия толщиной 15 нм. Структурные особенности поверхности матриксов изучали на сканирующем микроскопе S-3400N (Hitachi, Япония) в условиях высокого вакуума при ускоряющем напряжении 10 кВ.
Оценка физико-механических свойств заплат.
Вырубку всех образцов осуществляли в продольном направлении (n=5 в каждой группе). Оценку физико-механических свойств сосудистых заплат проводили в соответствии с ГОСТ 270-75 в условиях одноосного растяжения на универсальной испытательной машине серии Z (Zwick/Roell, Германия) с использованием датчика с номинальной силой 50 Н; скорость перемещения траверсы при испытании — 50 мм/мин. Прочность материала определяли по максимальному напряжению при растяжении образцов (МПа) и силе, приложенной к образцу до начала его разрушения (Fmax, Н). Упруго-деформативные свойства материала оценивали по относительному удлинению, скорректированному с учетом характера разрушения образцов (характеризует эластичность материала, %), и модулю Юнга (характеризует жесткость материала, МПа).
Группой сравнения выступали КП-лоскуты. В качестве контроля использовали сонную артерию (a. carotis) овцы и внутреннюю грудную артерию человека (a. mammaria), которую получали при проведении операции аортокоронарного шунтирования у пациентов, подписавших добровольное информированное согласие на взятие материала.
Оценка гемосовместимости сосудистых заплат. Гемосовместимость тканеинженерных сосудистых заплат определяли по степени гемолиза эритроцитов, агрегации, адгезии и активации тромбоцитов после контакта с исследуемым материалом.
Оценка степени гемолиза эритроцитов. Степень гемолиза эритроцитов устанавливали после контакта исследуемого материала со свежей цитратной кровью. Образцы заплат (n=6) размером 25 см2 инкубировали в кюветах с 10 мл физиологического раствора в термостате при 37°С в течение 2 ч. Далее в каждую кювету вносили по 200 мкл свежей цитратной крови, перемешивали и продолжали выдерживать в термостате при 37°С в течение 60 мин. Физиологический раствор и дистиллированную воду использовали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно. После завершения инкубации раствор из кювет отбирали в пробирки и центрифугировали при 2800 об./мин в течение 10 мин с целью осаждения эритроцитов. На спектрофотометре Genesys 6 (Thermo Fisher Scientific, США) измеряли оптическую плотность надосадоч-ных растворов при длине волны 545 нм. Степень гемолиза (H, %) определяли по формуле (Dt-Dne)/ (Dpe-Dne)-100%, где Dt — оптическая плотность пробы, инкубируемой с экспериментальным образцом; Dne — оптическая плотность отрицательного
контроля (пробы с физиологическим раствором); Dpe — оптическая плотность положительного контроля (пробы после 100% гемолиза) [19, 20]. В качестве положительного контроля (полное отсутствие гемолиза) принимали среднее значение оптической плотности при измерении проб физиологического раствора с кровью (было равно 0). В качестве отрицательного контроля принимали среднее значение оптической плотности проб после инкубации крови с дистиллированной водой (100% гемолиз).
Оценка агрегации тромбоцитов. Оценку агрегации тромбоцитов проводили после контакта донорской плазмы с исследуемым материалом в соответствии со стандартом ISO 10993.4. К свежей донорской крови добавляли 3,8% раствор цитрата натрия (в соотношении 9:1) и затем центрифугировали при 1000 об./мин в течение 10 мин. Полученную обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП) использовали в качестве положительного контроля реакции агрегации тромбоцитов. Для калибровки прибора применяли бедную тромбоцитами плазму, которую получали в результате повторного центрифугирования ОТП при 4000 об./мин в течение 20 мин. Исследуемые образцы помещали в кюветы с ОТП на 3 мин, затем добавляли индуктор агрегации тромбоцитов АДФ (АГРЕНАМ, АГ-6; НПО «РЕНАМ», Россия) в концентрации 20 мкМ/л. Агрегацию тромбоцитов оценивали с помощью полуавтоматического 4-канального анализатора АРАСТ 4004 (LABiTec, Германия). Спустя 5 мин регистрировали максимальный процент агрегации тромбоцитов (%).
Оценка адгезии тромбоцитов. Степень адгезии тромбоцитов определяли после инкубации исследуемых образцов размером 0,25 см2 с 300 мкл ОТП в течение 1 ч при 37°С. С целью удаления не-адгезированных тромбоцитов препараты промывали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ; рН=7,4), затем фиксировали в 4% растворе параформальдегида в течение 10 мин. Далее образцы инкубировали с кроличьими антителами к CD41 (ab134131; Abcam, Великобритания) и мышиными антителами к CD62P (ab54427; Abcam, Великобритания) в течение 12 ч при 4°С. После этого матриксы отмывали ФСБ с добавлением 0,1% Tween 20. Затем образцы инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре со вторичными антителами козы к IgG кролика, конъюгированны-ми с Alexa Fluor 488 (A11034; Thermo Fisher Scientific, США) и антителами козы к IgG мыши, конъюгиро-ванными с Alexa Fluor 555 (A31570; Thermo Fisher Scientific, США). Срезы повторно отмывали ФСБ с добавлением 0,1% Tween 20. Для анализа препаратов использовали конфокальный микроскоп (LSM700; Carl Zeiss, Германия).
Изучение матриксных свойств. Адгезионные свойства матриксов исследовали по площади, занимаемой белком фокальной адгезии Talin. Для этого подготовленные образцы фиксировали в течение 10 мин в 4% растворе параформальдегида, пермеабилизи-ровали 0,1% Triton X100 15 мин. Неспецифическое
связывание блокировали 1% раствором бычьего сывороточного альбумина в ФСБ в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее образцы инкубировали с первичными антителами кролика Talin (abcam, ab71333; Abcam, Великобритания) при 4°C в течение ночи. После отмывания в ФСБ образцы инкубировали 1,5 ч со вторичными антителами Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody Alexa Fluor 488 (A21206; Thermo Fisher Scientific, США) и Phalloidin Alexa Fluor 568 (A12380; Invitrogen, США). Далее образцы повторно отмывали ФСБ от несвязавшихся вторичных антител и контрастировали ядра с помощью 10 мг/мл DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochlorid) (D9542; Sigma-Aldrich, США) в течение 40 мин. Готовые образцы отмывали и монтировали под покровные стекла в ProLong medium (P36930, Life Technologies, США) и исследовали на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе LSM 700 (Carl Zeiss, Германия).
Статистическая обработка данных. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Prism (Graph Pad Software). Соответствие распределения полученных данных нормальному оценивали с применением критерия Колмогорова-Смирнова. Сравнение двух независимых групп выполняли с использованием критерия Манна-Уитни. Для оценки межгрупповых различий у трех и более групп применяли непараметрический критерий Краскела-Уоллиса, при попарном сравнении групп — критерий Данна. Достоверными считали различия при уровне значимости p<0,05, при попарном сравнении групп — р<0,05/к, где k — количество сравниваемых групп. Данные представляли в виде медианы, 25-го и 75-го процентилей (Ме [25%; 75%]).
Результаты и обсуждение
Структурные особенности сосудистых заплат. Сканирующая электронная микроскопия образцов из ФШ показала, что их внутренняя поверхность представлена тесно переплетенными между собой плоскими волокнами; присутствовали участки спаек волокон, а также небольшое количество неглубоких пор (рис. 1, а). Средний диаметр волокон на поверхности — 4,80±1,39 мкм.
Исследование поверхности матриксов ПГБВ/ПКЛ/ VEGF также показало их высокопористую волокнистую структуру, представленную разнонаправленными фибриллами толщиной 1,47±0,67 мкм (рис. 1, б).
Сканирующая электронная микроскопия КП-лоску-тов показала сохранность их нативной структуры, наблюдалась рельефность поверхности, обусловленная извитым расположением волокон коллагена. Наличие единичных пор на поверхности можно объяснить плотным расположением коллагеновых фибрилл (рис. 1, в).
Таким образом, образцы из ФШ и ПГБВ/ПКЛ/VEGF обладали более «рыхлой» и пористой структурой по
//////////////////////^^^^
44 СТМ 1 2023 I том 15 I №4 Е.С. Прокудина, Е.А. Сенокосова, Л.В. Антонова, Е.О. Кривкина, Е.А. Великанова, ..., Н.А. Кочергин
а,
I
со Я
О)
-о
я
е.
с I
к
Е Ъ
ЕГ
5 |
-о
и ^
I
й р
я »
о о
я §
„ I
о |
3 I
- %
я -о
о
ш р «
я %
ъ 3
I
стч -о о я
я 2 »
Е I
р
,1
к>
о
-1 ^ г о
-1 £ I
? §
° £
я °
■< 2
Ч СО
О X
СО 03
~ 1
со о я
х: а>
о сг
■ ™ 5
-с? 03
? 2
со
° Xе,
0" 03
_ тз
О 03
з!
° 5
ГО о £ X
х т
. , го N3 ¡г
о • о т; о х< о тз а>
х го
о а> х
о а» тз оз
со
% 2
9 § Р. 05'
О ^
9
^ л о
=1 я ~~1 ^ СП
го о
< Р
ТЗ £3
03 Н
СО X
03 Л
™ ^
а> сг
§ 1
а> з
со "
оз ^
о ^
¡8
11
2 со
тз
л о
<
гп
О
"П
а> ¡г
тз
р
N
•Э ^
03
4
тз
IV)
тз
03 со 03
а> тз х
03
ь
03
=1
тз
? <
3 гп
4 О ^ "Л
а>
I о
I я
^ 03
"В
§ -
Х< IV)
3 *
р -
ТЗ го
X сг
а> 5 О 03
_5о т;
>< о а>
СО -£3
оз 2
X со
ь х:
03 ><
" Е
© ®
X -с
о си
О 2
£ =1
СП
го
X
03
¡1 5 03
0) <
ш ГП
-с? о 0) а о "П
со'
ТЗ о
X о о
о о
с ч го а> ч
N3 ¡Г
0) 9
05 го о
() 3 го
ь 03
т 1X1 ^
03 03
т; о 3
о Ц) э Ф' ч (V)
X т;
о
03 X § о го о х<
тз го
X 1 со 1 ><
=1
тз о
-С X
о о й р
•< а>
ь со
5 I
Ȥ
9 "
-3 I
"О ^
£ 3 ю
N3 Й
СП ГО
>< о а»
тз ><
X о §
ч о
03 го
^
^ со
X X
X СГ
со
о о
т; о х< о 0 1
х ГО
-п ®
ТЗ "С
03 ё
5 я
® Р
"5 О
Е-&
1 ы
03 ><
4
х со
го I
5 05
Е -с
х а>
X
О 3
о я
2 == ё ь
03 ? *
А, °
ъз
х
о
^ оз
X СО О 03
N3 3
Я
си
'Г-' ><
в* в я Е 3
I ^ 03
X тз
О 3
1=1 о
X ' ь N3 оз .¡^
о ~
0" Ой го
ч сг
со ^
* в
0 ^ го ^ 1 N3
1 о 00
о Ч -о
о о оз Ч 2 со 0" 03
го
00 кч 1
1 IV) X
^ со *
1 ^ ? 25 Л
СО _ 2
тз
■Д <1 о 3 И о
1 § I
1 § 1< оз з 03
^ ^ тз 103 ® I §1
ё оз х
о го
сг
тз
л о
3 О « 3
о с Е |
о
0
1 с
I
О 03
А 2 о"
Р ^ 0"
<о < =
С — 2
* N3 X
1=1 ч о
03 тз тз
Го оз оз
оз О го
1Г 5 а
П к. Ф
5 "О э
ш9 *
Е N3 §
°>05 О
^ О) т;
оз V-" 03
го ь I 05
0) о
о о о
2
^ 1=1
и "О
■5 ° 1=1
о о
05 -5 ь тз
0- 05 сг го
I § §1
8 §
03 ^
тз 2 О) ш
03 0)
о
-& 0-
О 0)
я I
о 1 1=1 I
^ 0) § ^
0)
-ё1 В)
О 0)
^ тз Е §
§ 05 ^ съ
0) I
=1 ^ I 5
а ё
"О ГО
03 ~
Ы X
ТЗ 0)
сг тз
ш т
о) Ц
11 0) "
11
0) тз
0
X
1
о о
0)
0)
о
тз ^
о
тз ^
тз о
0)
0) X
I 0)
о тз
=1 0)
а> т7,
тз Ч
^ -2 ТЗ
0) ^
^ I
0) X О 0)
ь -о
3 р
Е ю
X ■ и А
^ у
г! о ■
ш
0
X и
1
■С
о о я
о
X
и тз и
о тз
о
4
я
5
я и I
о
X
N
0
1
0 тз
1
(Г
Относительное удлинение,'
Напряжение, МПа
Модуль Юнга, МПа
«, н
V
о о
о <
ч
СП
а>
03 X
4
03
о о о
5
5
03
тз сг
I ^
Ф 03
9 1
р 1
о I
=1 *
тз Л5
а>
СО ТЗ
=1 I
^
о о
03 т; 03
я
о о о а» а>
X X
о о
о 2 (Г
2 9< ь ^ ^
3 со сг
ТЗ 3
со о
СО о
^ 5
а>
— ^
а» *
Е 2 со
О 3
§ в
X о
со го
X
Е о-
о О ■
^ N
X
т; 0) а> -
го ><
О й
3
о
тз о
§ X
° I 9 I
X со
го
Е £
со X ? §
Го о ^
^ о
^ ПЗ
¡г ■ ^ тз
03 X
о 2 ■
03 IV) ^ —'
о
03 о Ь -С
СГ X
X о
0 £3 р
тз 3 ср ><
1 5
о
ГО Х(
СО X
х т
^ =1
О -1
О СП
о СП
и
о
о 0) тз
0 ы
1
0) я
о тз
0
1
0) ь о о
О ш .
^ I ч
а\ а
Ч П"
н-о Н| ^ ф -л
ТЗ I и 05 I о
т 20
81 я -а
ш ><
е □ з 5 ° £
ТЗ ф тз
0) тз и ^ °»
Ч О
0" тз - §
о л
г
и
ч =| г
- тз ч о тз
0 0)
1
о
0) тз
11*
5 0) тз
II
^ Ш
I
г сп
0) тз 1=1 05
о
о 1 о
о ш 1=1
а а
тз
5 Е 0)
и ь 0)
0)
-&-Й 0) ^
ТЗ =1
о о
СП
в о н
РЧ
И
§
о
в в
биологических заплат в кардиохирургических операциях [23]. Эластичность КП-лоскутов была почти в 2 раза ниже, чем у сонной артерии овцы, и в 3,5 раза выше, чем у внутренней грудной артерии человека ^<0,01) (см. рис. 2, в). Жесткость КП-лоскута была в 9 раз ниже, чем у ПГБВ/ПКЛ/VEGF-заплат ^<0,01) (см. рис. 2, г).
В целом физико-механические испытания показали, что матриксы из ФШ по своим характеристикам наиболее приближены к свойствам нативных артерий, что может способствовать адекватной интеграции материала при дальнейшей имплантации заплат в сосудистую стенку.
Результаты оценки гемолиза эритроцитов. Степень гемолиза эритроцитов после контакта крови с матриксами из ФШ и ПГБВ/ПКЛ/VEGF была незначительной и статистически значимо не отличалась между группами (см. таблицу), что указывает на высокую гемосовместимость исследуемых материалов [24].
Гемолиз эритроцитов после контакта с КП-лоскутом был выше, чем после контакта с ФШ и ПГБВ/ПКЛ/ VEGF — в 3,3 и 10,0 раз соответственно ^<0,017) (см. таблицу), однако не превышал максимально допустимых значений [24].
Результаты гемолиза и агрегации тромбоцитов (п=6 в каждой группе), Ме [25%; 75%]
Образец Степень гемолиза эритроцитов, % Максимум агрегации тромбоцитов, %
Фиброин шелка 0,006 [0,004; 0,024] 86,41 [84,45; 90,03]
ПГБВ/ПКЛ/VEGF 0,002 [0,001; 0,002] 86,02 [83,02; 87,62]
Бычий ксеноперикард 0,020 [0,016; 0,025]* 85,03 [83,57; 87,16]
Обогащенная тромбоцитами плазма — 83,97 [81,75; 86,14]
* р<0,017 в сравнении с ПГБВ/ПКЛ^БСР (полигидроксибутиратом/ва-лератом/поликапролактоном с инкорпорированным сосудистым эндо-телиальным фактором роста).
Результаты оценки агрегации тромбоцитов. После контакта плазмы с исследуемыми образцами статистически значимых межгрупповых различий в агрегации тромбоцитов не выявлено. Все материалы вызывали незначительную агрегацию тромбоцитов, которая не отличалась от таковой у ОТП (см. таблицу).
Результаты оценки адгезии и активации тромбоцитов. На матриксах из ФШ регистрируется наименьшая адгезия тромбоцитов. Аналогичная картина наблюдалась и для КП-лоскутов. На ПГБВ/ПКЛ/ VEGF-заплатах адгезия тромбоцитов была более выраженной (рис. 3, а). Наряду с этим на ФШ-матриксах наблюдалась наименьшая активация адгезированных тромбоцитов, уровень которой статистически значимо отличался от таковой для ПГБВ/ПКЛ/VEGF-матриксов и КП-лоскутов ф<0,017) (рис. 3, б).
На основе полученных данных можно сделать вывод об оптимальной гемосовместимости матриксов из ФШ, которая соответствует таковой для заплат на основе ПГБВ/ПКЛ/VEGF и КП, а в случае адгезии и активации тромбоцитов гемосовместимость ФШ-образцов даже превосходит другие препараты.
Результаты оценки матриксных свойств сосудистых заплат. Культивирование EA.hy926-клеток на поверхности изучаемых матрик-сов в течение 3 сут показало идентичную биологическую привлекательность всех изучаемых материалов. Так, общее количество адгезированных клеток на всех видах матриксов в среднем по медианам находилось на уровне 105,7 кл./мм2, что в 4 раза ниже плотности заселения EA.hy926 на культуральном пластике — 444,2 [425,3; 491,4] кл./мм2, p<0,05 (рис. 4, а). Жизнеспособность эндотели-альных клеток также не достигла высоких значений и варьировала от 0 до 33% (рис. 4, б). Жизнеспособность неотъем-
ФШ
ПГБВ/ПКЛ/VEGF
* „ а
ц \ " ? • 4»
v fv i *г . - \
'-> \ ^ Ч-
<г t V
<«
V*" 251 J ¿1 ' h Äf
* .у
*_' %_ «в- А» \
0,0003
<0,0001 <0,0001 0,0022
i
ПГМ1 -J-
ФШ ПГБВ/ПКЛ/VEGF КП
CD41 (вое тромбоциты)
CD62p (активированные тромбоциты)
б
а
Рис. 3. Конфокальная микроскопия тромбоцитов: зеленый — CD41; красный — CD62р; желтый — наложение окрасок, бар — 50 мкм (а), и интенсивность сигнала CD41 и CD62р (б)
ФШ — фиброин шелка, КП — бычий ксеноперикард, ПГБВ/ПКЛ/VEGF — полигидроксибутират/валерат/поликапролактон с инкорпорированным сосудистым эндотелиальным фактором роста
600-1
см
>
S 400-
СС
X
^
о
ICI) 200-
с;
0-
<0,0001
0,0003
•£
Пластик ФШ ПГБВ/ПКЛ/VEGF КП
ЮОп
95
90
854. 20 Y
151050-
<0,0001
ЧЗС-
0,0126
0,0145
X
Пластик ФШ ПГБВ/ПКЛ/VEGF КП
4.84.0-
■=с 3.20)
0.40.20.0
f
^
ФШ ПГБВ/ПКЛ/VEGF КП
в
б
а
Рис. 4. Матриксные свойства сосудистых заплат:
а — плотность клеток на 1 мм2; б — жизнеспособность; в — метаболическая активность. ФШ — фиброин шелка, КП — бычий ксеноперикард, ПГБВ/ПКЛ/VEGF — полигидроксибутират/валерат/поликапролактон с инкорпорированным сосудистым эндотелиальным фактором роста
Рис. 5. Конфокальная микроскопия клеток EA.hy926: синий — DAPI; зеленый — Talin; красный — f-актин, бар — 50 мкм (а), и площадь Talin и f-актина (б)
ФШ — фиброин шелка, КП — бычий ксеноперикард, ПГБВ/ПКЛ/VEGF — полигидроксибутират/валерат/поликапролактон с инкорпорированным сосудистым эндотелиальным фактором роста
лема от метаболической активности клеток, которая держалась на равном для всех видов матриксов уровне — 0,1 усл. ед. (рис. 4, в).
Иммунофлуоресцентное окрашивание эндоте-лиальных клеток на белок фокальной адгезии Talin и белок цитоскелета f-актин показало особенности ландшафта каждого исследуемого материала (рис. 5, а). На культуральном пластике был получен
эталонный монослой клеток, которые стремились к своей правильной гексагональной форме и плотно контактировали между собой. Схожая картина наблюдается на ранних этапах эндотелизации сосудистых протезов [25].
Площадь фокальной адгезии белка Talin для культу-рального пластика была наибольшей и соответствовала плотности белка цитоскелета — f-актина (рис. 5, б).
^шттттттттттт*^^
Тканеинженерный сосудистый матрикс на основе регенерированного фиброина шелка СТМ J 2023 J том 15 J №4 47
На всех видах матриксов не обнаружен монослой клеток. На ФШ активация интегриновых рецепторов и формирование очагов фокальной адгезии были максимальными в сравнении с другими матриксами: отмечена наибольшая площадь Talin и f-актина. На поверхности ФШ обнаружены очаги скопления клеток веретенообразной формы с малым количеством контактов, однако вместе с тем присутствовали конгломераты ошаренных клеток. На ПГБВ/ПКЛ/VEGF и КП форма и характер распределения флуоресцирующих белков были схожи: от округлой до более равно вытянутой во всех направлениях. Межклеточных контактов немногим больше на ПГБВ/ПКЛ/VEGF (видимо, вследствие выделения из полимерных нитей сосудистого фактора роста).
В целом можно заключить, что матриксные свойства и адгезионность нового разрабатываемого материала на основе 15% ФШ находятся на уровне разработанного нами ранее искусственного ПГБВ/ПКЛ/ VEGF-материала, а также децеллюризированного коммерческого бычьего КП.
Заключение
В настоящем исследовании проведена комплексная сравнительная оценка в экспериментах in vitro физико-механических характеристик и биосовместимости тканеинженерных сосудистых заплат. По большинству исследуемых показателей матриксы, изготовленные из 15% фиброина шелка, продемонстрировали удовлетворительные результаты, сопоставимые с таковыми для ранее разработанного материала ПГБВ/ПКЛ/VEGF, а также коммерческого КП-лоскута, а в случае адгезии и активации тромбоцитов — превосходили указанные заплаты.
В совокупности фиброин шелка можно определить как материал с достаточной биологической совместимостью, что позволяет считать изготовленный из него тканеинженерный матрикс перспективным для имплантации в стенку кровеносных сосудов. Однако необходимы дальнейшие исследования этих матриксов в качестве сосудистых заплат.
Финансирование. Работа выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ №0419-2022-0003 «Разработка новых изделий медицинского назначения для сердечно-сосудистой хирургии. Переход к персонализированной медицине и высокотехнологичному здравоохранению. Создание систем обработки больших объемов данных, машинного обучения и искусственного интеллекта» при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках национального проекта «Наука и университеты».
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Литература/References
1. Fukuda S., Shimogonya Y., Yonemoto N., Fukuda M., Watanabe A., Fujiwara K., Enomoto R., Hasegawa K., Yasoda A., Tsukahara T.; NHO Carotid CFD Study Group. Hemodynamic risk factors for the development of carotid stenosis in patients with unilateral carotid stenosis. World Neurosurg 2022; 160: e353-e371, https://doi.org/10.1016/j. wneu.2022.01.019.
2. Messas E., Goudot G., Halliday A., Sitruk J., Mirault T., Khider L., Saldmann F., Mazzolai L., Aboyans V. Management of carotid stenosis for primary and secondary prevention of stroke: state-of-the-art 2020: a critical review. Eur Heart J Suppl 2020; 22(Suppl M): M35-M42, https://doi.org/10.1093/ eurheartj/suaa162.
3. AbuRahma A.F., Avgerinos E.D., Chang R.W., Darling R.C. III, Duncan A.A., Forbes T.L., Malas M.B., Murad M.H., Perler B.A., Powell R.J., Rockman C.B., Zhou W. Society for Vascular Surgery clinical practice guidelines for management of extracranial cerebrovascular disease. J Vasc Surg 2022; 75(1S): 4S-22S, https://doi.org/10.1016/j. jvs.2021.04.073.
4. Suroto N.S., Rantam F.A., Al Fauzi A., Widiyanti P., Turchan A., Pangaribuan V. Selection criteria for patch angioplasty material in carotid endarterectomy. Surg Neurol Int 2022; 13: 362, https://doi.org/10.25259/sni_470_2022.
5. Antonova L.V., Krivkina E.O., Sevostianova V.V., Mironov A.V., Rezvova M.A., Shabaev A.R., Tkachenko V.O., Krutitskiy S.S., Khanova M.Y., Sergeeva T.Y., Matveeva V.G., Glushkova T.V., Kutikhin A.G., Mukhamadiyarov R.A., Deeva N.S., Akentieva T.N., Sinitsky M.Y., Velikanova E.A., Barbarash L.S. Tissue-engineered carotid artery interposition grafts demonstrate high primary patency and promote vascular tissue regeneration in the ovine model. Polymers (Basel) 2021; 13(16): 2637, https://doi.org/10.3390/polym13162637.
6. Ханова М.Ю., Великанова Е.А., Глушкова Т.В., Матвеева В.Г Создание персонифицированного клеточнозасе-ленного сосудистого протеза in vitro. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний 2021; 10(2): 89-93, https://doi.org/10.17802/2306-1278-2021-10-2S-89-93.
Khanova M.Yu., Velikanova E.A., Glushkova T.V., Matveeva V.G. Development of personalized cell-populated vascular graft in vitro. Kompleksnye problemy serdecno-sosudistyh zabolevanij 2021; 10(2): 89-93, https://doi. org/10.17802/2306-1278-2021-10-2S-89-93.
7. Fang G., Sapru S., Behera S., Yao J., Shao Z., Kundu S.C., Chen X. Exploration of the tight structural-mechanical relationship in mulberry and non-mulberry silkworm silks. J Mater Chem B 2016; 4(24): 4337-4347, https://doi. org/10.1039/c6tb01049k.
8. Агапова О.И., Ефимов А.Е., Мойсенович М.М., Богуш В.Г., Агапов И.И. Сравнительный анализ трехмерной наноструктуры пористых биодеградируемых матриксов из рекомбинантного спидроина и фиброина шелка для регенеративной медицины. Вестник трансплантологии и искусственных органов 2015; 17(2): 37-44, https://doi. org/10.15825/1995-1191-2015-2-37-44.
Agapova O.I., Efimov A.E., Moisenovich M.M., Bogush V.G., Agapov I.I. Comparative analysis of three-dimensional nanostructure of porous biocompatible scaffolds made of recombinant spidroin and silk fibroin for regenerative medicine. Vestnik transplantologii i iskusstvennyh organov 2015; 17(2): 37-44, https://doi.org/10.15825/1995-1191-2015-2-37-44.
//////////////////////^^^^
48 СТМ 1 2023 I том 15 I №4 Е.С. Прокудина, Е.А. Сенокосова, Л.В. Антонова, Е.О. Кривкина, Е.А. Великанова, ..., Н.А. Кочергин
9. Cetin Y., Sahin M.G., Kok F.N. Application potential of three-dimensional silk fibroin scaffold using mesenchymal stem cells for cardiac regeneration. J Biomater Appl 2021; 36(4): 740-753, https://doi.org/10.1177/08853282211018529.
10. Gavrilova N.A., Borzenok S.A., Revishchin A.V., Tishchenko O.E., Ostrovkiy D.S., Bobrova M.M., Safonova L.A., Efimov A.E., Agapova O.I., Agammedov M.B., Pavlova G.V., Agapov I.I. The effect of biodegradable silk fibroin-based scaffolds containing glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) on the corneal regeneration process. Int J Biol Macromol 2021; 185: 264-276, https://doi. org/10.1016/j.ijbiomac.2021.06.040.
11. Partlow B.P., Hanna C.W., Rnjak-Kovacina J. Moreau J.E., Applegate M.B., Burke K.A., Marelli B. Mitropoulos A.N., Omenetto F.G., Kaplan D.L. Highly tunable elastomeric silk biomaterials. Adv Funct Mater 2014; 24(29) 4615-4624, https://doi.org/10.1002/adfm.201400526.
12. Агаммедов М.Б., Островский Д.С., Соболев В.П. Ушакова Л.И., Агапов И.И., Гаврилова Н.А., Борзенок С.А Патогенетические особенности восстановления поверхностных повреждений роговицы при помощи биодегра-дируемых конструкций на основе фиброина шелка. Патогенез 2022; 20(4): 63-68, https://doi.org/10.25557/2310-0435.2022.04.63-68.
Agammedov M.B., Ostrovsky D.S., Sobolev V.P., Ushakova L.I., Agapov I.I., Gavrilova N.A., Borzenok S.A. Pathogenetic and regenerative features of corneal damage repair with biodegradable materials based on silk fibroin. Patogenez 2022; 20(4): 63-68, https://doi.org/10.25557/2310-0435.2022.04.63-68.
13. Meinel L., Hofmann S., Karageorgiou V., Kirker-Head C., McCool J., Gronowicz G., Zichner L., Langer R., Vunjak-Novakovic G., Kaplan D.L. The inflammatory responses to silk films in vitro and in vivo. Biomaterials 2005; 26(2): 147-155, https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2004.02.047.
14. Sun W., Gregory D.A., Tomeh M.A., Zhao X. Silk fibroin as a functional biomaterial for tissue engineering. Int J Mol Sci 2021; 22(3): 1499, https://doi.org/10.3390/ijms22031499.
15. Alessandrino A., Chiarini A., Biagiotti M., Dal Pra I., Bassani G.A., Vincoli V., Settembrini P., Pierimarchi P., Freddi G., Armato U. Three-layered silk fibroin tubular scaffold for the repair and regeneration of small caliber blood vessels: from design to in vivo pilot tests. Front Bioeng Biotechnol 2019; 7: 356, https://doi.org/10.3389/fbioe.2019.00356.
16. Chan A.H.P., Filipe E.C., Tan R.P., Santos M., Yang N., Hung J., Feng J., Nazir S., Benn A.J., Ng M.K.C., Rnjak-Kovacina J., Wise S.G. Altered processing enhances the efficacy of small-diameter silk fibroin vascular grafts. Sci Rep 2019; 9(1): 17461, https://doi.org/10.1038/s41598-019-53972-y.
17. Dingle Y.T.L., Bonzanni M., Liaudanskaya V., Nieland T.J.F., Kaplan D.L. Integrated functional neuronal network analysis of 3D silk-collagen scaffold-based mouse cortical culture. STAR Protoc 2021; 2(1): 100292, https://doi. org/10.1016/j.xpro.2020.100292.
18. Антонова Л.В., Миронов А.В., Шабаев А.Р., Сильни-ков В.Н., Кривкина Е.О., Матвеева В.Г., Великанова Е.А.,
Сенокосова Е.А., Ханова М.Ю., Севостьянова В.В., Глушкова Т.В., Мухамадияров Р.А., Барбараш Л.С. Ткане-инженерные сосудистые заплаты — сравнительная характеристика и результаты преклинических испытаний на модели овцы. Вестник трансплантологии и искусственных органов 2022; 24(4): 94-108, https://doi.org/10.15825/1995-1191-2022-4-94-108.
Antonova L.V., Mironov A.V., Shabaev A.R., Silnikov V.N., Krivkina E.O., Matveeva V.G., Velikanova E.A., Senokosova E.A., Khanova M.Yu., Sevostyanova V.V., Glushkova T.V., Mukhamadiyarov R.A., Barbarash L.S. Tissue-engineered vascular patches: comparative characteristics and preclinical test results in a sheep model. Vestnik transplantologii i iskusstvennyh organov 2022; 24(4): 94-108, https://doi.org/10.15825/1995-1191-2022-4-94-108.
19. Антонова Л.В., Севостьянова В.В., Резвова М.А., Кривкина Е.О., Кудрявцева Ю.А., Барбараш О.Л., Барбараш Л.С. Технология изготовления функционально активных биодеградируемых сосудистых протезов малого диаметра с лекарственным покрытием. Патент РФ 2702239. 2019.
Antonova L.V., Sevost'yanova V.V., Rezvova M.A., Krivkina E.O., Kudryavtseva Yu.A., Barbarash O.L., Barbarash L.S. Technology of producing functionally active biodegradable small-diameter vascular prostheses with drug coating. Patent RU 2702239. 2019.
20. Ye X., Wang Z., Zhang X., Zhou M., Cai L. Hemocompatibility research on the micro-structure surface of a bionic heart valve. Biomed Mater Eng 2014; 24(6): 2361-2369, https://doi.org/10.3233/bme-141049.
21. Wang Z., Lin M., Xie Q., Sun H., Huang Y., Zhang D., Yu Z., Bi X., Chen J., Wang J., Shi W., Gu P., Fan X. Electrospun silk fibroin/poly(lactide-co-£-caprolactone) nanofibrous scaffolds for bone regeneration. Int J Nanomedicine 2016; 11: 14831500, https://doi.org/10.2147/ijn.s97445.
22. Zhang X., Xiao L., Ding Z., Lu Q., Kaplan D.L. Fragile-tough mechanical reversion of silk materials via tuning supramolecular assembly. ACS Biomater Sci Eng 2021; 7(6): 2337-2345, https://doi.org/10.1021/acsbiomaterials. 1c00181.
23. Di Nardo A., Louvelle L., Romero D.A., Doyle M., Forbes T.L., Amon C.H. A comparison of vessel patch materials in tetralogy of Fallot patients using virtual surgery techniques. Ann Biomed Eng 2023; 1, https://doi.org/10.1007/s10439-03144-x.
24. Jolee Bartrom B.S. ASTM hemolysis. p. 1-12.
25. Sevostianova V.V., Antonov Yuzhalin A.E., Silnikov V.N., Glus
26. hkova T.V., Godovik
Bolbasov E., Akentyeva T.N Velikanova E.A., Tarasov^ patches for arterial peptides: results 2020; 5(34): 21 0c02593.
.G., dable RGD Omega acsomega.
