CC BY
339
НОВЫЙ СПОСОБ КОНСЕРВАЦИИ БИОМАТЕРИАЛА
О.О.Зайцева, С.П.Ашихмин,О.Б.Жданова1, П.Г.Распутин, А.А.Грухин
Кировская государственная медицинская академия, г. Киров 1Вятская государственная сельскохозяйственная академия, г. Киров
5
s-я su а.
-е-
к
Si
Потребность сохранения биомассы после смерти диктуется многообразными потребностями. В биологии в настоящее время выделяют восемь уровней: молекулярный, клеточный, тканевой, органный, организменный, попу-ляционный, биогеоценотический и биосферный (Илларионов, 2001). Изучение первых пяти уровней предполагает не только прижизненные, но и по-стмортальные исследования, а также сохранение биологических объектов в музеях и на кафедрах учебных заведений биологического профиля. Известно, что после наступления биологической смерти начинаются естественные процессы разложения мягких тканей, которые протекают по типу ранних и поздних трупных изменений. Различные способы консервации известны с давних времен (Привес, 1956; Привес и др., 1966). В Древнем Риме профессиональные бальзамировщики натирали тело умершего кедровым маслом, солью и медом, которые, по словам Плиния, «на века сохраняют тела умерших нетронутыми тлением». Древние персы, сирийцы и вавилоняне погружали мертвых в кувшины с медом и воском. Методы бальзамирования, использовавшиеся древними египтянами, всегда включали натриевую соду, смолу деревьев и битум. В арабском способе бальзамирования тело умершего натирали порошком, состоящим из ароматических веществ, квасцов и соли, после чего тело обертывали спа-родрапом, пропитанным воском и терпентином (Кузнецов и др., 1999).
В начале XVIII столетия в России был создан первый естественнонаучный музей, так называемая кунсткамера (Вишневский, Жиров, 1934). Для консервации экспонируемых препаратов употребляли спирт, настоянный на черном перце и разбавленный до 750. На протяжении всего XIX века было предложено множество различных способов, основанных на бальзамировании сулемой, мышьяком, хлористым цинком, глицерином, карболовой кислотой.
В 90-х годах XIX века в практику консервации анатомических объектов был введен формалин, представляющий собой 37%-ный водный раствор формальдегида СН2О. Формалин быстро получил всеобщее признание и широко используется до нашего времени (Уокер, 1957). Это стало возможным благодаря его бактерицидной активности, относительной дешевизне и удобству хранения и транспортировки. Однако формалину присущ ряд негативных качеств, отражающихся на организме работающих с ним людей (Бек-темирова, Меркурьева, 1990). Он, ток-
сичен, так как угнетает обмен веществ, в первую очередь витамина С, инакти-вирует ферменты в органах и тканях; формалин кроме того летуч, имеет резкий запах, пары которого вызывают раздражение и сухость слизистых оболочек. Он обладает мутагенным свойством, так как при взаимодействии с концевой - NH2 группой белков происходит реакция, которая приводит к изменению вторичной, третичной и четвертичной структуры белка. При наличии адекватной реакции иммунной системы появляются аутоантитела, что ведет к ал-лергизации организма. Биологические объекты, зафиксированные формалином, значительно теряют эластичность и меняют прижизненную окраску из-за перехода гемоглобина крови в метгемоглобин. Длительное хранение в растворе формалина вызывает на фиксируемых органах появление плесени. Содержание примесей в формалине также накладывает определенные ограничения в выборе методик фиксации биологического материала и обусловливает необходимость соблюдения целого ряда мер безопасности при работе с данными веществами. Формалин следует хранить в защищенных от света коричневых стеклянных емкостях и при температуре не ниже 90С, иначе постепенно образуется белый осадок.
Другим часто используемым консервирующим средством в настоящее время является 40-70%-ный спирт, обладающий хорошим бактерицидным действием и сохраняющий естественный цвет тканей и органов. Спирт относится к дорогостоящим консервантам и нередко используется не по назначению.
В 1996 г., спустя 128 лет после открытия формалина, стали применять тром-болитик COMPLICAD, который обладает огромным восстанавливающим действием на трупы, находящиеся в сильной стадии гнилостного разложения. Он полностью исключает применение формалина, превосходит по своим действиям его 10%-ный раствор, повышает качество биологического материала, является экологически чистым продуктом, но авторы не раскрывают его состав и поэтому COMPLICAD не может быть использован нами на данном этапе.
В последнее время активно, особенно в Германии, используется метод пластинации для предохранения скоропортящихся биологических образцов, особенно таких мягких, как сердце, печень, легкие, почки и мозг. Для пластинации используется полимерная смола под общим названием БИОДАР, а сам метод выполняется в несколько этапов: фиксация, дегидратация, форсированное пропитывание и консервация. Пластинация не исключает применение формальдегида и требует специального технического оборудования.
С нашей точки зрения оптимальное сохранение трупного материала должен обеспечить консервант, обладающий способностью ингибировать ферментативную активность протеаз не только клеток консервируемых объектов для предотвращения аутолиза, но и ферментных систем микроорганизмов для предупреждения бактериальной инвазии. С такой точки зрения появляется неочевидный путь её решения - ингибирование ферментных систем микроорганизмов и самих ферментов при помощи катионов тяжелых металлов, таких, как Hg, Cu и т. д., либо анионов, например, с использованием цианидов, азидов. Сущность предлагаемой разработки состоит в том, что в качестве фиксатора предлагается использовать водный раствор солей и катионов I группы главной подгруппы периодической системы Менделеева (NaN3, KN3, RbN3, CsN3). Водные растворы азидов абсолютно не летучи, минимально токсичны, дешевы, обладают высокой антибактериальной способностью (Нени-цеску, 1968), сохраняют прижизненную структуру и окраску фиксированных органов. Использование этих препаратов в качестве фиксаторов ранее отмечено не было. Цель исследования: изучение бактерицидного действия азид-ных производных в сравнении с другими фиксаторами биологических тканей.
Исследовали материал некоторых органов человека, животных, смерть которых наступила не более суток назад. При консервации использовали следующие растворы: 10%-ный формалин, физиологический раствор с содержанием Cu+2, физиологический раствор с содержанием Cr+3, физиологический раствор с содержанием Hg+2, физиологический раствор с содержанием азидных производных в следующем процентном содержании: 0,05%, 0,1%, 0,3% и 0,5% растворы. При оценке качества консервации учитывались изменения консистенции, прочности и цвета тканей, гистологической структуры, рост микроорганизмов в консерванте. Сроки консервации в данных растворах - 30, 60, 90 и 120 дней без замены растворов. Окончательные сроки консервации не определены.
Результаты сравнительного анализа приведены в таблице, свойства оценивались как нормальные и недостаточные.
Se а о, i
о
к £
к
к
О i
« §
8.
а
I
1 «
с
§
Таблица
Сравнительная оценка эффективности растворов с содержанием азидных производных различной концентрации
Критерии Концентрация фиксирующего раствора, в %%
0,05 0,1 0,3 0,5
Сохранность структуры Нормальная Нормальная Нормальная Нормальная
Сохранность цвета Недостаточная Недостаточная Нормальная Нормальная
Сохранность консистенции Нормальная Нормальная Нормальная Нормальная
<8
I !?
Л
¡1
Й Л
ж
¡5
а,
£
Из анализа таблицы можно сделать следующее заключение. Растворы с концентрацией 0,05% и 0,1% не обеспечивают удовлетворительной фиксации биоматериала. Наиболее оптимальными следует считать 0,3%- и 0,5%-ные растворы.
Органы из 10%-ного раствора нейтрального формалина значительно изменили прижизненный цвет ткани из-за перехода гемоглобина крови в мет-гемоглобин; имели очень плотную консистенцию из-за наличия дубящих свойств раствора; при механическом воздействии ткань крошилась.
Органы из раствора, содержащего Си2+, имели плотную консистенцию, грязно-серый цвет с голубым оттенком, умеренную прочность при механическом воздействии уже на седьмой день фиксации. Через 120 дней других изменений с органами не произошло.
Органы из раствора, содержащего СГ3, имели плотную консистенцию, серо-фиолетовую окраску, непрочность при механическом воздействии. На поверхности раствора наблюдали рост плесени на 14-й день, которая сохранялась и на более поздних сроках фиксации. Органы незначительно уменьшились в размерах.
Органы из раствора, содержащего Нд+2, имели обычную плотность, бледно-коричневую окраску с розовым оттенком, на поверхности раствора наблюдали рост плесени на 14-й день. Через 40 дней плесень практически отсутствовала, но раствор оставался мутным и через 3 месяца фиксации.
В то же время проводили гистологическое исследование. После промывки обезвоженные кусочки ткани заливали в парафин. Срезы после депа-рафинизации окрашивали гематоксилином и эозином. Фиксация в водных растворах предлагаемых солей сохраняла структуру препаратов и тинктари-альные свойства гистологических препаратов: ядра прокрашивались базо-фильно, цитоплазма оксифильно, четко выявлялась плазмолемма. Аналогичное качество в сохранности структуры и интенсивности окраски наблюдалось в препаратах, приготовленных после
фиксации в формалине. Таким образом, можно говорить о высокой способности предложенных фиксаторов сохранять прижизненную морфологию органа и нашу методику.
Проводили микробиологический посев раститрованных стандартных культур кишечной палочки Е.ооН, протея и золотистого стафилококка в контрольном и опытных растворах (по 4,5 мл). Применяли среды Эндо, Плоскирева, ЖСА, скошенный агар МПА, помещали в термостат на 12 часов при температуре 370С. Результаты оценивали ежедневно. Рост колониеобразующих бактерий не наблюдали в малых и средних разведениях. В разведениях от 102 до 105 в контрольном растворе (стерильный физиологический раствор) рост колониеобразующих бактерий (кишечной палочки) преобладает в десятки и сотни раз над ростом этих же бактерий в опытном растворе (0,5%-ном растворе предлагаемых солей). Таким образом, наиболее ярко наличие дезинфицирующих и антибактериальных способностей азидных производных подтвердилось в 0,5%-ном растворе.
В результате проведенных исследований установлено, что азидные производные обладают достаточными дезинфицирующими и антибактериальными свойствами, обусловленными взаимодействием анионов и катионов тяжелых металлов на кофакторы ферментов протеаз клеток микроорганизмов с образованием устойчивых комплексов. Противомикробное же действие формалина объясняется тем, что он присоединяется к аминогруппам белков и вызывает их денатурацию. Кроме этого, растворы азидных производных не летучи, при непосредственном контакте с кожей рук не оказывают дубящего эффекта в отличие от формалина. Кроме того, азидные производные могут транспортироваться в сухом виде.
Следовательно, полученные данные позволяют рекомендовать растворы азидов в качестве наиболее эффективных консервантов биологического материала и менее опасных для здоровья человека. Предлагаемые растворы могут использоваться для бальзамирования трупов редких животных, для хранения учебных и музейных препаратов, на кафедрах зоологии, нормальной и патологической анатомии. Вполне оправданы также исследования по применению данного способа консервации для выделки шкур. На сегодняшний день цена 1 литра раствора солей и катионов I группы главной подгруппы периодической системы Менделеева в 17-18 раз дешевле, чем цена 1 литра 37%-ного формальдегида; в 27-28 раз дешевле, чем цена 1 литра 70%-ного спирта и в 100 раз дешевле, чем цена 1 литра глицерина.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Бектемирова Р. М., Меркурьева Р. В. 1990. Отдаленные эффекты формальдегида // Гигиена и санитария. №4. С. 36-39.
Вишневский Б. Н., Жиров Е. В. 1934. Анатомические коллекции кунсткамеры. - Л.
Илларионов В.Е. 2001. Современные основы естествознания. 189 с.
Кузнецов Л. Е., Хохлов В. В., Фадеев С. П., Шигеев В. Б. 1999. Бальзамирование и реставрация трупов: Руководство. - М. 496 с.
Неницеску К. 1968. Общая химия. - М.: «Мир».
Привес М. Г. 1956. Методы консервации анатомических препаратов. - Л.: Медгиз. 50 с.
Привес М. Г., Гильбо И. С., Крылова В. М. 1966. О дальнейшем развитии метода консервирования анатомических препаратов для открытого хранения в естественном виде (техника консервирования целого трупа) // Арх. анат. №9. С. 99.
Уокер Д.Ф. 1957. Формальдегид. - М.: ГСНТИ. 608 с.
