CC BY
53
УДК 619:616.995.132.6
НОВЫЙ ТИП ЛИПИД-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА P-45kDa НЕМАТОДЫ TRICHINELLA SPIRALIS
Г. РАДОСЛАВОВ, И. БАНКОВ
Институт экспериментальной патологии и паразитологии Болгарской АН
А.В.УСПЕНСКИЙ доктор ветеринарных наук
И.И. БЕНЕДИКТОВ доктор биологических наук Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им.
К.И.Скрябина
Из мышечных личинок Trichinella spiralis выделен, очищен с помощью ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе и гельфильтрации на Сефадексе Г-75 и частично охарактеризован новый тип липид-связывающего белка P-45kDa. P-45kDa состоит преимущественно из p-глобулярных структур. Методом масс-спектроскопии определена молекулярная масса белка, равная 48,14 kDa. P-45kDa может быть использован для видовой дифференциации трихинелл и в качестве ДНК-диагностикума.
Ключевые слова: Trichinella spiralis, личинки, ионообменная хроматография, гельфильтрация, молекулярная масса.
Липидный обмен паразитических За последние десять лет отмечено
нематод ограничен, так как они не в интенсивное развитие методов изуче-
состоянии осуществлять синтез высо- ния тонких механизмов биологиче-
комолекулярных жирных кислот и в- ских процессов в живых организмах.
окисление липидов. По этой причине Особое внимание заслуживают техно-
паразит находится в прямой зависимо- логии рекомбинантных ДНК, которые
сти от импорта жирных кислот хозяи- предоставляют возможность изучать в
на. В этом процессе ведущую роль иг- деталях свойства жизненно важных
рают липид-связывающие белки, яв- белков.
ляющиеся переносчиками липофиль- На основе биологических, биохи-
ных компонентов в межклеточных мических и молекулярно-биологичес-
пространствах, клетках, тканях и при ких признаков (28) дифференцируют 7
трансмембранном транспорте. По сво- видов сем. TrichmelHdae (Trichinella
ей природе эти белки составляют britovi, T.murulli , T.natura, T.nelsoni,
большую группу различных в струк- T.pseudospiralis, T.spiralis и T.papae) и
турном отношении химических со- 3 генотипа неопределенного таксоно-
единений, объединенных общей мического статуса (T6, T8 и T9).
функцией в метаболизме живых орга- Виды трихинелл составляют две
низмов. группы - капсульные и бескапсуль-
Российский паразитологический журнал, 2008, № 2 1
ные. Бескапсульные виды трихинелл заражают млекопитающих и птиц (T. pseudospiralis), млекопитающих и рептилий (T.. papae и T.zimbabwensis). К капсульным видам относят T. spiralis, T. nativa и Trichinella sp. T6, встречающиеся в арктических районах, а также T. nelsoni, распространенные в экваториальной области.
На территории Болгарии обнаружены три вида трихинелл - T. spiralis, T. britovi и T. pseudospiralis. У диких животных чаще всего обнаруживают T. britovi [16, 43].
Трихинеллез является серьезным заболеванием на территории Европы. Установлено, что основным источником заражения людей трихинеллами является лошадиное мясо. В Европе выявлено свыше 3350 зараженных людей в 14 странах. Самое широкое распространение имеет трихинеллез на территории Восточной Европы, где заражение происходит в основном после употребления свинины. Согласно докладу Международной трихинел-лезной комиссии (2004) на территории Восточной Европы зарегистрировано более 1100 случаев заражения людей (984 - в Сербии, Хорватии, Румынии и Болгарии).
Возможная величина генома T. spiralis составляет 270 Mb, хотя результаты ряда плазмидных и фагмид-ных секвенирований показали, что он, возможно, гораздо меньше - 65 Mb. Секвенирование генома T. spiralis было проведено в Центре геномного сек-венирования (Вашингтон, США), и его результаты опубликованы апреле 2006 г. в NSBI.
В отличие от других нематод гены T. spiralis не содержат ассоциированных сплайс-лидерных участков (SL), функции которых связаны с экс-
Российский паразитологический журнал, 2008, №
прессией генов и оперонов, поэтому их отсутствие у трихинелл требует дополнительных исследований [33, 26].
Известно, что внехромосомная наследственность эукариотических организмов (Metazoa) связана с митохондриями. Типичная митохондри-альная ДНК представляет собой кольцевую молекулу длинной 14-18 кб, содержащую 37 генов, 13 из которых кодируют белки, 2 - рибосомальные РНК и 22 - транспортные РНК.
В классе Nematoda последовательность мРНК (ESTs) исследована у Ascaris suum, Caenorabditis elegans [32], Meloidogyne javanica [31] и T. spiralis [17].
Наличие полиморфизма является причиной вариации митохондриаль-ного генома T. spiralis в пределах 2124 кб [17], который не содержит повторяющихся олигонуклеотидных участков и кодирует 36 белков.
У T. spiralis выявлено и охарактеризовано около 164 белков, которые в зависимости от выполняемых ими функций в организме животного можно сгруппировать следующим образом:
1. Белки-энзимы: НАДН-дегид-рогеназа, цитохром-С-оксидаза, АТФ-син-тетаза, серин-протеаза, ДНКаза, энолаза и др. ;
2. Белки теплового шока (Heat Shock Proteins- HsPs);
3. Структурные белки (трополи-зин, 45 kDa Hg, 53 E/s Ag, P49Ag).
Большой интерес представляет группа шоковых белков, синтез которых резко усиливается в клетках, подверженных стрессу [20, 21]. В зависимости от выполняемых ими функций их можно разделить на две группы по принадлежности к той или иной груп-2 2
пе экстремальных факторов, индуцирующих их синтез (белки теплового и холодового стресса). Термин «Heat Shock» означает повышенную индукцию протеинов в условиях гипертермии [38], однако механизм, ответственный за активацию соответствующих генов, является чувствительным к большому числу других стрессов (воспаление, оксидативный стресс, отсутствие глюкозы, влияние тяжелых металлов) [41]. Подверженные холоду клетки могут либо ингибировать синтез белков теплового шока, либо активировать синтез белков холодового шока. В отличие от белков теплового шока (Hsps) в нормальных условиях редко обнаруживают экспрессию белков холодового шока (Csps) [5], которые выполняют роль протектора в условиях низких температур. Показательно, что T. nativa сохраняют свою жизнеспособность при температуре -20 °C около двух лет.
У T. spiralis обнаружен белок 50 kDa Csps, выделенный из личинок паразита. Подобные белки установлены и у других видов трихинелл - T. nativa и T. nelsoni [21]. Были изолированы три белка термического шока - HsP60, HsP70 и HsP90, являющиеся мишенью для гуморального иммунного ответа хозяина [20].
Научный интерес вызывает и многочисленная группа других белков T. spiralis (антигены, детерминанты, экскреторно-секреторные продукты паразита иммуногенного характера, поверхностные и структурные белки и др.). Антиген gp53 TSh-1 исследован в сравнительном аспекте у T. spiralis, T. britovi и T. pseudospiralis, при этом установлены значительные различия в аминокислотных и нуклеотидных последовательностях [35].
Интересна физиология личинок и половозрелых особей, паразитирующих в двух различных средах (кишечном эпителии и поперечно-полосатых мышечных клетках) [3]. В клетках хозяина трихинеллы вызывают многочисленные изменения, возможно, связанные с личиночными экстреторно-секреторными белками, причем роль паразита в этих процессах пока слабо изучена [18].
Путем анализа EST-данных T. spiralis установлено большое число гомологов, принимающих участие в синтезе уникальных гликанов трихинелл [1] и ингибиторов протеиназ, осуществляющих или модулирующих протеолитические функции и способствующие миграции личинок паразита в тканях хозяина.
Современные исследования направлены на идентификацию белков, принимающих участие в контактной зоне паразита и хозяина и обеспечивающих выживание паразита [39, 40].
Исследование липид-связываю-щих белков (ЛСБ) нематод, в частности трихинелл, является важным направлением в изучении молекулярно-биохимических процессов, раскрывающих тонкие механизмы паразито-хозяинных взаимоотношений. ЛСБ увеличивают растворимость гидрофобных лигандов, обеспечивая их вне-и внутриклеточный транспорт [47-49]. Эта группа объединяет белки, связывающие жирные кислоты, ретинол и ретиноевую кислоту [29, 30]. В эту группу входят также белки, связывающие КоА-производные.
Высокомолекулярные жирные кислоты играют основную роль в структуре биологических мембран, являются источником энергии для клеток [4, 7]. Их значение для гомео-
2 3
стаза клетки предусматривает наличие эффективной транспортной системы в метаболизме организма [4]. Центральное место в этой системе занимают ЛСБ.
Липид-связывающие и липид-переносящие белки образуют две основные группы. Первая из них - ли-пид-связывающие белки, переносящие липофильные молекулы в жидкостях организма. В зависимости от их локализации они подразделены на две подгруппы - внеклеточные белки крови и гемолимфы (сывороточный альбумин ~60 kDa, липокалины ~ 20, трансвер-тин - ретинол связывающие белки ~ 20 kDa) и внутриклеточные белки (относительно мелкие ~14 kDa цитоплаз-матические белки), связанные с внутриклеточным транспортом жирных кислот, ретинола и ретиноевой кислоты. К этой группе относят ацил-КоА связывающие белки. Вторая основная группа ЛСБ состоит из белков, переносящих липофильные компоненты через мембрану клетки (мембраннос-вязанные). К этой группе относят аль-бумин-связывающий белок, цитоплаз-матические БСЖК, белки, транспортирующие жирные кислоты, ЖК-транслоказу [4].
Растворимые липид-связывающие белки-переносчики существуют в разнообразных формах, некоторые, возможно, являются идентичными для всех животных видов. Возможно, некоторые из них встречаются только в определенной группе животных [7, 12].
Среди нематод, как и среди других животных, известно большое количество ЛСБ. У паразитических нематод описаны две новые группы ЛСБ, являющиеся функциональными аналогами ЛСБ других организмов, но
уникальные по своей структуре и локализации. В первую группу входят полипротеиновые аллергены НПА. Это преимущественно низкомолекулярные а-спиральные кислые белки размером ~ 15 kDa. Их обнаруживают как в соматических тканях, так и в экскреторно-секреторных продуктах [25]. Свойства этих белков исследованы у Ascaris suum, A. lumbricoides, Ascaridia galli, Brugia malay, B. pahangi, Dictyocaulus viviparus и Toxocara canis. Являясь потенциальными аллергенами, многие из них обладают выраженными антигенными свойствами [11,13-15, 27, 45]. Вторая группа состоит из белков ß-спи-ральной структуры. В функциональном отношении их сродство c рети-ноидами больше, чем с жирными кислотами. Их называют FAR-протеины [6, 42] . Эти белки исследованы у A. suum, Onchocerca volvulus, B. malay и Globodera pallid [23, 24]. Наиболее подробно белок такого типа исследован у C. elegans [6]. Все FAR-белки имеют размер около 20 kDa, содержат сигнальный пептид и не имеют консервативных участков [36]. Обе группы белков являются предметом интенсивного исследования не только с точки чисто теоретического интереса, но и как потенциальные места для атаки химиотерапевтическими средствами [23].
Ранее нами получен и охарактеризован новый тип белка 55 kDa Ag-lbp-55 из A. galli, гомология которого с белками других нематод и организмов не была обнаружена [10]. В литературе отсутствуют данные о наличии подобных белков у T. spiralis. В связи с этим, целью настоящего исследования стал анализ структуры и функции нового типа белка P-45kDa, а также
2 4
определение его роли во взаимоотношениях системы «гельминт-хозяин».
Материалы и методы
В опытах были использованы личинки T. spiralis (T1ISS03), предоставленные проф. E. Pozio (Национальный референтный центр по трихинеллезу, Италия).
Выделение и очистку белковых фракций личинок трихинелл проводили ионнообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе, дополнительное фракционирование - методом гель-фильтрации на хроматографической системе UltraglAcA44, очистку натив-ного белка - Ni-NTA методом аффинной хро-матографии.
Выделение паразитарной РНК, синтез одноцепочечной ДНК, комплементарной изолированной мРНК (кДНК), клонирование амплифициро-ванной кДНК, включение в плазмид-ный вектор, трансформацию компетентных клеток, выделение плазмид-ной ДНК, секвенирование клонированных фрагментов, RACE-ампли-фикацию 5Ли 3Лконцов ДНК (Rapid amplification of DNA ends) проводили общепринятыми методами (First-Choice™RLM-RACE Kit-Ambion).
MALDI-TOF-анализ проведен согласно методам Stone [44] и Clos [2] на масспектрометре VoyagerSpec. Полученные результаты подвергнуты анализу согласно программы Peptide-Mass (us.expasy.org/tools) по методу Peptide-MassFingerprint. Полученные пептидные профили проверены на наличие гомологии с другими белками с использованием базы данных софтуера MASCOT [34].
Метод кругового дихроизма (CD) осуществляли на дихрографе Jasco
Model 715 в 10mM Tris-буфере (H7.5) при 20 °C. Полученные результаты обра-батывали при помощи компьютерных программ CONTIN и SELCON [37].
Нуклеотидную и аминокислотную последовательности белка P-45kDa анализировали соответствующими BLAST-программами (Altschul et al.,1990), скаченными с сайтов http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ и http://www.ebi.ac.uk/sercices/.
Аминокислотную последовательность P-45kDa сравнивали с последовательностями других ЛСБ при помощи программы ClustalW (Higgins et al.,1994)
(http://searchlancher.bcm.tmc.edu/).
Потенциальные консервативные домены в молекуле P-45kDa предсказали, применив программы SMART (Letunic et al.,2004) и Inter Pro Scan (Mulder et al., 2005) (http: //www/expasy .org/).
Анализ первичной структуры и определение возможной вторичной структуры P-45kDa проводили с помощью программы ExPaSy (http: //www/expasy .org/).
Определение молекулярной массы и возможной изоэлектрической точки белка проведено при помощи программы ProtParm. Теоретические расчеты вторичной структуры сделаны с использованием программ GORIV и Ipred (Garmier et al.,1996; Cuff et al.,2000).
Количественный анализ белковых фракций проводили методом Брад-форда.
Результаты и обсуждение
Белок P-45kDa, выделенный из мышечных личинок T. spiralis, подвергнут очистке и охарактеризован.
2 5
Процесс очистки растворимых белковых фракций, полученных после диализа, включал гомогенизацию, ультрацентрифугирование при 105 000 g и осаждение сернокислым аммонием до 70%-ного насыщения. Очистку супер-натанта проводили при помощи анио-нообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе и гельфильтрации на Se-phadex G-75 (рис.1).
Исходная цитозольная фракция и ее производные проанализированы методом электрофореза в геле. Определяли концентрация неадсорбиро-
ванных (washing) и адсорбированных (elution) фракций. Как видно из приведенного рисунка, был выделен предполагаемый липид-связывающий белок с приблизительной молекулярной массой 48 kDa. В дальнейшем методом масс-спектроскопии определили молекулярную массу белка, равную 48,14 kDa.
Окончательную очистку белка проводили с использованием аффинной хроматографии на никелевых носителях (Ni-NTA chromatography) (рис. 2).
Рис.1. А - гельфильтрация на Сефадексе G75 двух белковых фракций (washing and elution) после хроматографии цитозольной фракции на ДЕАЕ-целлюлозе; Б - электрофореграмма белков в ПААГ после гельфильрации; В электрофореграмма в ПААГ фракций, содержащих белок
p45kDa
О
GO
Л
4 о
со О
н
5
Я
о
и о ч
(U
ю
35 3 к ю К
£ к
CÖ
К
К К
eö &
О £ S о
CP
* <
g Н
§ *
§ g
й о
оЗ и
о
о
^
lg
(U
Q
Л CP
(U
и
CP
сЗ
175 83 62 47,5
32,5 25
Рис.2. Электрофорез в ПААГ цитозольных белков личинок трихинелл после фракционирования сернокислым аммонием, очистки Ni-NTA агарозой и деглико-
зилирования гликозидазой F
Выявлена неспецифическая связь P-45kDa с флуоресцирующим липидным аналогом ДАУДА. Этот результат находит свое объяснение в осуществлении связи ДАУДА с внешними гидрофобными структурами белка. Это означает, что P-45kDa принадлежит к группе липид-связывающих белков.
Результаты переваривания трипсином показали, что нативный Р-45Ша белок посттрансляционно модифицирован и ^гликолизирован вероятнее всего в четырех местах.
Исследования вторичной структуры выделенного белка с использованием метода кругового дихроизма показали, что последний состоит преимущественно из 44,4% Р-глобуляр-ных спиральных структур.
На основе N-конечной последовательности (LPG(L)GGWTVLQEVVK) фрагменты T. spiralis (pc20c06.y4 и pc32b04.y1) были идентифицированы EST-базой данных. Поскольку белок содержал два гомологичных домена (рис. 3), то оказалось невозможным проведение обычной полимеразной реакции.
SP
Domain 1
Domain 2
./ GWTVL QE VVKC'
■C_C
C ghC SFKTR^C
с
СССР ГС Г Г
^^/GH^^/ SFKTR^^/RTRPKKEG^^/YPFDGEREI^^/HEHGDI^^/ TIAKLPGXG^^/ GNTVLQEVVKC\^
^^CYPFDGEREI^CHEHGDI^CTXAKepgig^CGWTVEQEVVKQ^CLSRPDIPEYMRAGYKKLFHMLPKGH^CIEKDNQ^CK^C^C^CGDYEPNEDGTE^C :^Ciekdnc^CK^C^C^CgDYEPNEDGTE^CVKCCDHC^CAPFNEPGDWSE^CLWFPLADMFKKVCSH^C
Рис. 3. Возможная роль цистеина и гистидина белка P-45kDa в связывании металлов Российский паразитологический жур нал, 2008, № 2 7
Рис. 4. Структура Ts45kDa-mRNA
Нуклеотидные последовательности содержат 5Ли 3Л некодирующие участки (рис. 4). Транскрипция имеет единичную открытую рамку считывания, транслирующую 424 аминокислоты, которые составляют полную цепь исследуемого белка. Анализ аминокислотной последовательности не обнаружил идентичности с другими известными белками, за исключением EST-фрагментов, родственных трихинеллам протеинов Тг1еИиг18.
Полагаем, что уникальный участок ДНК паразита может найти применение в практике в качестве ДНК-диагностикумов трихинеллеза и быть использован для видовой дифференциации трихинелл. Олигонуклеотид-ная последовательность содержит два потенциальных ^гликозирующих участка. Очищенный белок содержит два высокогомологичных домена, которые могут быть включены в металл-связывающие участки последнего. С-терминальный участок, содержащий гистидиновые последовательности, был использован для очистки натив-ного P-45kDa при помощи М-ЫТА.
Определена нуклеотидная и аминокислотная последовательности кодирующей рамки считывания гена Р-45kDa. Его нуклеотидная последова-
тельность содержит более 2300 п.н. К сожалению, некодирующий участок после рамки считывания пока еще не изучен в деталях.
Содержание цистеина, его распределение в P-45kDa, наличие поли-гистидинового конца и 37 цистеино-вых остатков, по всей вероятности, и определяют металл-связывающие свойства изучаемого белка.
Необходимо в дальнейшем необходимо провести полную характеристику выделенного белка P-45kDa. С этой целью нужно получить рекомби-нантный белок с использованием экс-прессирующего вектора pJC20 и очистить его в достаточных количествах с применением Ni-NTA-технологий (QIAGEN - Protocols). Кроме того, необходимо определить способность P-45kDa связывать различные металлы, получить поликлональные антитела против исследуемого белка и использовать их в иммуно-гистохимических препаратах для определения клеточной и тканевой локализации белка паразита. Желательно также оценить уровень экспрессии P-45kDa на разных стадиях развития паразита.
Определение полной нуклеотид-ной последовательности кДНК P-45kDa в ее некодирующем участке
поможет уточнить структуру гена. Это позволит выяснить возможные транскрипционные изменения видов, используя полимеразную цепную реакцию, секвенирование генов и имму-ноблотинг цитозольных белковых
фракций. Также необходимо подобрать специфические олигонуклеотид-ные праймеры для полимеразной цепной реакции и определить их пригодность для видовой дифференциации трихинелл.
Литература
1. Appleton J.A., Romaris F. // Vet. Parasitol. - 2001. - V.101. - P. 49-60.
2. Clos J., Westwood J.T., Becker P.B. et al. // Cell. - 1990. - V. 63. - P. 10851097.
3. Despommier D.D. // Parasitol. Today .- 1998. - V. 14. - P. 318-23.
4. Dutta-Roy A.K. // Cell. Mol. Life Sci. - 2000. - V. 57. - P.1360-1372.
5. Etchegaray J.P., Inouye M. // J. Bacteriol. - 1999. - V. 181. - P.1827-1830.
6. Garofalo A., Rowlinson M.C., Ngwa A. et al. // J. Biol. Chem. - 2003. - V. 8.
- P. 8065-8074.
7. Glatz J.F., Luiken J.J., Bonen A. // Mol. Neurosci. - 2001. - V. 2. - P. 123132.
8. Harmon C.M., Luce P., Beth A.H., AbumradN.A. // J. Membr. Biol. - 1991. -V. 121. - P. 261-268.
9. International Commission on Trichinellosis (2004) in San Diego (USA).
10. Jordanova R., Radoslavov G., Deevska G. et al. // Comptes Rendus de l'Academie Bulgare des Sciences .- 2005. - V. 58. - P.18.
11. KennedyM.W. // Biochem. Biophys. Acta. - 2000. - V. 476. - P. 149-164.
12. Kennedy M.W. // Molecular Biology, Biochemistry and Immunology.-2001.
- (Kennedy M.W. and Harnett W., eds), pp.309-330, CABI Publishing.
13. Kennedy M.W., Brass A., McCruden A.B. et al. // Biochem. - 1995. - V. 34.
- P. 6700-6710.
14. Kennedy M.W., Allen J.E., Wright A.S. et al. // Mol. Biochem. Parasitol. -1995. - V. 71. - P. 41-50.
15. Kennedy M.W., Britton С., Price N.C. et al. // J. Biol. Chem. - 1995. -V. 270. - P. 19277-19281.
16. Kurdova R., Muller N, Tsvetkova L. et al. // Vet. Parasitol. - 1995. - V. 123.
- P. 179-188.
17. LavrovD.V, Brown W.M. // Genetics. - 2001. - V. 157. - P. 621-637.
18. LeungR.K., KoR.C. // J. Helminthol. - 1997. - V. 71. - P. 113-118.
19. Levi A.J., Gatmaitan Z., Arias I.M. // J. Clin. Inves. - 1969. - V. 48. -P. 2156-2167.
20. Martinez J., Perez-Serrano J., Bemadina W.E., Rodriguez-Caabeiro F.// Parasitol. Res. - 2001. - V. 87. - P. 453-458.
21. Martinez J., Perez-Serrano J., Bernadina W.E., Rodriguez-Caabeiro F. // Cryobiology. - 2001. - V. 43. - P. 293-302.
22. Maurer-Stroh S., Washietl S., Frank E. // Biol. Chem. - 2003. - V. 384. - P. 977-989.
23. McDermott L, Cooper A., Kennedy M.W. // Mol. Cell. Biochem. - 1999. -V.192. - P. 69-75.
24. McDermott L., Moore J, Brass A. et al. // Biochem. J. - 2001. - V. 356. -P. 387-394.
25. McDermott L., Kennedy M.W., McManus D.P. et al. // Trends Parasitol. -2001. - V. 17. - P. 471-475.
26. Mitreva M., Jasmer D.P., Appleton J. et al. // Mol. Biochem. Parasitol. -2004. - V. 137. - P. 277-291.
27. Moore J., McDermott L., Price N.C. et al. // Biochem. J. - 1999. - V. 340. -P. 337-343.
28. Murrell K.D., Lichtenfels R.J., Zarlenga D.S., Pozio E. // Vet/ Parasitol. -2000. - V. 93. - P. 293-307.
29. Newcomer M.E. // Structure. - 2000. - V. 1. - P. 7-18.
30. Noy N. // Biochem. J. - 2000. - V. 348. - P. 481-495.
31. Okimoto R., Chamberlin H.M., Macfarlane J.L., Wolstenholme D.R. // Nucleic Acids Res. - 1991. - V.11. - P. 1619-1626.
32. Okimoto R., Macfarlane J.L., Clary D.O., Wolstenholme D.R. // Genetics. -1992. - V. 130. - P.471-498.
33. Parkinson J., Mitreva M., Hall N. et al. // Trends Parasitol. - 2004. - V. 4922. - P. 132-136.
34. Perkins D.N., Pappin D.J., Creasy D.M., Cottrell J.S. // Electrophoresis. -
1999. - V. 20. - P. 3551-3567.
35. Peterguer M.J., Rodrigez E., Romaris F. et al. // Mol. Immunol. - 2004. - V. 41. - P. 421-433.
36. Prior A., Jones J.T., Blok V.C. et al. // Mol. Biochem. Parasitol. - 2001. -V. 4. - P. 1-10.
37. Provencher S.W. // CONTIN: Comput. Phys. Commun. - 1982. - V. 27. -P. 229-235.
38. Ritossa F.M. // Experientia. - 1962. - V. 18. - P. 571-573.
39. Robinson M.W., Connolly B. // Proteomics. - 2005. - V. 5. - P. 4525- 4532.
40. Robinson M.W., Greig R., Beattie K.A. et al. // Int. J. Parasitol. - 2006. - pub ahead of print].
41. Schlesinger M.J. // J. Biol. Chem. - 1990. - V. 65. - P. 12111-12114.
42. Solovyova A.S., Meenan N., McDermott L. et al. // Eur. Biophys. J. - 2003. -V. 32. - P. 465-476.
43. Sreter T., Szell Z., Marucci G. et al. // Vet. Parasitol. - 2003. - V. 115. - P. 329-334.
44. Stone K.L., Williams K.R. // J. Chromatogr. - 1986. - V. 359. - P. 205-212.
45. Timanova A., Mueller S., Marti T. et al. // Eur. J. Biochem. - 1999. - V. 261. - P. 569- 576.
46. Trigatti B.L., Mangroo D., Gerber G.E. // J. Biol. Chem. - 1991. - V. 266, N 33. - P. 22621-22625.
47. Veerkamp J.H., Van Moerkerk H.T., Zimmerman A.W. // Eur. J. Biochem. -
2000. - V. 267. - P. 5959-5966.
48. Weisiger R.A. // Hepatology. - 1996. - V. 24. - P. 1288-1295.
49. Yeh S.R., Ropson I.J., Rousseau D.L. // Biochem. - 2001. - V. 40. - P. 42054210.
New type of lipid-connecting protein P-45KdA from nematode Trichinella spiralis
G. Radoslavov, I. Bankov, A.V. Uspensky, I.I. Benediktov
The new type of lipide-bindind protein P-45kDa is isolated, cleared with chromatography and gelfiltration on Sephadex G-75 and characterized from larvae Trichinella spiralis. P-45kDa is consists of mainly ß- globular structures. The molecular weight of protein - 48,14 kDa was determined by the method of mass-spectroscopy. P-45kDa can be used for specific differentiation of Trichinella spp. and as DNA-diagnostic.
